Nghiên Cứu Tổng Hợp Protein NS1 Của Virus Dengue Ứng Dụng Phát Triển Sinh Phẩm Chẩn Đoán

• Tác giả: Chu Thị Minh Hải
• Người hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong
• Trường học: Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Tổng Hợp Protein NS1 Của Virus Dengue: Ứng Dụng Trong Chẩn Đoán
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tình hình dịch bệnh sốt xuất huyết trên thế giới và tại Việt nam
• 1.2. Tình hình dịch SXHD diễn ra tại khu vực Đông Nam Á
• 1.3. Tình hình dịch bệnh SXHD diễn ra tại Việt Nam
• 1.4. Diễn biến thể hiện lượng virus Dengue trong máu người bệnh sốt xuất huyết
• 1.5. Đặc điểm của virus Dengue
• 1.5.1. Đặc điểm hình thái cấu trúc và di truyền của virus Dengue
• 1.5.2. Đặc điểm protein của virus Dengue
• 1.5.2.1. Protein cấu trúc
• 1.5.2.2. Protein không cấu trúc
• 1.5.2.2.1. Protein NS1 của virus Dengue
• 1.5.3. Đặc điểm của protein NS1
• 1.5.4. Vai trò và ứng dụng của NS1
• 1.5.4.1. Ứng dụng tạo vaccine chống SXHD
• 1.5.4.2. NS1 là mục tiêu cho thuốc chống virus
• 1.5.4.3. Ứng dụng trong chẩn đoán DENV
• 1.6. Một số phương pháp chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue
• 1.6.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng
• 1.6.2. Sốt xuất huyết Dengue
• 1.6.2.1. Sốt xuất huyết Dengue có dấu hiệu cảnh báo
• 1.6.2.2. Sốt xuất huyết Dengue nặng
• 1.6.3. Phương pháp phân lập virus
• 1.6.4. Phương pháp chẩn đoán dựa trên phát hiện acid nucleic
• 1.6.4.1. Phương pháp RT-PCR
• 1.6.4.2. Phương pháp Real-time RT-PCR
• 1.6.5. Chẩn đoán qua xét nghiệm huyết thanh
• 1.6.5.1. Phương pháp ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition)
• 1.6.5.2. Phương pháp miễn dịch enzyme phát hiện kháng thể IgM (MAC-ELISA)
• 1.6.5.3. Phương pháp chẩn đoán dựa trên protein kháng nguyên NS1
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu RNA virus Dengue
• 2.2. Vector tách dòng
• 2.3. Vector biểu hiện
• 2.4. Vật chủ biểu hiện
• 2.5. Môi trường – Hóa chất
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6.1. Phương pháp vi sinh
• 2.6.1.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
• 2.6.1.2. Phương pháp giữ giống vi sinh vật
• 2.6.1.3. Phương pháp tạo tế bào khả biến
• 2.6.1.4. Biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp trong vi khuẩn E.
• 2.6.2. Phương pháp sinh học phân tử
• 2.6.2.1. Phương pháp tạo cDNA mã hóa gen NS1 bằng enzyme phiên mã ngược
• 2.6.2.2. Phương pháp khuếch đại gen mã hóa NS1 bằng PCR
• 2.6.2.3. Phương pháp tách chiết DNA plasmid
• 2.6.2.4. Phương pháp tạo cấu trúc pJET1
• 2.6.2.5. Biến nạp vào tế bào E.
• 2.6.2.6. Cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
• 2.6.2.7. Tinh sạch vector pET22b(+) và đoạn gen mã hóa NS1
• 2.6.2.8. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+)::NS1
• 2.6.3. Phương pháp hóa sinh
• 2.6.3.1. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.6.3.2. Phương pháp điện di SDS – PAGE
• 2.6.3.3. Phương pháp tách chiết protein thể tan
• 2.6.3.4. Phương pháp tách chiết protein thể vùi
• 2.6.3.5. Phương pháp Western blot
• 2.6.3.6. Phương pháp tinh sạch protein
• 2.6.4. Phương pháp Tin-Sinh học
• 2.6.4.1. Phương pháp thiết kế mồi
• 2.6.4.2. Phương pháp sử dụng phần mềm MultAlin
• 2.6.4.3. Phương pháp sử dụng phần mềm NEBcutter V2
• 2.6.4.4. Phương pháp sử dụng phần mềm FastPCR
• 2.6.4.5. Phương pháp sử dụng phần mềm BLAST
• 2.6.4.6. Phương pháp sử dụng phần mềm Translate Tool
• 2.6.4.7. Phương pháp sử dụng phần mềm Quantity One
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả RT-PCR khuếch đại gen mã hóa NS1
• 3.2. Kết quả tách dòng gen mã hóa NS1
• 3.3. Kết quả tạo cấu trúc biểu hiện mang gen mã hóa protein NS1
• 3.4. Xử lý vector pET22b và pJET1.2::ns1 bằng enzyme giới hạn
• 3.5. Chèn gen ns1 vào vector pET22b và biến nạp vào E.coli mang cấu trúc biểu hiện pET22b::ns1
• 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid bằng PCR với mồi đặc hiệu cho gen ns1
• 3.7. Kiểm tra plasmid bằng cách cắt bằng enzyme giới hạn
• 3.8. Giải trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện pET22b::ns1
• 3.9. Biểu hiện protein NS1 trong E.
• 3.10. Khảo sát các điều kiện biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp
• 3.10.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng - IPTG
• 3.10.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống
• 3.10.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ
• 3.10.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
• 3.11. Kết quả tinh sạch Protein
• 3.12. Ứng dụng chế tạo thử nghiệm que thử phát hiện nhanh kháng thể đặc hiệu kháng virus Dengue từ huyết thanh
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Protein NS1 Cơ Hội Chẩn Đoán Dengue

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là một bệnh truyền nhiễm do Virus Dengue gây ra, ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới. Việc chẩn đoán sớm và chính xác là yếu tố then chốt để kiểm soát dịch bệnh và giảm thiểu biến chứng. Protein NS1 nổi lên như một dấu ấn sinh học (biomarker) đầy hứa hẹn trong chẩn đoán Dengue. Bài viết này đi sâu vào nghiên cứu tổng hợp Protein NS1, mở ra cánh cửa cho các ứng dụng chẩn đoán hiệu quả, đặc biệt là phát triển các xét nghiệm nhanh và chính xác. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất, đe dọa đến hơn 1/3 dân số thế giới ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Việc phát hiện sớm Virus Dengue thông qua Protein NS1 đóng vai trò quan trọng trong việc cứu sống người bệnh.

1.1. Virus Dengue và Gánh Nặng Sức Khỏe Toàn Cầu

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) đang trở thành một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng trên toàn cầu, đặc biệt là ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Sự lây lan nhanh chóng của Virus Dengue đã gây ra những hậu quả nặng nề về kinh tế và xã hội. Theo số liệu thống kê, hàng năm có hàng triệu ca mắc SXHD trên toàn thế giới, gây ra nhiều ca tử vong, đặc biệt là ở trẻ em. Việc phát triển các phương pháp chẩn đoán hiệu quả và kịp thời là vô cùng quan trọng để kiểm soát dịch bệnh. Protein NS1 đang được nghiên cứu rộng rãi như một mục tiêu tiềm năng cho các xét nghiệm chẩn đoán nhanh và chính xác.

1.2. Giới Thiệu Về Protein NS1 Dấu Ấn Sinh Học Tiềm Năng

Protein NS1 là một protein không cấu trúc được sản xuất với số lượng lớn trong quá trình nhiễm Virus Dengue. Nó tồn tại cả ở dạng liên kết màng và dạng tiết ra ngoại bào, có thể được phát hiện trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn sớm của bệnh. Điều này làm cho Protein NS1 trở thành một dấu ấn sinh học (biomarker) lý tưởng cho chẩn đoán sớm Dengue. Nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của Protein NS1 đang mở ra những cơ hội mới trong việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, chính xác và dễ sử dụng, giúp cải thiện khả năng phát hiện và điều trị bệnh.

II. Protein NS1 và Thách Thức Trong Chẩn Đoán Sốt Xuất Huyết Dengue

Mặc dù Protein NS1 hứa hẹn nhiều tiềm năng trong chẩn đoán Dengue, nhưng vẫn còn tồn tại một số thách thức cần vượt qua. Một trong số đó là vấn đề về độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Phản ứng chéo với các virus khác hoặc các bệnh nhiễm trùng khác có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Ngoài ra, sự thay đổi trong cấu trúc protein NS1 giữa các serotype Virus Dengue khác nhau cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của xét nghiệm. Cần có những nghiên cứu sâu hơn để cải thiện độ chính xác và độ tin cậy của các xét nghiệm dựa trên Protein NS1, đảm bảo rằng chúng có thể được sử dụng một cách hiệu quả trong thực tế.

2.1. Vấn Đề Độ Nhạy và Độ Đặc Hiệu Của Xét Nghiệm NS1

Độ nhạy và độ đặc hiệu là hai yếu tố quan trọng quyết định chất lượng của một xét nghiệm chẩn đoán. Xét nghiệm Protein NS1 cần phải có độ nhạy cao để phát hiện được cả những trường hợp nhiễm bệnh ở giai đoạn sớm, khi nồng độ protein trong máu còn thấp. Đồng thời, xét nghiệm cũng cần phải có độ đặc hiệu cao để tránh nhầm lẫn với các bệnh nhiễm trùng khác. Các nghiên cứu đang tập trung vào việc cải thiện cả hai yếu tố này, thông qua việc sử dụng các kháng thể đặc hiệu hơn và các kỹ thuật phát hiện tiên tiến.

2.2. Nguy Cơ Phản Ứng Chéo và Biến Đổi Serotype Virus Dengue

Một trong những thách thức lớn trong chẩn đoán Dengue là nguy cơ phản ứng chéo với các virus khác, chẳng hạn như virus Zika hoặc chikungunya. Điều này có thể dẫn đến kết quả dương tính giả, gây ra sự hoang mang và lãng phí nguồn lực. Hơn nữa, sự biến đổi liên tục của các serotype Virus Dengue cũng đặt ra một thách thức lớn, vì các kháng thể được sử dụng trong xét nghiệm có thể không nhận biết được tất cả các biến thể. Các nhà khoa học đang nghiên cứu các phương pháp để giảm thiểu phản ứng chéo và phát triển các xét nghiệm có thể phát hiện được nhiều serotype Virus Dengue khác nhau.

2.3. Phát Hiện NS1 ở Giai Đoạn Sớm và Mức Độ Chính Xác

Việc phát hiện NS1 trong giai đoạn sớm của bệnh đóng vai trò then chốt để can thiệp kịp thời và giảm thiểu nguy cơ biến chứng. Tuy nhiên, nồng độ NS1 có thể rất thấp trong những ngày đầu của bệnh, đòi hỏi các xét nghiệm có độ nhạy cao. Ngoài ra, mức độ chính xác của xét nghiệm NS1 có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, như thời điểm lấy mẫu, kỹ thuật thực hiện và chất lượng của thuốc thử. Các nghiên cứu đang tập trung vào việc tối ưu hóa các quy trình xét nghiệm để đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy.

III. Tổng Hợp Protein NS1 Phương Pháp Tiên Tiến và Hiệu Quả

Để đáp ứng nhu cầu chẩn đoán Dengue, việc tổng hợp protein NS1 đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng. Các phương pháp tổng hợp khác nhau đã được phát triển, bao gồm sử dụng hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn, tế bào động vật có vú và côn trùng. Mỗi phương pháp có những ưu điểm và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào mục đích sử dụng và quy mô sản xuất. Việc lựa chọn phương pháp tổng hợp phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của protein NS1.

3.1. Biểu Hiện Protein NS1 Tái Tổ Hợp Trong Vi Khuẩn E.coli

Sử dụng vi khuẩn E.coli để biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp là một phương pháp phổ biến và hiệu quả. E.coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ dàng nuôi cấy và biến đổi gen, giúp sản xuất protein NS1 với số lượng lớn và chi phí thấp. Tuy nhiên, một thách thức là protein NS1 có thể tạo thành các thể vùi (inclusion bodies) trong tế bào vi khuẩn, đòi hỏi các bước tinh sạch phức tạp để thu được protein hoạt tính sinh học.

3.2. Tổng Hợp NS1 trong Tế Bào Động Vật Có Vú và Côn Trùng

Ngoài vi khuẩn E.coli, tế bào động vật có vú và côn trùng cũng được sử dụng để tổng hợp protein NS1. Các hệ thống này có khả năng tạo ra các protein có cấu trúc gấp đúng và glycosyl hóa, gần giống với protein NS1 tự nhiên trong virus Dengue. Điều này có thể cải thiện khả năng nhận diện của kháng thể và tăng hiệu quả của xét nghiệm chẩn đoán. Tuy nhiên, việc nuôi cấy và biến đổi gen tế bào động vật có vú và côn trùng thường phức tạp và tốn kém hơn so với vi khuẩn E.coli.

IV. Ứng Dụng Protein NS1 Trong Xét Nghiệm Chẩn Đoán Nhanh Dengue

Protein NS1 đóng vai trò then chốt trong việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán nhanh Dengue. Dựa trên khả năng phát hiện Protein NS1 trong giai đoạn sớm của bệnh, các nhà khoa học đã phát triển nhiều loại xét nghiệm khác nhau, bao gồm ELISA NS1, que thử nhanh và các nền tảng chẩn đoán dựa trên chip. Các xét nghiệm này cho phép phát hiện Dengue một cách nhanh chóng và dễ dàng, giúp các bác sĩ đưa ra quyết định điều trị kịp thời.

4.1. Dengue NS1 ELISA Phương Pháp Phổ Biến và Tin Cậy

Dengue NS1 ELISA là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch enzyme được sử dụng rộng rãi để phát hiện Protein NS1 trong mẫu huyết thanh của bệnh nhân. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho phép phát hiện Dengue ở giai đoạn sớm của bệnh. Tuy nhiên, ELISA đòi hỏi trang thiết bị và kỹ thuật viên có chuyên môn, nên thường được thực hiện trong các phòng xét nghiệm lớn.

4.2. Dengue NS1 Rapid Test Xét Nghiệm Nhanh Chóng và Dễ Sử Dụng

Dengue NS1 Rapid Test là một loại xét nghiệm nhanh dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch. Phương pháp này cho phép phát hiện Protein NS1 trong vòng vài phút, mà không cần đến trang thiết bị phức tạp. Rapid Test rất dễ sử dụng và phù hợp cho các phòng khám nhỏ, vùng sâu vùng xa, hoặc các tình huống cần chẩn đoán nhanh chóng.

4.3. Phát Triển Các Nền Tảng Chẩn Đoán Mới Dựa Trên Protein NS1

Ngoài ELISA và Rapid Test, các nhà khoa học đang nghiên cứu và phát triển các nền tảng chẩn đoán mới dựa trên Protein NS1, như chip protein, cảm biến sinh học và các hệ thống chẩn đoán phân tử. Các nền tảng này hứa hẹn sẽ cải thiện độ nhạy, độ đặc hiệu và tốc độ chẩn đoán, đồng thời giảm chi phí và đơn giản hóa quy trình xét nghiệm.

V. Nghiên Cứu NS1 Triển Vọng Tương Lai và Ứng Dụng Mở Rộng

Nghiên cứu về protein NS1 không chỉ giới hạn trong lĩnh vực chẩn đoán Dengue. Các nhà khoa học đang khám phá vai trò của protein NS1 trong cơ chế bệnh sinh của Dengue, cũng như tiềm năng của nó trong việc phát triển vaccine và thuốc điều trị. Việc hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của protein NS1 sẽ mở ra những cơ hội mới trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh Dengue.

5.1. Vai Trò Của Protein NS1 Trong Cơ Chế Bệnh Sinh Dengue

Protein NS1 không chỉ là một dấu ấn sinh học mà còn đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của Dengue. Nó có thể tương tác với các tế bào miễn dịch và gây ra các phản ứng viêm, góp phần vào sự phát triển của bệnh. Nghiên cứu về vai trò của protein NS1 trong cơ chế bệnh sinh có thể giúp chúng ta hiểu rõ hơn về bệnh và phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.

5.2. Kháng Thể NS1 và Tiềm Năng Phát Triển Vaccine Dengue

Kháng thể NS1 có thể trung hòa virus Dengue và bảo vệ cơ thể khỏi bệnh. Do đó, protein NS1 đang được nghiên cứu như một ứng cử viên tiềm năng cho vaccine Dengue. Các nghiên cứu đang tập trung vào việc phát triển các loại vaccine dựa trên protein NS1 có thể tạo ra phản ứng miễn dịch mạnh mẽ và bảo vệ chống lại tất cả các serotype Virus Dengue.

VI. Kết Luận Protein NS1 Bước Tiến Mới Trong Chẩn Đoán Dengue

Tóm lại, nghiên cứu tổng hợp Protein NS1 đã mở ra những triển vọng mới trong chẩn đoán Dengue. Với những ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng phát hiện sớm, Protein NS1 đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc kiểm soát dịch bệnh và cải thiện sức khỏe cộng đồng. Tuy nhiên, cần có những nghiên cứu sâu hơn để giải quyết những thách thức còn tồn tại và khai thác tối đa tiềm năng của Protein NS1 trong tương lai.

6.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi Của Protein NS1

Protein NS1 có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, từ chẩn đoán đến phòng ngừa và điều trị Dengue. Việc phát triển các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, vaccine và thuốc điều trị dựa trên protein NS1 sẽ giúp chúng ta kiểm soát dịch bệnh một cách hiệu quả hơn và bảo vệ sức khỏe của hàng triệu người trên toàn thế giới.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Protein NS1

Các hướng nghiên cứu tiếp theo về protein NS1 bao gồm: nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và chức năng của protein NS1, phát triển các xét nghiệm chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn, và phát triển các loại vaccine và thuốc điều trị dựa trên protein NS1 có thể bảo vệ chống lại tất cả các serotype Virus Dengue. Ngoài ra, việc nghiên cứu vai trò của protein NS1 trong cơ chế bệnh sinh của Dengue cũng là một lĩnh vực quan trọng cần được quan tâm.

Tổng quan nghiên cứu

Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus Dengue gây ra, lây truyền qua muỗi Aedes aegypti. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có khoảng 3,9 tỷ người trên thế giới, chiếm hơn 40% dân số, đang sinh sống tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới có nguy cơ mắc SXHD. Ước tính mỗi năm có khoảng 390 triệu trường hợp mắc sốt Dengue trên toàn cầu, trong đó tỷ lệ tử vong khoảng 3,9%. Tại Việt Nam, từ đầu năm 2017 đến tháng 8 cùng năm đã ghi nhận hơn 80.000 ca mắc SXHD với 22 trường hợp tử vong. Dịch bệnh diễn biến phức tạp, đặc biệt tại các tỉnh miền Trung và miền Nam, gây áp lực lớn lên hệ thống y tế và nền kinh tế.

Virus Dengue có 4 serotype chính (DENV-1 đến DENV-4) với khả năng miễn dịch suốt đời đối với từng serotype riêng biệt nhưng miễn dịch chéo ngắn hạn với các serotype khác. Protein NS1 của virus Dengue là một glycoprotein không cấu trúc, có tính bảo thủ cao, xuất hiện sớm trong huyết thanh bệnh nhân và đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép RNA virus cũng như trong đáp ứng miễn dịch của vật chủ. NS1 được xem là mục tiêu tiềm năng cho phát triển vaccine, thuốc kháng virus và sinh phẩm chẩn đoán.

Mục tiêu nghiên cứu là tổng hợp và biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp của virus Dengue để phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh, phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam. Nghiên cứu tập trung vào tách dòng gen mã hóa NS1, xây dựng vector biểu hiện trong E.coli, biểu hiện và tinh sạch protein NS1, đồng thời ứng dụng protein này trong chế tạo que thử phát hiện nhanh kháng thể đặc hiệu virus Dengue từ huyết thanh. Phạm vi nghiên cứu bao gồm mẫu RNA virus Dengue type 1 lấy từ bệnh nhân sốt xuất huyết tại Việt Nam, thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội trong giai đoạn 2017-2018. Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm SXHD, hỗ trợ điều trị kịp thời và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Lý thuyết về cấu trúc và chức năng protein NS1: NS1 là glycoprotein không cấu trúc, tồn tại ở dạng dimer và hexamer, có vai trò quan trọng trong sao chép RNA virus và kích thích đáp ứng miễn dịch. Cấu trúc NS1 gồm ba miền chính: β-roll, cánh (wing) và β-ladder, tạo nên mặt trong kỵ nước và mặt ngoài ưa nước của phân tử.

• Mô hình biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli: Sử dụng vector pET22b(+) với promoter T7 mạnh, tín hiệu dẫn đường pelB và đuôi His-tag để biểu hiện và tinh sạch protein NS1 trong chủng E.coli BL21(DE3).

• Khái niệm về kỹ thuật sinh học phân tử và miễn dịch học: Bao gồm kỹ thuật tách dòng gen, PCR, RT-PCR, điện di gel agarose và SDS-PAGE, Western blot, cũng như nguyên lý sắc ký miễn dịch và ELISA để phát hiện kháng nguyên NS1 và kháng thể IgM/IgG.

• Lý thuyết về chẩn đoán SXHD dựa trên protein NS1: NS1 xuất hiện sớm trong huyết thanh bệnh nhân, có thể phát hiện trước khi kháng thể IgM và IgG hình thành, do đó là dấu chuẩn sinh học quan trọng cho chẩn đoán sớm.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu RNA virus Dengue type 1 được lấy từ huyết thanh của 30 bệnh nhân sốt xuất huyết tại Bệnh viện Bạch Mai, Việt Nam. Mẫu được bảo quản ở -80°C và cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

• Phương pháp tách dòng gen NS1: Sử dụng kit CloneJET PCR Cloning Kit với vector pJET1.2/blunt để tách dòng gen NS1. Hai mồi PCR được thiết kế dựa trên trình tự gen NCBI, phân tích bằng phần mềm Primer3 và FastPCR.

• Xây dựng vector biểu hiện: Gen NS1 được cắt bằng enzyme giới hạn BamHI và SalI, sau đó chèn vào vector pET22b(+). Vector này có promoter T7, tín hiệu pelB và His-tag để biểu hiện protein trong E.coli BL21(DE3).

• Biểu hiện và tinh sạch protein NS1: Chủng E.coli BL21(DE3)/pET22b::NS1 được nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 μg/ml, cảm ứng biểu hiện bằng IPTG với các nồng độ khác nhau (0,05-1,5 mM). Protein được tinh sạch bằng sắc ký ái lực dựa trên His-tag.

• Phân tích protein: SDS-PAGE và Western blot được sử dụng để xác định kích thước và tính đặc hiệu của protein NS1 tái tổ hợp.

• Phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh: Protein NS1 tái tổ hợp được sử dụng để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu virus Dengue trong huyết thanh bệnh nhân.

• Timeline nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian 12 tháng, từ tháng 1/2017 đến tháng 12/2017, bao gồm các giai đoạn tách dòng gen, xây dựng vector, biểu hiện protein, tinh sạch và thử nghiệm sinh phẩm.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tách dòng gen NS1 thành công: Gen NS1 dài 1056 nucleotide được khuếch đại bằng RT-PCR từ mẫu RNA virus Dengue type 1. Kết quả điện di gel agarose cho thấy băng DNA đặc hiệu 1056 bp rõ ràng, phù hợp với kích thước dự kiến. Tỷ lệ thành công tách dòng đạt khoảng 90% trên tổng số mẫu thử.

2. Xây dựng vector biểu hiện pET22b::NS1 hiệu quả: Sau khi cắt bằng enzyme BamHI và SalI, gen NS1 được chèn thành công vào vector pET22b(+). Kiểm tra bằng PCR và cắt enzyme giới hạn xác nhận sự hiện diện của gen NS1 trong plasmid. Giải trình tự xác nhận trình tự gen không có đột biến, tương đồng trên 99% với trình tự tham chiếu trên NCBI.

3. Biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp trong E.coli: SDS-PAGE cho thấy protein NS1 có kích thước khoảng 46 kDa, phù hợp với kích thước monomer NS1. Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng His-tag xác nhận protein biểu hiện đúng mục tiêu. Nồng độ IPTG 0,5 mM và nhiệt độ 25°C được xác định là điều kiện tối ưu cho biểu hiện protein với mật độ quang OD600 đạt 0,8.

4. Tinh sạch protein NS1 đạt hiệu quả cao: Protein NS1 được tinh sạch bằng sắc ký ái lực Ni-NTA với độ tinh khiết trên 90%, lượng protein thu được khoảng 15 mg/lít môi trường nuôi cấy. Protein tinh sạch giữ được tính đặc hiệu và cấu trúc kháng nguyên tương tự NS1 tự nhiên.

5. Ứng dụng protein NS1 trong phát triển que thử chẩn đoán nhanh: Que thử sắc ký miễn dịch dựa trên protein NS1 tái tổ hợp cho kết quả phát hiện kháng thể IgM trong huyết thanh bệnh nhân với độ nhạy 92,8% và độ đặc hiệu 98,4% so với phương pháp RT-PCR. Thời gian cho kết quả nhanh, dưới 30 phút, phù hợp với điều kiện thực tế tại Việt Nam.

Thảo luận kết quả

Kết quả tách dòng và biểu hiện protein NS1 tái tổ hợp phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, khẳng định tính khả thi của việc sử dụng E.coli BL21(DE3) và vector pET22b(+) trong biểu hiện protein virus Dengue. Việc tối ưu hóa điều kiện cảm ứng IPTG và nhiệt độ giúp tăng hiệu suất biểu hiện, giảm protein thể vùi, nâng cao chất lượng protein tinh sạch.

Protein NS1 tái tổ hợp giữ được cấu trúc và tính kháng nguyên tương tự NS1 tự nhiên, điều này được chứng minh qua phản ứng Western blot và thử nghiệm miễn dịch với huyết thanh bệnh nhân. Điều này cho thấy protein có thể ứng dụng hiệu quả trong phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh.

So với các phương pháp chẩn đoán truyền thống như RT-PCR, ELISA IgM/IgG, que thử dựa trên NS1 tái tổ hợp có ưu điểm về thời gian, chi phí và khả năng phát hiện sớm trong giai đoạn đầu nhiễm virus. Kết quả nghiên cứu phù hợp với báo cáo của WHO và các nghiên cứu trước đây về vai trò của NS1 trong chẩn đoán SXHD.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ SDS-PAGE thể hiện băng protein NS1, biểu đồ Western blot khẳng định tính đặc hiệu, và bảng so sánh độ nhạy, độ đặc hiệu của que thử với các phương pháp chuẩn. Các kết quả này góp phần quan trọng trong việc phát triển sinh phẩm chẩn đoán nhanh, hỗ trợ công tác phòng chống dịch SXHD tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển và thương mại hóa bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh dựa trên protein NS1: Tập trung hoàn thiện quy trình sản xuất protein NS1 tái tổ hợp và chế tạo que thử sắc ký miễn dịch, nhằm giảm chi phí sản xuất và tăng khả năng tiếp cận thị trường trong vòng 12-18 tháng. Chủ thể thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, các doanh nghiệp công nghệ sinh học.

2. Đào tạo nhân viên y tế và kỹ thuật viên xét nghiệm: Tổ chức các khóa đào tạo về sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh NS1 tại các bệnh viện và trung tâm y tế, nâng cao năng lực chẩn đoán sớm SXHD trong 6 tháng tới. Chủ thể thực hiện: Bộ Y tế phối hợp với các trường đại học và viện nghiên cứu.

3. Mở rộng nghiên cứu ứng dụng protein NS1 trong phát triển vaccine và thuốc kháng virus: Tiếp tục nghiên cứu sâu về cấu trúc và chức năng của NS1 để phát triển vaccine tiểu đơn vị và thuốc điều trị, dự kiến trong 3-5 năm tới. Chủ thể thực hiện: Các viện nghiên cứu công nghệ sinh học và dược phẩm.

4. Tăng cường giám sát dịch tễ và ứng dụng sinh phẩm chẩn đoán nhanh trong cộng đồng: Áp dụng rộng rãi bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh NS1 tại các vùng dịch trọng điểm nhằm phát hiện sớm và kiểm soát dịch bệnh hiệu quả trong vòng 1 năm. Chủ thể thực hiện: Cục Y tế dự phòng, các trung tâm y tế địa phương.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành công nghệ sinh học, y sinh học: Nghiên cứu cung cấp kiến thức chuyên sâu về biểu hiện protein tái tổ hợp, kỹ thuật sinh học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

2. Bác sĩ và kỹ thuật viên xét nghiệm tại bệnh viện, trung tâm y tế: Tham khảo để hiểu rõ về cơ sở khoa học và ứng dụng thực tiễn của protein NS1 trong chẩn đoán sớm SXHD, nâng cao hiệu quả điều trị.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Tài liệu hữu ích cho phát triển sản phẩm sinh phẩm chẩn đoán nhanh, vaccine và thuốc kháng virus dựa trên protein NS1.

4. Cơ quan quản lý y tế và phòng chống dịch bệnh: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng chính sách, chiến lược giám sát và kiểm soát dịch SXHD hiệu quả, đặc biệt tại các vùng dịch trọng điểm.

Câu hỏi thường gặp

1. Protein NS1 có vai trò gì trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue?
   Protein NS1 xuất hiện sớm trong huyết thanh bệnh nhân, trước khi kháng thể IgM và IgG hình thành, giúp phát hiện sớm virus Dengue trong giai đoạn đầu nhiễm. Ví dụ, xét nghiệm ELISA NS1 có độ nhạy lên đến 92,8%.

2. Tại sao chọn E.coli BL21(DE3) để biểu hiện protein NS1?
   E.coli BL21(DE3) có hệ thống promoter T7 mạnh, khả năng biến nạp cao và ổn định, giúp biểu hiện protein tái tổ hợp với hiệu suất cao và dễ dàng tinh sạch nhờ His-tag.

3. Que thử phát hiện nhanh dựa trên protein NS1 hoạt động như thế nào?
   Que thử sử dụng nguyên lý sắc ký miễn dịch, protein NS1 gắn với hạt nano vàng tạo phức hợp với kháng thể IgM/IgG trong mẫu huyết thanh, tạo vạch màu hồng tía báo hiệu kết quả dương tính.

4. Ưu điểm của phương pháp chẩn đoán dựa trên NS1 so với RT-PCR là gì?
   Phương pháp NS1 nhanh hơn, chi phí thấp hơn, không đòi hỏi thiết bị phức tạp, phù hợp với điều kiện phòng xét nghiệm tại Việt Nam, trong khi RT-PCR có độ nhạy cao nhưng chi phí và kỹ thuật phức tạp.

5. Protein NS1 có thể ứng dụng trong phát triển vaccine không?
   Có, NS1 là mục tiêu tiềm năng cho vaccine tiểu đơn vị vì có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch bảo vệ, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng NS1 tái tổ hợp để tạo miễn dịch bảo vệ ở mô hình động vật.

Kết luận

• Đã tách dòng và biểu hiện thành công gen mã hóa protein NS1 của virus Dengue type 1 trong E.coli BL21(DE3) với hiệu suất cao và độ tinh khiết trên 90%.
• Protein NS1 tái tổ hợp giữ được cấu trúc và tính kháng nguyên tương tự protein NS1 tự nhiên, phù hợp cho ứng dụng phát triển sinh phẩm chẩn đoán.
• Que thử sắc ký miễn dịch dựa trên protein NS1 cho kết quả phát hiện kháng thể IgM với độ nhạy 92,8% và độ đặc hiệu 98,4%, thời gian nhanh dưới 30 phút.
• Nghiên cứu góp phần quan trọng trong việc phát triển bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh SXHD phù hợp với điều kiện Việt Nam, hỗ trợ công tác phòng chống dịch hiệu quả.
• Đề xuất tiếp tục hoàn thiện sản phẩm, đào tạo nhân lực và mở rộng nghiên cứu ứng dụng NS1 trong vaccine và thuốc kháng virus trong giai đoạn 1-5 năm tới.

Hành động tiếp theo: Đẩy mạnh hợp tác với các doanh nghiệp công nghệ sinh học để thương mại hóa bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh NS1, đồng thời triển khai đào tạo và ứng dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế.