Luận án nghiên cứu vi khuẩn E. coli, Salmonella gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc

Nghiên cứu vai trò của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị.

• Tác giả: Trần Đức Hạnh
• Người hướng dẫn: GS. Nguyễn Quang Tuyên
• Trường học: Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học thú y
• Đề tài: Nghiên cứu vai trò của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ nông nghiệp
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
• MỤC LỤC
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. MỘT SỐ NGUYÊN NHÂN VÀ HIỂU BIẾT CHUNG VỀ HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY Ở LỢN
• 1.2. Rối loạn tiêu hóa do môi trường ngoại cảnh bất lợi
• 1.3. Rối loạn tiêu hoá do thức ăn, nước uống không đảm bảo
• 1.4. Một số vi sinh vật gây tiêu chảy gia súc
• 1.5. Vai trò của một số vi khuẩn trong hội chứng tiêu chảy ở lợn
• 1.6. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli)
• 1.7. Vi khuẩn Salmonella spp. trong hội chứng tiêu chảy ở lợn
• 1.8. Vai trò của vi khuẩn đường ruột Clostridium Perfringens (Cl. Perfringens) trong hội chứng tiêu chảy ở gia súc
• 1.9. Biện pháp phòng trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con do vi khuẩn gây ra
• 1.9.1. Biện pháp phòng
• 1.9.2. Điều trị tiêu chảy ở lợn
• 2. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nội dung nghiên cứu
• 2.2. Nghiên cứu tình hình tiêu chảy ở lợn con tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc
• 2.3. Phân lập, xác định 3 loại vi khuẩn là E. coli, Salmonella spp., perfringens ở lợn con bình thường và bị tiêu chảy
• 2.4. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 2.5. Nghiên cứu một số biện pháp phòng và trị hội chứng tiêu chảy ở lợn
• 2.6. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
• 2.7. Đối tượng nghiên cứu
• 2.8. Địa điểm nghiên cứu
• 2.9. Phương pháp nghiên cứu
• 2.9.1. Phương pháp điều tra
• 2.9.2. Phương pháp lấy mẫu và phân lập vi khuẩn
• 2.9.3. Nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi khuẩn
• 2.9.4. Phương pháp xác định type kháng nguyên của vi khuẩn phân lập được
• 2.9.5. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được
• 2.9.6. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được
• 2.9.7. Phương pháp chế tạo autovacxin vô hoạt có bổ trợ keo phèn
• 2.9.8. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả điều tra lợn con dưới hai tháng tuổi mắc tiêu chảy tại các tỉnh nghiên cứu
• 3.2. Kết quả điều tra tỷ lệ lợn con bị tiêu chảy và chết ở các lứa tuổi
• 3.3. Kết quả xác định số lượng vi khuẩn đường ruột ở lợn con
• 3.4. Kết quả xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí, Salmonella spp., coli ở lợn con
• 3.5. Kết quả xác định số lượng vi khuẩn yếm khí và Cl. perfringens ở lợn con
• 3.6. Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli, Salmonella spp., perfringens ở lợn con
• 3.7. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.8. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. coli
• 3.9. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Salmonella spp.
• 3.10. Kết quả xác định một số đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn Cl.
• 3.11. Kết quả xác định type của các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella spp., perfringens phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.12. Kết quả xác định type của các chủng vi khuẩn E. coli
• 3.13. Kết quả xác định type của các chủng vi khuẩn Salmonella spp.
• 3.14. Kết quả xác định type của các chủng vi khuẩn Cl.
• 3.15. Kết quả xác định khả năng dung huyết của các chủng E. coli phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.16. Kết quả xác định kháng nguyên bám dính của E. coli và Salmonella spp. phân lập được từ lợn con tiêu chảy
• 3.17. Kết quả xác định độc lực và độc tố của các chủng vi khuẩn phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.18. Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được
• 3.19. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng E. coli trên chuột bạch
• 3.20. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn Salmonella spp. trên chuột bạch
• 3.21. Kết quả xác định độc tố của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.22. Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng vi khuẩn Cl. perfringens trên chuột bạch
• 3.23. Kết quả xác định độc tố đường ruột của các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập được ở lợn con tiêu chảy
• 3.24. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng E. coli phân lập được
• 3.25. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp. phân lập được
• 3.26. Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Cl. perfringens phân lập được
• 3.27. Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô autovacxin
• 3.28. Kết quả thử hiệu lực của autovacxin trên chuột nhắt trắng
• 3.29. Kết quả thử an toàn ở lợn sau khi tiêm chế phẩm autovacxin
• 3.30. Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau khi tiêm autovacxin
• 3.31. Kết quả bảo hộ lợn thí nghiệm bằng autovacxin
• 3.32. Kết quả thử nghiệm liều và số lần tiêm autovacxin cho lợn
• 3.33. Kết quả thử hiệu lực của autovacxin trên chuột nhắt trắng
• 3.34. Kết quả điều trị tiêu chảy ở lợn con
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Tóm tắt

I. Giới thiệu về nghiên cứu

Nghiên cứu này tập trung vào vai trò của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn tại ba tỉnh miền núi phía Bắc. Tình hình dịch bệnh ở lợn con đang trở thành vấn đề nghiêm trọng, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Theo thống kê, tỷ lệ mắc và chết do tiêu chảy ở lợn con rất cao, đặc biệt trong giai đoạn bú sữa. Việc xác định nguyên nhân và biện pháp phòng trị là cần thiết để giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là xác định vai trò của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con. Nghiên cứu cũng nhằm tuyển chọn các chủng vi khuẩn để chế tạo chế phẩm phòng bệnh và đề xuất biện pháp phòng trị hiệu quả.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này không chỉ cung cấp thông tin về vai trò của các vi khuẩn gây bệnh mà còn góp phần vào việc phát triển các biện pháp phòng trị hiệu quả. Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về hội chứng tiêu chảy và chế tạo vacxin phòng bệnh.

II. Tổng quan tài liệu

Hội chứng tiêu chảy ở lợn có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gồm cả yếu tố nguyên phát và thứ phát. Các vi sinh vật như E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens đóng vai trò quan trọng trong việc gây ra tình trạng này. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự kết hợp của các yếu tố môi trường và vi sinh vật gây bệnh có thể dẫn đến tình trạng tiêu chảy nghiêm trọng ở lợn con.

2.1. Nguyên nhân gây tiêu chảy

Nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn thường liên quan đến môi trường sống, chế độ dinh dưỡng và sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh. Các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, và chất lượng thức ăn có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của lợn con, tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển.

2.2. Vai trò của vi khuẩn trong tiêu chảy

Các vi khuẩn như E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens có khả năng gây ra các triệu chứng tiêu chảy nghiêm trọng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự hiện diện của các vi khuẩn này trong đường tiêu hóa có thể dẫn đến rối loạn tiêu hóa và giảm sức đề kháng của lợn con.

III. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện thông qua việc thu thập mẫu từ lợn con tại ba tỉnh miền núi phía Bắc. Các phương pháp phân lập và xác định vi khuẩn được áp dụng để đánh giá sự hiện diện của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens. Ngoài ra, nghiên cứu cũng tiến hành đánh giá khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được.

3.1. Phương pháp thu thập mẫu

Mẫu phân lợn con được thu thập từ các trang trại chăn nuôi tại ba tỉnh nghiên cứu. Các mẫu này sẽ được phân lập và xác định sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp này giúp đảm bảo tính đại diện cho tình hình dịch bệnh tại khu vực nghiên cứu.

3.2. Phương pháp phân lập và xác định vi khuẩn

Các phương pháp phân lập vi khuẩn bao gồm nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và xác định bằng kỹ thuật sinh hóa. Kết quả sẽ được phân tích để xác định tỷ lệ mắc và loại vi khuẩn gây bệnh, từ đó đưa ra các biện pháp phòng trị phù hợp.

IV. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lợn con mắc tiêu chảy cao, với sự hiện diện đáng kể của E. coli, Salmonella và Clostridium perfringens. Các chủng vi khuẩn này đã được phân lập và xác định đặc tính sinh học, cho thấy khả năng gây bệnh và mức độ mẫn cảm với kháng sinh khác nhau. Những phát hiện này cung cấp cơ sở cho việc phát triển các biện pháp phòng trị hiệu quả.

4.1. Tỷ lệ mắc tiêu chảy

Tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn con tại ba tỉnh nghiên cứu cho thấy sự gia tăng đáng kể trong các tháng mùa hè, khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc quản lý môi trường và dinh dưỡng trong chăn nuôi.

4.2. Đặc tính sinh học của vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn phân lập được cho thấy có khả năng gây bệnh cao, với nhiều yếu tố độc lực khác nhau. Việc xác định đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn này là cần thiết để phát triển các chế phẩm phòng bệnh hiệu quả.

V. Biện pháp phòng trị

Nghiên cứu đề xuất một số biện pháp phòng trị hiệu quả cho hội chứng tiêu chảy ở lợn con. Các biện pháp này bao gồm cải thiện điều kiện chăn nuôi, quản lý dinh dưỡng và sử dụng chế phẩm sinh học để tăng cường sức đề kháng cho lợn. Việc áp dụng các biện pháp này sẽ giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc và chết do tiêu chảy.

5.1. Cải thiện điều kiện chăn nuôi

Cải thiện điều kiện chăn nuôi bao gồm việc đảm bảo vệ sinh chuồng trại, kiểm soát nhiệt độ và độ ẩm, cũng như cung cấp thức ăn và nước uống sạch sẽ. Những yếu tố này có thể giúp giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.

5.2. Sử dụng chế phẩm sinh học

Sử dụng chế phẩm sinh học có thể giúp tăng cường sức đề kháng cho lợn con, từ đó giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh. Nghiên cứu cũng đề xuất việc chế tạo autovacxin từ các chủng vi khuẩn phân lập được để phòng bệnh hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Hội chứng tiêu chảy ở lợn con là một trong những bệnh lý phổ biến và gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi lợn. Theo số liệu khảo sát của Lê Minh Chí (1995), tổn thất về số lượng đàn gia súc trong thời kỳ bú sữa chiếm từ 70% đến 80%, trong đó 80% đến 90% các trường hợp bắt nguồn trực tiếp từ tiêu chảy. Đào Trọng Đạt và cộng sự (1996) chỉ ra rằng lợn con sau khi khỏi tiêu chảy thường bị còi cọc, sinh trưởng chậm hơn từ 26% đến 40%, hiệu suất chuyển hóa thức ăn kém và suy giảm sức đề kháng, dẫn đến nguy cơ mắc các bệnh kế phát.

Mặc dù các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam của Đỗ Trung Cứ (2004), Lê Văn Dương (2010), hay Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2011) đã phân tích các mầm bệnh đơn lẻ như Escherichia coli, Salmonella spp. hoặc Clostridium perfringens, song việc nghiên cứu đồng thời, toàn diện và có hệ thống về sự xuất hiện cùng vai trò gây bệnh của cả ba loại vi khuẩn đường ruột này tại khu vực miền núi phía Bắc vẫn còn là một khoảng trống khoa học. Luận án tiến sĩ nông nghiệp của nghiên cứu sinh Trần Đức Hạnh với đề tài "Nghiên cứu vai trò của E. coli, Salmonella, Clostridium perfringens gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị" (chuyên ngành Vi sinh vật học thú y, mã số 62 64 01 04, người hướng dẫn khoa học: GS. Nguyễn Quang Tuyên và PGS. Cù Hữu Phú, Đại học Thái Nguyên, 2013) được thực hiện nhằm giải quyết khoảng trống này.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định cụ thể:

1. Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Cl. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đủ điều kiện để chế tạo chế phẩm phòng bệnh.
2. Xây dựng và đề xuất một số biện pháp phòng trị tiêu chảy ở lợn con đạt hiệu quả cao.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Cl. perfringens phân lập từ phân và bệnh phẩm phủ tạng của lợn con bình thường và lợn con mắc hội chứng tiêu chảy; động vật thí nghiệm gồm chuột bạch (trọng lượng 18–20 gam/con) và đàn lợn nuôi tại thực địa.
• Phạm vi không gian: Địa bàn 3 tỉnh gồm Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc và hệ thống phòng thí nghiệm của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội.
• Phạm vi thời gian: Quá trình thu thập mẫu, phân lập, thử nghiệm và đánh giá được tiến hành từ năm 2008 đến năm 2011.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các nhóm nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy ở lợn từ các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế:

• Nguyên nhân môi trường và ngoại cảnh: Tác động của nhiệt độ, ẩm độ, biến đổi bức xạ mặt trời gây stress cho gia súc (Radostits, 1994; Carter và cs, 1995; Fairbrother, 1992). Nhiễm lạnh kéo dài làm suy giảm miễn dịch và chức năng thực bào (Hồ Văn Nam và cs, 1997; Lê Minh Chí, 1995; Phạm Ngọc Thạch, 2005; Phạm Sỹ Lăng, 1997).
• Nguyên nhân dinh dưỡng và thức ăn: Ô nhiễm nguồn nước, giảm oxy hòa tan (Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình, 2002; Weinstein và cs, 1984), thiếu hụt vi lượng (sắt, đồng, kẽm), nhiễm kim loại độc (asen, chì, thủy ngân, muối nitrat: Tsolis và cs, 1999) hoặc độc tố vi nấm như Aflatoxin từ nấm Aspergillus, Penicillium gây tổn thương gan, thận và tiêu chảy xuất huyết (Lê Thị Tài, 1997; Đậu Ngọc Hào, 2008).
• Nguyên nhân virus và ký sinh trùng: Hoạt động gây viêm ruột, teo lông nhung của Coronavirus (TGE), Rotavirus, Enterovirus, Adenovirus (Timoney và cs, 1988; Archie, 2000; Nguyễn Thị Kim Lan, 2006b); sự ký sinh của Isospora suis, Cryptosporidium, giun đũa, giun lươn, giun tóc và sán lá ruột (Nguyễn Như Pho, 2003; Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2006a; Phạm Sỹ Lăng, 1997, 2004).
• Đặc tính vi khuẩn đường ruột chủ yếu:
  • Escherichia coli: Phân lập đầu tiên bởi Escherich (1885). Chiếm khoảng 80% vi khuẩn hiếu khí đường ruột (Bùi Trung Trực và cs, 2004). Được phân thành 7 nhóm gây bệnh chính gồm ETEC, EPEC, EIEC, EHEC, VTEC/STEC, EAEC, NTEC (Giannella, 2008; Casey, Nagy & Moon và cs). Nghiên cứu cấu trúc kháng nguyên O (lipopolysaccharide), H (protein lông), K (vỏ bọc polysaccharide), F (fimbriae bám dính: F4/K88, F5/K99, F6/987P, F18: Orskov và cs, 1964; Nagy và cs, 1992, 1999; Popoff, 2001; Zoetendal, 1998; Nguyễn Cảnh Tự, 2011). Các yếu tố độc lực gồm độc tố chịu nhiệt (STa, STb: Ketyle và cs, 2005; Clarke và cs, 1988), độc tố không chịu nhiệt (LT1, LT2: Yuki và cs, 1999), độc tố tế bào Verotoxin (Konowalchuk và cs, 1977), dung huyết tố Haemolysin (Timoney và cs, 1988), yếu tố Colicin V (Skyberg và cs, 2006; Đặng Xuân Bình, 2004) và tính kháng kháng sinh qua plasmid R (Falkow, 1975; Benjamin và cs, 1985; Đỗ Ngọc Thúy và cs, 2002, 2005; Đoàn Kim Dung, 2003; Nguyễn Thị Kim Lan, 2004).
  • Salmonella spp.: Định danh và phân loại theo hệ thống Kauffmann-White (Selbitz, 1995; Barnes và Sorensen, 1975; Asai và cs, 2002). Độc lực gắn liền với yếu tố bám dính fimbriae CFA/1 (Bryan, 1988), kháng nguyên O, H, Vi/K (Borch và cs, 1996; Wray & Wray, 2000), độc tố đường ruột gồm độc tố thẩm xuất nhanh chịu nhiệt RPF và độc tố thẩm xuất chậm không chịu nhiệt DPF (Phukan và cs, 2000; Saitoh và cs, 2005), cùng plasmid độc lực và kháng thuốc (Chiu và cs, 2004; Nguyễn Thị Nội và cs, 1989; Lê Văn Tạo và cs, 1997; Hồ Văn Nam và cs, 1997; Đỗ Trung Cứ và cs, 2004).
  • Clostridium perfringens: Trực khuẩn yếm khí sinh nha bào Gram dương (Welch và Nuttall, 1892; Waters và cs, 2003; Rahman và cs, 1992). Phân loại thành các type từ A đến F dựa trên các loại ngoại độc tố Alpha, Beta, Epsilon, Iota, Kappa, Lamda, Muy, Nu (Hồ Đình Soái và Đinh Thị Bích Lân, 2005; Quinn và cs, 2002; Phạm Khắc Hiếu và cs, 1999). Type C và các độc tố đường ruột là tác nhân gây viêm ruột hoại tử nặng trên gia súc non (Phan Thanh Phượng và cs, 1996; Nguyễn Như Pho, 2003; Đào Trọng Đạt và cs, 1985; Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2011).
• Các giải pháp phòng trị: Biện pháp dinh dưỡng, bú sữa đầu (Hoàng Thủy Nguyên và cs, 1974; Đào Trọng Đạt và cs, 1996); ứng dụng chế phẩm sinh học probiotic như Bacillus subtilis, Subcolac, Ultralevure, Rodovet, Biolaclin, Ecostat, Biosubtyl (Vũ Văn Ngũ và cs, 1975; Bạch Quốc Thắng, 2011; Lê Thị Tài, 1997; Đỗ Trung Cứ, 2004; Trần Thị Hạnh và cs, 2004); sử dụng vacxin phòng bệnh gồm vacxin vô hoạt, giải độc tố, SALSCO, LitterGuard LT-C, ProSystem 4*3, Colisuin-CL (Nguyễn Thị Nội, 1985, 1989; CIRAD và cs, 2006; Smith & Halls, 1967; Valtonen, 1977); và phác đồ điều trị kết hợp kháng sinh mẫn cảm với bù nước, chất điện giải (Cục Thú y, 2004; Nguyễn Văn Tâm và Cù Hữu Phú, 2006).

Vị trí của luận án: Kế thừa các phương pháp vi sinh vật học truyền thống kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử (PCR) để phân tích đồng bộ mối liên quan, số lượng, serotype, độc tố và tính kháng kháng sinh của cả 3 loại vi khuẩn gây tiêu chảy trên lợn con tại Thái Nguyên, Bắc Giang và Vĩnh Phúc, từ đó nghiên cứu quy trình chế tạo autovacxin vô hoạt đa giá bổ trợ keo phèn ứng dụng tại thực địa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án vận dụng lý thuyết về sinh bệnh học của các vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae và Clostridiaceae), cơ chế gây độc của độc tố ruột và độc tố hoại tử, cơ chế truyền tính kháng thuốc qua plasmid R, và nguyên lý đáp ứng miễn dịch dịch thể chống lại vi khuẩn vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn (aluminum potassium sulfate).

Hệ thống phương pháp nghiên cứu định lượng và thực nghiệm bao gồm:

Nhóm phương pháp	Nội dung và kỹ thuật thực hiện	Nguồn dữ liệu / Dụng cụ / Hóa chất
Điều tra dịch tễ học	Phương pháp điều tra thống kê theo Nguyễn Văn Thiện và cs (2002), Nguyễn Như Thanh và cs (1996) để xác định tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết theo lứa tuổi, địa điểm, năm.	Số liệu thu thập từ các trang trại, hộ chăn nuôi tại Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc (2008–2011).
Lấy mẫu và bảo quản	Lấy 3–5 g phân tươi trong ống nghiệm vô trùng nút vặn; thu thập mẫu phủ tạng (máu tim, gan, lách, hạch màng treo ruột, phổi, ruột non, ruột già) trong túi nylon vô trùng, bảo quản ở 4°C.	Quy trình nghiên cứu vi sinh vật của Viện Thú y Quốc gia.
Đếm số lượng vi khuẩn	Pha loãng mẫu phân theo bậc 10, cấy 0,2 ml dịch pha loãng lên thạch đĩa Petri, đếm CFU bằng máy đếm vi khuẩn. Áp dụng công thức tính số lượng vi khuẩn $X$ trong 1 gam phân: $X = 5 \cdot a \cdot b$ (với $a$ là số CFU trung bình/đĩa, $b$ là độ pha loãng mẫu, hệ số 5 do cấy 0,2 ml).	Máy đếm khuẩn lạc, môi trường nuôi cấy hiếu khí và kỵ khí chuyên dụng.
Phân lập và giám định vi khuẩn	- E. coli và Salmonella spp.: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc MacConkey, XLD, EMB, Endo, thạch máu; tăng sinh qua pepton water Muller Kauffmann và RV broth; nhuộm Gram, thử tính di động (thạch mềm, giọt treo), thử đặc tính sinh hóa trên Kligler, VP, MR, đường, indol. - Cl. perfringens: Nuôi cấy kỵ khí trên nước gan (sinh hơi mạnh), nước thịt óc (đen óc), thạch glucose 7% máu cừu (10% CO2, 37°C tạo 2 vòng dung huyết đồng tâm), thạch Veillon (nứt thạch), môi trường sữa bò 7% Litmus (lên men sinh bão, đông vón sữa), thạch gelatin (tan chảy gelatin), thạch TSC, EYA, TGC.	Hệ thống môi trường, hóa chất chuẩn và thiết bị của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.
Xác định serotype và yếu tố độc lực	- Thử phản ứng ngưng kết trên phiến kính bằng kháng huyết thanh Poly OH, O, H, K chuẩn. - Thử khả năng dung huyết trên thạch máu cừu. - Phản ứng ngưng kết hồng cầu trực tiếp. - Phản ứng PCR khuếch đại gen quy định độc tố ruột (STa, STb, LT) và yếu tố bám dính. - Thử độc lực trên chuột bạch (18–20 g/con) bằng cách tiêm canh khuẩn, theo dõi tỷ lệ chết và thời gian chết.	Kháng huyết thanh chuẩn, cặp mồi PCR đặc hiệu, máy luân nhiệt PCR, chuột bạch thí nghiệm.
Thử tính mẫn cảm kháng sinh	Phương pháp khuếch tán khoanh giấy kháng sinh trên thạch theo tiêu chuẩn của NCCLS.	Đĩa giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid (Anh) và Biorad.
Chế tạo và kiểm nghiệm autovacxin	Tuyển chọn các chủng E. coli và Salmonella spp. có độc lực cao và kháng nguyên tính ổn định. Tăng sinh bằng máy lên men Bio 110 trong môi trường TSB, BHI, Yeast Extract, huyết thanh bê, chất chống bọt (antifoam). Vô hoạt vi khuẩn, phối trộn chất bổ trợ keo phèn. Kiểm tra độ thuần khiết, an toàn và hiệu lực bảo hộ trên chuột bạch và lợn thí nghiệm (hiệu giá kháng thể, tỷ lệ bảo hộ sau công cường độc, xác định liều và số lần tiêm).	Máy lên men Bio 110, keo phèn chua, chuột nhắt trắng, lợn thí nghiệm tại cơ sở nghiên cứu.
Xử lý số liệu	Phân tích số liệu theo các phương pháp thống kê sinh học trong nghiên cứu thú y.	Phần mềm và công cụ tính toán thống kê thú y.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện cơ sở lý luận về hội chứng tiêu chảy ở lợn, phân tích vai trò của các yếu tố ngoại cảnh bất lợi, stress, dinh dưỡng và nước uống kém chất lượng. Chương 1 tập trung làm rõ sinh học phân tử, cấu trúc kháng nguyên, các yếu tố bám dính (fimbriae F4, F5, F6, F18), độc tố đường ruột (ST, LT, Enterotoxin, Verotoxin) và cơ chế kháng thuốc qua plasmid R của ba loài vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Cl. perfringens. Đồng thời, chương này tổng quan các giải pháp can thiệp hiện hành gồm quản lý chăm sóc, bổ sung chế phẩm vi sinh (probiotic), ứng dụng các loại vacxin thương mại (LitterGuard LT-C, ProSystem 4*3, Colisuin-CL) và nguyên tắc sử dụng kháng sinh kết hợp bù nước, điện giải trong điều trị.

Chương 2: Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết 4 nội dung nghiên cứu lớn: điều tra dịch tễ tiêu chảy; phân lập, định danh 3 loài vi khuẩn; nghiên cứu đặc tính sinh học, độc lực, serotype, tính kháng kháng sinh; và thử nghiệm chế tạo autovacxin đa giá bổ trợ keo phèn. Chương này trình bày đầy đủ đối tượng nghiên cứu (vi khuẩn, chuột bạch 18–20 g, đàn lợn), địa bàn nghiên cứu (Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc và Viện Thú y Quốc gia), thời gian thực hiện (2008–2011), hệ thống môi trường phân lập, kháng huyết thanh chuẩn, hóa chất, quy trình lên men Bio 110, phương pháp PCR, kỹ thuật đếm CFU ($X = 5 \cdot a \cdot b$), kháng sinh đồ theo NCCLS và các bước đánh giá kiểm nghiệm an toàn, hiệu lực của autovacxin.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm, số liệu phân tích và thảo luận khoa học qua hệ thống 34 bảng số liệu và các sơ đồ, biểu đồ phân tích:

• Tình hình dịch tễ tiêu chảy tại 3 tỉnh: Luận án công bố tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con dưới 2 tháng tuổi phân theo địa bàn (Bảng 3.1), diễn biến qua các năm nghiên cứu (Bảng 3.2), tỷ lệ mắc tiêu chảy phân theo từng lứa tuổi (Bảng 3.3) và tỷ lệ chết do tiêu chảy theo các lứa tuổi (Bảng 3.4). Số liệu chỉ ra lợn con giai đoạn bú sữa có nguy cơ mắc và chết cao nhất.
• Số lượng vi khuẩn đường ruột: Kết quả xác định số lượng vi khuẩn hiếu khí, Salmonella spp., E. coli trong 1 gam phân lợn con (Bảng 3.5) và số lượng vi khuẩn yếm khí, Cl. perfringens trong 1 gam phân (Bảng 3.6). Số lượng các vi khuẩn gây bệnh này ở lợn con bị tiêu chảy tăng cao vượt trội so với lợn con khỏe mạnh bình thường.
• Tỷ lệ phân lập vi khuẩn: Tỷ lệ phân lập E. coli, Salmonella spp., Cl. perfringens trong phân lợn con (Bảng 3.7) và từ các cơ quan phủ tạng (máu tim, gan, lách, hạch màng treo ruột, phổi, ruột) của lợn con chết do tiêu chảy (Bảng 3.8). Vi khuẩn được tìm thấy tập trung nhiều nhất ở hạch màng treo ruột và thành ruột non.
• Đặc tính sinh hóa và định type kháng nguyên:
  • Khẳng định các phản ứng sinh hóa đặc trưng của E. coli (Bảng 3.9), Salmonella spp. (Bảng 3.10) và Cl. perfringens (Bảng 3.11).
  • Kết quả xác định serotype kháng nguyên O của các chủng E. coli phân lập được (Bảng 3.12), serotype của Salmonella spp. (Bảng 3.13) và type vi khuẩn Cl. perfringens (Bảng 3.14).
• Yếu tố độc lực, dung huyết và độc tố:
  • Tỷ lệ dung huyết của E. coli (Bảng 3.15) và phản ứng ngưng kết trực tiếp hồng cầu của E. coli (Bảng 3.16) cùng Salmonella spp. (Bảng 3.17).
  • Kết quả xác định các gen quy định yếu tố gây bệnh bằng kỹ thuật PCR ở E. coli (Bảng 3.18).
  • Kết quả kiểm tra độc lực trên chuột bạch đối với E. coli (Bảng 3.19), Salmonella spp. (Bảng 3.20) và Cl. perfringens (Bảng 3.22).
  • Kết quả xác định độc tố ruột của Salmonella spp. (Bảng 3.21) và độc tố của Cl. perfringens (Bảng 3.23).
• Tính mẫn cảm kháng sinh: Kết quả đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng lại các loại kháng sinh thông dụng của các chủng E. coli (Bảng 3.24), Salmonella spp. (Bảng 3.25) và Cl. perfringens (Bảng 3.26). Tỷ lệ kháng cao xuất hiện ở nhiều loại kháng sinh cổ điển như Tetracyclin, Streptomycin, Ampicillin.
• Chế tạo và thử nghiệm autovacxin vô hoạt đa giá:
  • Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng của các lô autovacxin (Bảng 3.27).
  • Kết quả thử nghiệm hiệu lực bảo hộ của autovacxin trên chuột nhắt trắng (Bảng 3.28 và Bảng 3.33).
  • Đánh giá độ an toàn trên lợn sau khi tiêm autovacxin (Bảng 3.29).
  • Khảo sát sự gia tăng hiệu giá kháng thể ở lợn thí nghiệm sau tiêm (Bảng 3.30).
  • Kết quả bảo hộ lợn thí nghiệm chống lại lây nhiễm thực nghiệm (Bảng 3.31).
  • Kết quả thử nghiệm xác định liều lượng và số lần tiêm autovacxin thích hợp cho lợn (Bảng 3.32).
  • Thử nghiệm lâm sàng và đánh giá kết quả điều trị tiêu chảy ở lợn con bằng các phác đồ phối hợp kháng sinh mẫn cảm và chăm sóc hỗ trợ (Bảng 3.34).

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp về mặt lý luận và khoa học

1. Cung cấp hệ thống dữ liệu khoa học đồng bộ và toàn diện về dịch tễ học, sự lưu hành và vai trò gây bệnh của 3 loại vi khuẩn (E. coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens) trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con tại khu vực 3 tỉnh miền núi/trung du phía Bắc (Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc).
2. Làm rõ các đặc tính sinh vật học, xác định tỷ lệ các serotype kháng nguyên O, sự hiện diện của các gen độc lực, độc tố đường ruột (ST, LT, Enterotoxin) và khả năng dung huyết, ngưng kết hồng cầu của các chủng vi khuẩn thực địa phân lập được.
3. Cung cấp bức tranh thực trạng về mức độ mẫn cảm và tình trạng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đường ruột gây bệnh trên đàn lợn tại khu vực nghiên cứu, làm cơ sở khoa học cho công tác dịch tễ học kháng thuốc.

Đóng góp về mặt thực tiễn

1. Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn thực địa có độc lực cao, tính kháng nguyên mạnh và ổn định để ứng dụng sản xuất thành công chế phẩm autovacxin vô hoạt đa giá có bổ trợ keo phèn bằng hệ thống lên men Bio 110.
2. Chứng minh qua thực nghiệm độ an toàn, khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu và hiệu lực bảo hộ cao của autovacxin trên động vật thí nghiệm (chuột bạch) và đàn lợn tại thực địa, giúp giảm tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết ở lợn con.
3. Xây dựng và đề xuất phác đồ điều trị hội chứng tiêu chảy ở lợn con dựa trên kết quả kháng sinh đồ, kết hợp điều trị nguyên nhân và bù nước, điện giải, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu được giới hạn trong phạm vi không gian của 3 tỉnh miền núi phía Bắc (Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc) trên đối tượng lợn con dưới 2 tháng tuổi trong giai đoạn 2008–2011; chưa mở rộng đánh giá biến động serotype và kiểu gen kháng thuốc trên quy mô toàn quốc hoặc theo dõi biến động miễn dịch dài hạn ở các lứa lợn sinh sản tiếp theo.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục theo dõi sự biến đổi serotype và tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đường ruột phân lập từ lợn qua các năm.
  • Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất autovacxin đa giá ở quy mô công nghiệp và nghiên cứu thử nghiệm bổ sung kháng nguyên phòng các bệnh do virus kết phát.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo hữu ích cho các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học, sinh viên và giảng viên các trường đại học nông nghiệp, viện nghiên cứu thú y trong công tác giảng dạy, nghiên cứu chuyên ngành Vi sinh vật học thú y, Bệnh truyền nhiễm và Dịch tễ học thú y. Phần phương pháp phân lập vi khuẩn kỵ khí Cl. perfringens, kỹ thuật PCR xác định gen độc lực và quy trình lên men chế tạo vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn có giá trị tham khảo chuyên môn cao.
• Cán bộ thú y cơ sở và người chăn nuôi: Tham khảo các phác đồ điều trị tiêu chảy dựa trên mức độ mẫn cảm kháng sinh thực tế và quy trình tiêm phòng autovacxin đa giá nhằm nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh đường ruột tại các trang trại chăn nuôi lợn.

Câu hỏi thường gặp

1. Đề tài luận án nghiên cứu đồng thời những loại vi khuẩn nào gây tiêu chảy ở lợn?
Luận án nghiên cứu đồng thời 3 loại vi khuẩn đường ruột chủ yếu gồm Escherichia coli, Salmonella spp. và Clostridium perfringens.

2. Địa bàn và thời gian thực hiện nghiên cứu của luận án là ở đâu và khi nào?
Nghiên cứu được tiến hành tại 3 tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Vĩnh Phúc và tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội trong khoảng thời gian từ năm 2008 đến năm 2011.

3. Công thức tính số lượng vi sinh vật trong 1 gam phân lợn được tác giả áp dụng như thế nào?
Tác giả áp dụng công thức $X = 5 \cdot a \cdot b$, trong đó $a$ là số lượng CFU trung bình đếm được trên một đĩa Petri, $b$ là độ pha loãng mẫu, và hệ số 5 là do thể tích dịch cấy ban đầu là 0,2 ml.

4. Luận án đã chế tạo thử nghiệm loại vacxin nào để phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con?
Luận án đã chế tạo thử nghiệm autovacxin vô hoạt đa giá có bổ trợ keo phèn (aluminum potassium sulfate), sử dụng các chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella có độc lực cao, tính kháng nguyên ổn định được nuôi cấy trên máy lên men Bio 110.

5. Mục tiêu chính của việc thử nghiệm kháng sinh đồ trong luận án là gì?
Mục tiêu là đánh giá mức độ mẫn cảm và tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Cl. perfringens phân lập từ thực địa, từ đó xây dựng phác đồ điều trị tiêu chảy hiệu quả cao cho lợn con.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Trần Đức Hạnh đã giải quyết một cách hệ thống và thực chứng vấn đề dịch tễ học, đặc tính sinh học và vai trò gây bệnh của ba loài vi khuẩn E. coli, Salmonella spp. và Clostridium perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con tại 3 tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang và Vĩnh Phúc. Công trình đã thành công trong việc xác định các serotype kháng nguyên, yếu tố độc lực, tình trạng mẫn cảm kháng sinh và chế tạo thử nghiệm autovacxin vô hoạt đa giá bổ trợ keo phèn có hiệu lực bảo hộ tốt trên động vật thí nghiệm. Các kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học vững chắc và giải pháp kỹ thuật thiết thực phục vụ công tác phòng trị bệnh tiêu chảy ở lợn, đóng góp tư liệu chuyên khảo giá trị cho nghiên cứu và đào tạo chuyên ngành Vi sinh vật học thú y.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Trong những năm qua, nghề chăn nuôi lợn ở nước ta phát triển mạnh, tăng nhanh số lượng và được cải tiến nhiều về chất lượng để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển chăn nuôi, tình hình dịch bệnh cũng diễn biến hết sức phức tạp, một số dịch bệnh nguy hiểm như bệnh tai xanh, lở mồm long móng… hàng năm làm chết nhiều lợn và gây thiệt hại nặng nề cho người chăn nuôi. Ngoài ra, một trong những bệnh thường gặp phổ biến ở lợn là hội chứng tiêu chảy cũng gây thiệt hại lớn về kinh tế do tỷ lệ mắc và chết cao, tốn kém thuốc điều trị. Đánh giá sự thiệt hại do tiêu chảy gây ra trong chăn nuôi, Lê Minh Chí (1995) [4], cho thấy có tới 70- 80% sự tổn thất về số lượng của gia súc là ở thời kỳ bú sữa, trong đó 80-90% là do hậu quả của tiêu chảy gây ra.

Theo Đào Trọng Đạt và cs (1996) [9], lợn con mắc tiêu chảy sau khi khỏi thường bị còi cọc, chậm lớn, sinh trưởng chậm từ 26- 40%, tiêu tốn thức ăn cao, giảm sức đề kháng nên dễ mắc các bệnh kế phát, hiệu quả chăn nuôi thấp. Hội chứng tiêu chảy ở lợn con do nhiều nguyên nhân gây nên, có nguyên nhân là nguyên phát hoặc nguyên nhân là thứ phát kết hợp với yếu tố bất lợi của ngoại cảnh tác động như sự thay đổi đột ngột của điều kiện thời tiết, khí hậu; sai sót trong chăm sóc, quản lý; môi trường vệ sinh kém. tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loài vi sinh vật phát triển, trong đó có các vi sinh vật gây bệnh. Những yếu tố trên đã tác động lên cơ thể lợn con, làm giảm sức đề kháng và phát sinh nhiều bệnh trong đó có hội chứng tiêu chảy.

Các tác giả trong và ngoài nước khi nghiên cứu về vấn đề này đã cho thấy một số vi khuẩn đường ruột như E. coli, Salmonella spp. perfringens… có vai trò quan trọng trong quá trình gây rối loạn tiêu hóa ở lợn con. Một số tác giả trong nước như Đỗ Trung Cứ (2004) [5]; Lê Văn Dương (2010) [8]; Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2011) [25];.

đã nghiên cứu hội chứng tiêu chảy ở lợn và biện pháp phòng trị. Các tác giả trên đã nghiên cứu nguyên nhân do vi n 2 khuẩn như Salmonella, E. coli hoặc Cl. perfringens gây ra và cho thấy những tác hại do tiêu chảy gây ra đối với lợn là rất lớn.

Tuy nhiên, việc nghiên cứu sự xuất hiện đồng thời của ba loại vi khuẩn là E. coli, Salmonella spp. perfringens và vai trò gây bệnh của chúng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con và xây dựng biện pháp phòng trị thích hợp là một vấn đề cấp thiết thì chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ, toàn diện và hệ thống. Vì vậy, chúng tôi tiến hành triển khai đề tài: "Nghiên cứu vai trò của E.coli, Salmonella và Clostridium perfringens gây tiêu chảy ở lợn tại 3 tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị” nhằm có những hiểu biết sâu hơn và giảm thiểu thiệt hại do tiêu chảy gây ra cho lợn con tại một số tỉnh phía Bắc, góp phần tăng thu nhập cho người chăn nuôi.

* Mục tiêu của đề tài: - Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E. coli, Salmonella và Cl. perfringens trong hội chứng tiêu chảy ở lợn con, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đủ điều kiện để chế tạo chế phẩm phòng bệnh. - Xây dựng và đề xuất một số biện pháp phòng trị tiêu chảy ở lợn con đạt hiệu quả cao.