Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước echinochloa crus galli đối với hoạt chất quinclorac tại đồng bằng sông cửu long

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước Echinochloa crus-galli đối với hoạt chất quinclorac tại Đồng bằng sông Cửu Long.

• Tác giả: Le Duy
• Người hướng dẫn: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Minh Chon
• Trường học: Can Tho University
• Chuyên ngành: Plant Protection
• Đề tài: Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước Echinochloa crus-galli đối với quinclorac tại Đồng bằng sông Cửu Long
• Loại tài liệu: Doctoral dissertation
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Can Tho

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• TÓM TẮT
• SUMMARY
• STATEMENT ON ACADEMIC INTEGRITY
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Problem statement
• 1.2. Targets of dissertation
• 1.3. Studied objectives and limitation of the dissertation
• 1.4. Major research topics of the dissertation
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Conceptual framework diagram
• 2.2. Survey on farmer practice in rice cultivation and weed management in the Mekong Delta
• 2.3. Classification of the collected Echinochloa spp. populations based on plant characteristics
• 2.4. Evaluate the herbicide-resistance level in collected Echinochloa spp. populations to 3 active ingredients of bispyribac-sodium, penoxsulam and quinclorac by dose-response screening method
• 2.5. Evaluate the efficacy of rinskor as new herbicide in herbicide resistance barnyardgrass populations
• 2.6. Compare the activity of enzyme β-cyanoalanine (CAS) in quinclorac-susceptible and quinclorac-resistant barnyardgrass plant to study biochemical mechanism of quinclorac-resistance in barnyardgrass
• 2.7. Identify genetic variation among quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible Echinochloa crus-galli populations in the Mekong Delta
• 2.8. Measure mRNA expression level of CAS gene in quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible barnyardgrass
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Herbicide application practice and weed management in rice field at Mekong Delta
• 3.1.1. Rice cultivation practice
• 3.1.2. Important weed species in the rice field at seven provinces of the Mekong Delta
• 3.1.3. Weed management by hand weeding
• 3.1.4. Weed escaped controlling and the cost on weed management in the Mekong Delta
• 3.2. Morphology and distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.2.1. Correlation between biological characteristics of Echinochloa plants
• 3.2.2. Distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.3. Herbicide resistant Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.3.1. Distribution of herbicide resistant Echinochloa spp. in 7 provinces of Mekong Delta
• 3.3.2. Herbicide resistance in three weed groups
• 3.3.3. The solo resistance and multiple resistance in Echinochloa spp.
• 3.3.4. Evaluate multiple herbicide resistance level by resistance score
• 3.3.5. Impact of field size to resistance score under different water management conditions
• 3.3.6. Correlation between field size and hand weeding
• 3.3.7. The impact of hand-weeding to herbicide resistance of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.4. Weed control efficacy of rinskor in Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.4.1. Control efficacy of rinskor as a new herbicide against three Echinochloa spp. groups collected in the Mekong Delta
• 3.4.2. Control efficacy of rinskor as new herbicide against Echinochloa spp. populations collected in Mekong Delta
• 3.4.3. Correlation between resistance level of bispyribac, penoxsulam and quinclorac
• 3.4.4. Efficacy of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in susceptible E. crus-galli compared to resistant plants
• 3.4.5. Efficacy of rinskor for control of susceptible or resistant barnyardgrass to bispyribac, penoxsulam and quinclorac
• 3.5. Biodiversity study by RAPD analysis in 15 barnyardgrass populations from Vietnam and the U.
• 3.5.1. RAPD analysis of 15 barnyardgrass populations
• 3.5.2. The genetic diversity of Echinochloa crus-galli and herbicide resistance level
• 3.6. Biochemical mechanism and molecular mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass
• 3.6.1. B-CAS activity in 5 quinclorac resistant barnyardgrass populations
• 3.6.2. CAS transcript abundance in leaf tissue of five barnyardgrass populations
• 3.6.3. Biochemical and molecular mechanism of quinclorac resistance in Echinochloa crus-galli in Mekong Delta
• 4. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Echinochloa crus galli và vấn đề kháng thuốc tại Đồng bằng sông Cửu Long

Echinochloa crus-galli, còn được gọi là cỏ lồng vực nước, là một loài cỏ dại phổ biến trong các cánh đồng lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Loài cỏ này đã phát triển khả năng kháng thuốc đối với nhiều loại thuốc diệt cỏ, đặc biệt là quinclorac, một loại thuốc thuộc nhóm auxin tổng hợp. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích tính kháng và cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli đối với quinclorac, nhằm cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý cỏ dại hiệu quả hơn trong nông nghiệp.

1.1. Tình hình kháng thuốc của Echinochloa crus galli

Echinochloa crus-galli đã được ghi nhận là loài cỏ dại có khả năng kháng thuốc cao, đặc biệt là đối với các loại thuốc diệt cỏ thuộc nhóm ALS và auxin tổng hợp. Nghiên cứu cho thấy, các quần thể cỏ này tại ĐBSCL có giá trị LD90 trung bình đối với bispyribac, penoxsulam và quinclorac lần lượt là 33,1; 15,1 và 550,2 g/ha. Điều này cho thấy sự cần thiết của việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc của loài cỏ này.

1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố của Echinochloa crus galli

Echinochloa crus-galli là loài cỏ dại phổ biến nhất trong ba loài Echinochloa được tìm thấy tại ĐBSCL, bao gồm Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta. Loài cỏ này có khả năng thích nghi cao với môi trường ngập nước, làm cho việc kiểm soát chúng trở nên khó khăn hơn. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự đa dạng di truyền cao trong quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự kháng thuốc phức tạp.

II. Cơ chế kháng thuốc quinclorac của Echinochloa crus galli

Nghiên cứu này tập trung vào việc làm rõ cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli đối với quinclorac. Các kết quả cho thấy, các quần thể cỏ kháng thuốc có khả năng tăng cường quá trình phiên mã và hoạt động của enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS), giúp chúng chuyển hóa và giải độc quinclorac một cách hiệu quả hơn so với các quần thể mẫn cảm.

2.1. Vai trò của enzyme β cyanoalanine synthase CAS

Enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli. Nghiên cứu cho thấy, sau khi xử lý quinclorac, các quần thể kháng thuốc có khả năng tăng cường hoạt động của enzyme CAS một cách nhanh chóng, giúp chúng chuyển hóa và giải độc quinclorac hiệu quả hơn. Điều này giải thích tại sao các quần thể kháng thuốc có khả năng sống sót cao hơn so với các quần thể mẫn cảm.

2.2. Sự biểu hiện gen CAS trong các quần thể kháng thuốc

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự biểu hiện của gen CAS trong các quần thể kháng thuốc tăng lên đáng kể sau khi xử lý quinclorac. Tuy nhiên, sau 3 ngày, mức độ biểu hiện gen này giảm về mức tương đương với đối chứng, trong khi hoạt động của enzyme CAS vẫn duy trì ở mức cao. Điều này cho thấy, cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli không chỉ phụ thuộc vào sự biểu hiện gen mà còn liên quan đến quá trình chuyển hóa enzyme.

III. Ứng dụng thực tiễn và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ làm rõ cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý cỏ dại hiệu quả hơn trong nông nghiệp. Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để phát triển các chiến lược quản lý cỏ dại bền vững, bao gồm việc sử dụng luân phiên các loại thuốc diệt cỏ và kết hợp các phương pháp kiểm soát cỏ dại khác nhau.

3.1. Chiến lược quản lý cỏ dại bền vững

Dựa trên kết quả nghiên cứu, việc sử dụng luân phiên các loại thuốc diệt cỏ có cơ chế tác động khác nhau là một chiến lược hiệu quả để ngăn chặn sự phát triển của các quần thể cỏ kháng thuốc. Ngoài ra, việc kết hợp các phương pháp kiểm soát cỏ dại như quản lý cỏ dại bằng tay và sử dụng các loại thuốc diệt cỏ mới như rinskor cũng được khuyến nghị.

3.2. Ý nghĩa đối với nông nghiệp tại Đồng bằng sông Cửu Long

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng đối với nông nghiệp tại ĐBSCL, nơi mà Echinochloa crus-galli là một trong những loài cỏ dại gây hại nghiêm trọng nhất. Việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc của loài cỏ này sẽ giúp các nhà nông có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát cỏ dại hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu thiệt hại về năng suất và chi phí sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cỏ lồng vực (Echinochloa spp.), đặc biệt là cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli (L.)), là một trong những loài cỏ dại nguy hiểm và phổ biến nhất trên các ruộng lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) cũng như trên thế giới. Do sở hữu con đường quang hợp C4, cỏ lồng vực có ưu thế cạnh tranh sinh trưởng, hấp thu dinh dưỡng và tích lũy sinh khối vượt trội so với lúa (cây C3). Cạnh tranh của cỏ dại trên ruộng lúa ngập nước có thể làm giảm 25% năng suất hạt, và trong điều kiện lúa gieo thẳng khô không được kiểm soát tốt, thiệt hại năng suất có thể lên tới 50% đến 80%. Ở giai đoạn cây con, cỏ lồng vực có đặc tính bắt chước hình thái cây lúa, gây khó khăn cho việc làm cỏ thủ công.

Biện pháp hóa học sử dụng thuốc trừ cỏ đóng vai trò chủ đạo trong quản lý cỏ dại nhờ hiệu quả kinh tế và tính khả thi trên quy mô lớn. Tuy nhiên, việc sử dụng lặp lại liên tục các hoạt chất thuốc trừ cỏ trong nhiều năm đã dẫn đến hiện tượng tiến hóa tính kháng thuốc ở cỏ lồng vực. Trên thế giới, các trường hợp cỏ lồng vực kháng thuốc thuộc nhóm ức chế enzyme Acetolactate synthase (nhóm ALS - nhóm B) và nhóm auxin tổng hợp (nhóm O) đã được ghi nhận tại nhiều quốc gia trồng lúa. Tại ĐBSCL, vùng sản xuất lúa trọng điểm của Việt Nam, việc xác định thực trạng phân bố các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc, đánh giá mức độ đa dạng di truyền và làm sáng tỏ cơ chế kháng thuốc ở mức độ hóa sinh và phân tử đối với hoạt chất quinclorac là khoảng trống nghiên cứu cấp thiết cần được giải quyết.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định các mục tiêu cụ thể sau:

1. Đánh giá biến thiên hình thái và đa dạng di truyền của các quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
2. Đánh giá mức độ kháng thuốc trừ cỏ của các quần thể cỏ lồng vực đối với ba hoạt chất phổ biến gồm bispyribac-sodium, penoxsulam và quinclorac trên ruộng lúa ĐBSCL.
3. Giải thích cơ chế hóa sinh và cơ chế phân tử của tính kháng thuốc trừ cỏ quinclorac ở loài cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Các quần thể cỏ lồng vực thuộc chi Echinochloa (Echinochloa spp.), trọng tâm là loài cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli (L.)), cùng với hoạt chất thuốc trừ cỏ thuộc nhóm ALS (bispyribac, penoxsulam), nhóm auxin tổng hợp (quinclorac), hoạt chất mới rinskor, và enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS).
• Phạm vi không gian: Ruộng lúa tại 7 tỉnh trọng điểm thuộc Đồng bằng sông Cửu Long bao gồm: Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Hậu Giang và Kiên Giang; kết hợp 2 quần thể đối chứng từ bang Arkansas, Hoa Kỳ cho phân tích di truyền.
• Phạm vi thời gian: Thu thập mẫu hạt cỏ và số liệu điều tra nông hộ từ các vụ canh tác lúa trong giai đoạn 2016 - 2018 (luận án hoàn thành năm 2018).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tổng quan tài liệu của luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu về quản lý cỏ dại và tính kháng thuốc trừ cỏ:

• Tác động cạnh tranh và sinh học của cỏ lồng vực: Moody (1988), Caton và cộng sự (1999), Chauhan (2012) ghi nhận mức suy giảm năng suất lúa từ 25% đến 50% do cỏ dại. Chu Văn Hách và cộng sự (1998) chứng minh mật độ cỏ lồng vực từ 258 đến 340 cây/m² làm giảm 63,5% đến 86,7% năng suất lúa. Hoàng Vũ Duy và cộng sự (2013) làm rõ tốc độ quang hợp và tích lũy chất khô của cỏ lồng vực cao hơn lúa ở mọi giai đoạn sinh trưởng. Maun và Barrett (1986) cho thấy cỏ lồng vực lấy đi 60 - 80% lượng đạm trong đất.
• Phân loại và tiến hóa hình thái: Dorie và McNeill (1980), Barrett và Wilson (1983), Damalas và cộng sự (2008) chỉ ra tính đa dạng hình thái phức tạp của chi Echinochloa với hơn 250 loài. Koo và cộng sự (2000) ghi nhận 3 loài cỏ lồng vực chính trên ruộng lúa châu Á gồm E. crus-galli, E. colona, và E. glabrescens.
• Cơ chế kháng thuốc ức chế ALS và ACCase: LaRossa và Schloss (1984), Fischer và cộng sự (2000), Osuna và cộng sự (2002) nghiên cứu cơ chế kháng bispyribac do đột biến đích hoặc tăng cường hoạt động của cytochrome P450 monooxygenase. Dilpreet và cộng sự (2011, 2012) xác định đột biến thay thế axit amin tại vị trí Ala122 trên chuỗi mã hóa ALS (1701 bp) và sự tham gia của cytochrome P450 giải độc penoxsulam và imazethapyr ở Arkansas và Mississippi.
• Cơ chế kháng thuốc auxin tổng hợp (Quinclorac): Grossmann và cộng sự (1993, 1995, 1998, 2000, 2010) thiết lập mô hình tác động của quinclorac: quinclorac kích thích tổng hợp ACC synthase dẫn đến tích lũy ACC, sau đó chuyển hóa thành ethylene và chất độc phụ phẩm xyanua (HCN). Ở cây lúa (Oryza sativa), enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) có hoạt tính cao giúp giải độc HCN thành β-cyanoalanine và H₂S. Yasuor và cộng sự (2012) ghi nhận Echinochloa phyllopogon kháng quinclorac tại California thông qua tăng cường hoạt tính CAS và giảm độ nhạy cảm sinh ethylene. Lovelace và cộng sự (2007) chỉ ra sự vận chuyển ¹⁴C-quinclorac không có sự khác biệt giữa dòng kháng và dòng mẫn cảm.
• Đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD: Williams và cộng sự (1990), Rutledge và cộng sự (2000) đã sử dụng chỉ thị phân tử RAPD để đánh giá biến dị di truyền ở các dòng cỏ lồng vực tại Arkansas, khẳng định các dòng kháng có nguồn gốc đa dạng từ các sự kiện đột biến độc lập.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù tính kháng thuốc ở cỏ lồng vực đã được nghiên cứu tại nhiều quốc gia, thực trạng kháng thuốc đơn và kháng đa thuốc (multiple resistance) đối với bispyribac, penoxsulam và quinclorac trên các quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL chưa được khảo sát hệ thống trên diện rộng. Đồng thời, cơ chế kháng quinclorac ở mức độ biểu hiện gen mã hóa enzyme CAS (transcript abundance) kết hợp với hoạt độ enzyme CAS trong mô lá của các dòng cỏ lồng vực bản địa tại Việt Nam chưa được định lượng và phân tích chi tiết.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung phân tích và cơ sở lý thuyết

• Lý thuyết áp lực chọn lọc và tiến hóa tính kháng: Khái niệm kháng thuốc (theo WSSA, HRAC, EPPO) được định nghĩa là khả năng di truyền tự nhiên của một số cá thể trong quần thể sống sót và sinh sản sau khi xử lý liều thuốc trừ cỏ bình thường gây chết dòng hoang dã.
• Khung phân tích cơ chế giải độc HCN: Quinclorac gây kích thích ACC synthase sinh tổng hợp ethylene và giải phóng HCN. Phản ứng giải độc diễn ra tại ty thể nhờ enzyme β-cyanoalanine synthase (β-CAS; EC 4.4.1.9): $$\text{L-cysteine} + \text{HCN} \xrightarrow{\beta\text{-CAS}} \beta\text{-cyanoalanine} + \text{H}_2\text{S}$$
• Khung phân tích đa dạng di truyền: Sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên (RAPD) để phát hiện tính đa hình DNA hệ gen không cần biết trước trình tự đích.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

1. Khảo sát tập quán canh tác và thu thập mẫu:

   • Thu thập 78 mẫu hạt cỏ lồng vực từ các ruộng lúa có nghi ngờ thoát thuốc trừ cỏ tại 7 tỉnh ĐBSCL (Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang). Mẫu hạt thu từ diện tích tối thiểu 50 - 100 m² trên ruộng, làm sạch và phơi khô.
   • Điều tra bảng câu hỏi nông hộ về kỹ thuật canh tác, cơ cấu thuốc trừ cỏ sử dụng, chi phí làm cỏ và hoạt động nhổ cỏ bằng tay.

2. Phân loại hình thái và đặc điểm sinh học:

   • Đánh giá các chỉ tiêu hình thái cây, cấu trúc phát hoa, thời gian trổ hoa, chu kỳ sinh trưởng, chiều cao cây và sinh khối thân lá khô của các mẫu thu thập.

3. Phương pháp thử nghiệm sinh học liều lượng - đáp ứng (Dose-response assay):

   • Trồng cỏ trong chậu trong nhà lưới, phun thuốc ở giai đoạn 2 - 4 lá bằng hệ thống phun chuẩn hóa.
   • Thử nghiệm dãy liều lượng (tối thiểu 6 nồng độ bao gồm liều khuyến cáo, dưới và trên khuyến cáo) cho 3 hoạt chất: bispyribac-sodium, penoxsulam, quinclorac và hoạt chất mới rinskor.
   • Xác định tỷ lệ chết, tính toán giá trị liều gây chết 90% quần thể ($LD_{90}$), hệ số kháng ($RI$) và điểm kháng thuốc (Resistance Score).

4. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD:

   • Tách chiết DNA tổng số từ 15 quần thể cỏ lồng vực (13 quần thể ĐBSCL gồm: CT-10, KG-01, TG-03, HG-06, HG-02, CT-08, HG-03, CT-04, VL-03, HG-01, CT-02, CT-01, VL-01 và 2 quần thể đối chứng từ bang Arkansas, Hoa Kỳ).
   • Sử dụng 6 đoạn mồi oligonucleotide ngẫu nhiên cho phản ứng PCR, điện di trên gel agarose để phân tích các băng đa hình và thiết lập cây phả hệ (dendrogram).

5. Đo hoạt độ enzyme β-cyanoalanine synthase (β-CAS):

   • Thu mẫu mô lá của 5 quần thể cỏ lồng vực (các dòng kháng R: Ech_03, Ech_04, Ech_05; các dòng mẫn cảm S: Ech_01, Ech_02) và cây lúa (Oryza sativa) tại thời điểm trước và sau khi xử lý quinclorac.
   • Chiết xuất protein, thực hiện phản ứng giải phóng H₂S từ L-cysteine và xyanua, đo độ hấp thụ quang phổ của phức hợp methylene blue tại bước sóng 650 Å trên đĩa 96 giếng để định lượng hoạt độ enzyme (tính theo nmol H₂S/100 µg protein/phút).

6. Định lượng mức độ biểu hiện gen CAS bằng RT-qPCR:

   • Tách chiết tổng số RNA từ mô lá ở các mốc thời gian (1 giờ và 3 ngày sau xử lý quinclorac), tổng hợp cDNA.
   • Thực hiện Real-time PCR với cặp mồi đặc hiệu gen mã hóa $\beta$-CAS và gen tham chiếu nội chuẩn $\beta$-Actin để xác định mức độ biểu hiện mRNA (CAS transcript abundance).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu (Introduction)

Chương 1 trình bày bối cảnh cạnh tranh cỏ dại trong hệ thống thâm canh lúa tại ĐBSCL, nhấn mạnh sự gia tăng của các trường hợp kháng thuốc trừ cỏ nhóm ALS (nhóm B) và nhóm auxin tổng hợp (nhóm O). Chương này thiết lập 3 mục tiêu nghiên cứu, xác định phạm vi thực hiện tại 7 tỉnh ĐBSCL trên đối tượng cỏ lồng vực, đồng thời phác thảo 7 nội dung nghiên cứu chính cùng những đóng góp cốt lõi của đề tài.

Chương 2: Tổng quan tài liệu (Literature Review)

Chương 2 tổng quan toàn diện về:

• Đặc điểm nông nghiệp ĐBSCL với diện tích tự nhiên 40.577 km², 3,96 triệu ha đất nông nghiệp, quy mô ruộng bình quân 1,29 ha/hộ, mô hình lúa 3 vụ đạt 530.000 ha vào năm 2010.
• Khái niệm cỏ dại, tính kháng thuốc (phân biệt giữa resistance và tolerance), các cơ chế kháng thuốc tại điểm đích (ACCase, ALS, PSII) và ngoài điểm đích (tăng cường hoạt tính Cytochrome P450 monooxygenase, Glutathione S-transferase, protein vận chuyển màng ABC transporters).
• Lịch sử và đặc tính hóa học, cơ chế tác động của ba hoạt chất chính: bispyribac-sodium, penoxsulam, quinclorac và mô hình giải độc xyanua qua trung gian enzyme β-CAS.
• Các phương pháp thử nghiệm tính kháng: thử nghiệm chậu cây trong nhà lưới, đĩa petri, huỳnh quang diệp lục, tích lũy shikimate, đồng vị phóng xạ (¹⁴C) và kỹ thuật sinh học phân tử (RAPD, RT-qPCR).
• Chiến lược quản lý tính kháng cỏ dại: giảm phát tán hạt, luân canh cây trồng, luân phiên và hỗn hợp thuốc trừ cỏ khác cơ chế tác động.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (Materials and Methods)

Chương 3 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm:

• Sơ đồ khung phân tích nghiên cứu (Conceptual framework diagram).
• Quy trình điều tra 71 ruộng lúa và thu thập 78 mẫu hạt cỏ lồng vực tại 7 tỉnh.
• Phương pháp đánh giá hình thái, chu kỳ sinh trưởng và khối lượng khô thân lá.
• Quy trình sàng lọc liều lượng - đáp ứng trong nhà lưới xác định giá trị $LD_{90}$ đối với bispyribac, penoxsulam, quinclorac và hoạt chất mới rinskor.
• Danh mục 6 đoạn mồi RAPD, các bước luân nhiệt phản ứng PCR và quy trình phân tích cụm (cluster analysis).
• Trình tự mồi RT-qPCR phân tích biểu hiện gen $\beta$-CAS và $\beta$-Actin, phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 650 Å xác định hoạt độ enzyme CAS giải phóng H₂S.

Chương 4: Kết quả và thảo luận (Results and Discussion)

4.1 Tập quán sử dụng thuốc trừ cỏ và quản lý cỏ dại tại ĐBSCL

• Khảo sát cho thấy chi phí thuốc bảo vệ thực vật chiếm 17 - 20% tổng chi phí sản xuất mỗi vụ.
• Cỏ lồng vực là loài cỏ dại trốn thoát thuốc phổ biến nhất sau các đợt phun xịt, đòi hỏi nông dân phải tiến hành nhổ cỏ bổ sung bằng tay.
• Có mối tương quan giữa quy mô ruộng lúa, điều kiện quản lý nước và hoạt động làm cỏ bằng tay đối với mức độ tích lũy áp lực kháng thuốc của cỏ lồng vực.

4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của cỏ lồng vực

• Phân tích hình thái chia các mẫu thu thập thành 3 nhóm chính tương ứng với 3 loài tại ĐBSCL: Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta.
• Loài cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) chiếm ưu thế phân bố rộng rãi nhất trên các cánh đồng được khảo sát.
• Ghi nhận tương quan chặt giữa chiều cao cây với khối lượng khô thân lá, cũng như giữa thời gian xuất hiện phát hoa với tổng chu kỳ sinh trưởng của 3 nhóm cỏ lồng vực.

4.3 Thực trạng kháng thuốc trừ cỏ của cỏ lồng vực tại 7 tỉnh ĐBSCL

• Khẳng định sự tồn tại của các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc đơn và kháng đồng thời nhiều nhóm thuốc (kháng đa thuốc).
• Giá trị liều gây chết $LD_{90}$ trung bình của các quần thể cỏ lồng vực được xác định cụ thể trong bảng số liệu tổng hợp dưới đây:

Hoạt chất thuốc trừ cỏ	Nhóm cơ chế tác động (MoA)	Giá trị $LD_{90}$ trung bình (g a.i/ha)
Bispyribac-sodium	Ức chế ALS (Nhóm B)	33,1
Penoxsulam	Ức chế ALS (Nhóm B)	15,1
Quinclorac	Auxin tổng hợp (Nhóm O)	550,2

• Đánh giá chỉ số điểm kháng (Resistance Score) cho thấy mức độ kháng thuốc thay đổi tùy theo tỉnh, quy mô đồng ruộng và chế độ quản lý nước.

4.4 Hiệu lực trừ cỏ của hoạt chất mới Rinskor

• Thử nghiệm trên các quần thể cỏ lồng vực đã tiến hóa tính kháng đối với bispyribac, penoxsulam và quinclorac trong điều kiện nhà lưới.
• Kết quả khẳng định: tất cả các quần thể kháng thuốc thuộc nhóm B và nhóm O nêu trên đều mẫn cảm hoàn toàn với hoạt chất rinskor ở các mức liều thử nghiệm, không ghi nhận hiện tượng kháng chéo.

4.5 Đa dạng di truyền của các quần thể qua phân tích RAPD

• Sử dụng 6 đoạn mồi ngẫu nhiên trên 15 quần thể cỏ lồng vực thu nhận tổng cộng 46 băng DNA đa hình (polymorphic bands).
• Phân tích cụm (cây phả hệ dendrogram) phân tách 15 quần thể thành 2 nhóm chính với khoảng cách di truyền dao động trong khoảng từ 0,09 đến 0,39.
• Kết quả chứng minh mức độ đa dạng di truyền rất cao trong các quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL; nhiều loài có sự tương đồng hình thái lớn nhưng phân ly rõ ràng về mặt di truyền học.

4.6 Cơ chế hóa sinh và phân tử của tính kháng Quinclorac

• Hoạt độ enzyme β-CAS:
  • Ở cây lúa (Oryza sativa), hoạt tính enzyme CAS duy trì ở mức rất cao, giải thích tính chống chịu tự nhiên của lúa đối với quinclorac.
  • Ở cỏ lồng vực, các quần thể kháng (R) có hoạt tính enzyme CAS chuyển hóa giải độc xyanua cao hơn có ý nghĩa so với các quần thể mẫn cảm (S).
• Mức độ biểu hiện phiên mã gen CAS (RT-qPCR):
  • Tại thời điểm 1 giờ sau khi xử lý quinclorac: Mức độ dồi dào của bản phiên mã gen CAS (CAS transcript abundance) giảm mạnh ở các quần thể kháng (Ech_03, Ech_04, Ech_05) và cây lúa (Oryza sativa), trong khi không thay đổi ở các quần thể mẫn cảm (Ech_01, Ech_02). Hiện tượng này phản ánh việc các dòng kháng đẩy nhanh quá trình sử dụng mRNA để tổng hợp enzyme protein CAS nhằm tăng tốc độ giải độc tế bào.
  • Tại thời điểm 3 ngày sau khi xử lý quinclorac: Mức phiên mã mRNA của gen CAS ở các quần thể kháng trở về trạng thái bình thường, không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý thuốc. Tuy nhiên, hoạt độ protein enzyme CAS vẫn duy trì ở mức cao hơn rõ rệt so với đối chứng và quần thể mẫn cảm S.

Chương 5: Kết luận và khuyến nghị (Conclusions and Recommendations)

Chương 5 tóm tắt các kết quả then chốt về sự phân bố của 3 loài cỏ lồng vực, hiện trạng kháng thuốc đối với 3 hoạt chất, cơ chế hoạt động của enzyme β-CAS và đề xuất giải pháp quản lý cỏ dại tích hợp.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận

1. Xác nhận và làm sáng tỏ cơ sở hóa sinh và phân tử của tính kháng thuốc trừ cỏ quinclorac ở loài cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) tại ĐBSCL: cơ chế kháng liên quan trực tiếp đến khả năng huy động nhanh chóng bản phiên mã gen mã hóa $\beta$-CAS trong vòng 1 giờ đầu để gia tăng hoạt độ enzyme $\beta$-CAS giải độc chất độc xyanua sinh ra do tác động của quinclorac.
2. Cung cấp dữ liệu di truyền học thông qua chỉ thị phân tử RAPD (6 mồi, 46 băng đa hình, khoảng cách di truyền 0,09 - 0,39), khẳng định mức độ đa dạng di truyền cao giữa các quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL và phân định sự khác biệt giữa các loài có hình thái tương đồng.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

1. Cung cấp bộ dữ liệu thực trạng về mức độ kháng thuốc đơn và kháng đa thuốc của cỏ lồng vực đối với bispyribac-sodium, penoxsulam và quinclorac tại 7 tỉnh trọng điểm trồng lúa ở ĐBSCL với các giá trị $LD_{90}$ cụ thể (33,1 g/ha cho bispyribac, 15,1 g/ha cho penoxsulam và 550,2 g/ha cho quinclorac).
2. Chứng minh hiệu lực diệt trừ của hoạt chất thuốc trừ cỏ mới rinskor đối với các quần thể cỏ lồng vực đã kháng các nhóm thuốc cũ, mở ra giải pháp hóa học thay thế hiệu quả.
3. Đề xuất giải pháp quản lý tính kháng cỏ dại thông qua điều chỉnh tập quán canh tác: kết hợp luân phiên thuốc trừ cỏ có cơ chế tác động khác nhau, áp dụng chế độ quản lý nước hợp lý, và tăng cường làm cỏ tay để triệt tiêu các cá thể cỏ trốn thoát thuốc nhằm ngăn chặn tích lũy hạt cỏ kháng trong ngân hàng hạt đất.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Phạm vi khảo sát thực địa giới hạn tại 7 tỉnh thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long.
• Phân tích cơ chế giải độc tập trung chuyên sâu vào con đường enzyme β-cyanoalanine synthase đối với hoạt chất quinclorac, chưa phân tích toàn diện các đột biến điểm đích trên chuỗi gen mã hóa enzyme ALS của các dòng kháng bispyribac và penoxsulam thu thập tại ĐBSCL.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng phạm vi điều tra và lập bản đồ phân bố cỏ lồng vực kháng thuốc trên toàn bộ các tỉnh còn lại của vùng ĐBSCL và các vùng trồng lúa khác tại Việt Nam.
• Giải trình tự hoàn chỉnh gen mã hóa ALS và enzyme liên quan để kiểm tra đột biến điểm đích ở các quần thể kháng thuốc nhóm B.
• Nghiên cứu động thái biểu hiện của các họ gen giải độc khác như Cytochrome P450 monooxygenase và Glutathione S-transferase trên các dòng cỏ lồng vực kháng đa thuốc.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh và học viên ngành Bảo vệ thực vật, Khoa học Cây trồng: Cung cấp quy trình phương pháp luận chuẩn mực từ sàng lọc sinh học liều lượng - đáp ứng ($LD_{90}$), phân tích di truyền quần thể bằng chỉ thị phân tử (RAPD), đến kỹ thuật định lượng hoạt độ enzyme quang phổ và định lượng phiên mã gen bằng RT-qPCR.
• Đối với giảng viên và cơ sở đào tạo nông nghiệp: Cung cấp tài liệu tham khảo chi tiết về cơ chế tác động và cơ chế kháng thuốc trừ cỏ chọn lọc trên cây lúa và cỏ dại một lá mầm.
• Đối với cán bộ khuyến nông và nhà quản lý bảo vệ thực vật: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng quy trình quản lý tính kháng cỏ dại tích hợp (IWM), khuyến cáo danh mục luân phiên hoạt chất và ngăn ngừa nguy cơ bùng phát cỏ lồng vực kháng thuốc trên đồng ruộng.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã khảo sát bao nhiêu mẫu cỏ lồng vực và tại những địa phương nào?

Luận án đã thu thập 78 mẫu hạt cỏ lồng vực từ các ruộng lúa tại 7 tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm: Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Hậu Giang và Kiên Giang.

2. Các loài cỏ lồng vực nào được định danh chính tại ĐBSCL trong nghiên cứu?

Nghiên cứu hình thái học đã xác định 3 nhóm chính tương ứng với 3 loài cỏ lồng vực tại ĐBSCL gồm: Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta, trong đó cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) là loài phổ biến nhất.

3. Giá trị liều gây chết $LD_{90}$ trung bình của các loại thuốc trừ cỏ được ghi nhận là bao nhiêu?

Giá trị $LD_{90}$ trung bình được xác định đối với bispyribac là 33,1 g a.i/ha; đối với penoxsulam là 15,1 g a.i/ha; và đối với quinclorac là 550,2 g a.i/ha.

4. Hoạt chất thuốc trừ cỏ mới Rinskor có hiệu lực đối với các dòng cỏ lồng vực kháng thuốc không?

Có. Kết quả thử nghiệm trong nhà lưới cho thấy các quần thể cỏ lồng vực đã phát triển tính kháng đối với bispyribac, penoxsulam và quinclorac đều hoàn toàn mẫn cảm với hoạt chất rinskor.

5. Biểu hiện phiên mã gen CAS và hoạt độ enzyme β-CAS ở quần thể kháng quinclorac diễn ra như thế nào?

Ở mốc 1 giờ sau khi xử lý quinclorac, các quần thể kháng (R) đẩy nhanh quá trình sử dụng bản phiên mã mRNA của gen CAS để chuyển hóa thành protein enzyme β-CAS với tốc độ nhanh hơn hẳn quần thể mẫn cảm (S). Đến mốc 3 ngày sau xử lý, mức mRNA của gen CAS trở lại bình thường so với đối chứng, nhưng hoạt độ enzyme β-CAS vẫn duy trì ở mức rất cao để tiếp tục giải độc HCN sinh ra từ tác động của quinclorac.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Duy đã cung cấp bức tranh toàn diện về thực trạng phân bố, đặc tính hình thái và mức độ đa dạng di truyền cao của các quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) tại 7 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Đề tài đã khẳng định sự hiện diện của các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc nhóm ức chế ALS (bispyribac, penoxsulam) và nhóm auxin tổng hợp (quinclorac), đồng thời chứng minh hiệu lực mẫn cảm của hoạt chất mới rinskor. Điểm đóng góp khoa học quan trọng nhất của luận án là làm sáng tỏ cơ chế kháng quinclorac ở cấp độ hóa sinh và phân tử thông qua sự gia tăng nhanh chóng hoạt độ enzyme β-cyanoalanine synthase và động thái điều hòa phiên mã gen CAS, tạo tiền đề vững chắc cho việc xây dựng các chiến lược quản lý tính kháng cỏ dại bền vững trong sản xuất lúa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING CAN THO UNIVERSITY LE DUY STUDY ON THE RESISTANCE MECHANISM OF BARNYARDGRASS (Echinochloa crus-galli (L.) TO QUINCLORAC IN THE MEKONG DELTA OF VIETNAM DOCTORAL DISSERTATION IN PLANT PROTECTION SUPERVISOR Assoc. NGUYEN MINH CHON 2018 ACKNOWLEDGEMENT I appreciate all the support from my dissertation supervisor Associate Professor Dr. Nguyen Minh Chon, Deputy Director of Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University, and my mentor Dr. Mann, Research Fellow of Dow AgroSciences, Dr.

Chon and Dr. Mann are the two scientists who have been restlessly supporting my career and always provide the valuable advice for this dissertation. I am grateful to all of all fellows and friends with whom I have worked together in this projects. I do appreciate Mr.

Nguyen Tan Thuan and Ms. Tran Thi Lai who helped on the seed collections and the data collection, also Mr. Ngo Thanh Phu who greatly helps to format the document. Cicchillo, Staci, Dave, Debbie and Bill of Discovery Center, Dow AgroSciences, the dissertation will never be done without your expertise, my sincere appreciation to all of you.

This dissertation would not have been done without Dr. Masters and Sir. Your behind the scene support are unmeasurable. And I would never be able to accomplish my goals without my family.

Le Duy i TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu về tính kháng thuốc cỏ của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) trên ruộng lúa, 78 mẫu hạt cỏ lồng vực đã được sưu tập từ 7 tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Các nghiên cứu trong luận án tìm thấy các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc cỏ thuộc nhóm ALS (bispyribac và penoxsulam) và nhóm thuốc cỏ auxin tổng hợp (quinclorac), giá trị LD90 trung bình của bispyribac, penoxsulam và quinclorac lần lượt là 33,1; 15,1 và 550,2 g/ha. Kết quả thử nghiệm của thuốc trừ cỏ rinskor trên các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc cho thấy các quần thể kháng thuốc trên đều mẫn cảm với rinskor. Kết quả phân tích kiểu hình cỏ lồng vực trong luận văn cho thấy có 3 nhóm cỏ chính tương ứng với 3 loài cỏ lồng vực tại ĐBSCL là Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta, trong đó cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) là loài phổ biến nhất.

Nhằm làm rõ hơn về đa dạng di truyền trong quần thể cỏ, phương pháp Random amplified polymorphic DNA (RAPD) đã được dùng để phân tích di truyền của 13 quần thể tại Việt Nam và 2 quần thể cỏ tại Mỹ. Kết quả cho thấy 6 đoạn mồi oligonucleotide cho kết quả 46 băng đa hình trong 15 quần thể, khoảng cách di truyền của các quần thể trong cây phả hệ là 0,09 đến 0,39. Kết quả của phân tích di truyền bằng phương pháp RAPD giúp khẳng định mức độ đa dạng di truyền cao trong quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL, nhiều loài bị nhầm lẫn với nhau do rất giống nhau về kiểu hình. Nhằm làm rõ cơ chế kháng thuốc quinclorac của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), nghiên cứu đã tập trung tìm hiểu mức độ phiên mã của gen và mức độ hoạt động của enzym β-cyanoalanine synthase (CAS) trong lá của 5 quần thể cỏ và lúa sau khi xử lý thuốc.

Kết quả cho thấy ở thời điểm 1 giờ sau khi phun quinclorac, các quần thể kháng thuốc (R) có thể đẩy nhanh quá trình phiên mã và chuyển hóa thành enzyme CAS, tốc độ của quá trình này nhanh hơn so với các quần thể mẫn cảm (S). Ở thời điểm 3 ngày sau xử lý , mức độ phiên mã của gene CAS trong các quần thể R giảm về mức khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng, tuy nhiên mức độ hoạt động của enzyme CAS vẫn ở mức cao so với đối chứng và quần thể S. Từ khóa: cỏ lồng vực, cyanoalanide synthase, kháng thuốc cỏ, RAPD, ii SUMMARY The aim of this dissersation was to study the herbicide resistance of the barnyardgrass (Echinochloa spp.) in 7 provinces of the Mekong Delta of Vietnam, seventy-eight seed samples of Echinochloa spp. collected from rice field for the study.

The results found the ALS-resistant and synthetic auxin-resistant E. crus-galli were confirmed at several locations in the Mekong Delta. The average LD90 value of bispyribac, penoxsulam and quinclorac for assessed weed populations was 33. The new herbicide rinskor was tested in weed populations exhibited resistance to current herbicides, results showed that the Echinochloa populations resistant to bispyribac, penoxsulam and quinclorac were susceptible to the rinskor under greenhouse test.

The morphology analysis indicated there are 3 main groups that corresponding to 3 species of Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides and Echinochloa erecta found in Mekong Delta, the Echinochloa crus-galli was the most popular species identified in the study, to extend the study, we used random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis and greenhouse testing to study the genetic diversity of 15 Echinochloa populations in the Mekong Delta, Vietnam, and the state of Arkansas, U. Six oligonucleotide primers produced 46 bands were polymorphic among the 15 populations. The cluster analysis separated the 15 populations into 2 main clusters with the genetic distances within the clusters ranging from 0. The results of RAPD are useful to confirm the high diversity of Echinochloa spp.

populations in Mekong Delta of Vietnam, many Echinochloa species with similar morphology could be confused with the others. To focus on the mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass (Echinochloa crus-galli), the research have investigated the transcript and activity of enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) in leaf tissue of 5 barnyardgrass populations and rice. One hour post quinclorac treatment, R populations were able to rapidly utilize CAS transcript to possibly fuel increased CAS protein activity, this process is significantly higher than the process in S populations. Three days following quinclorac treatment, the utilization effect on CAS transcript levels had ceased, however, CAS protein activity remained higher in every population compared to non-treated controls and S populations.

Keywords: Echinochloa, cyanoalanine synthase, Herbicide resistance, RAPD iii STATEMENT ON ACADEMIC INTEGRITY The results presented in this dissertation is the sole effort of the author, except where explicitly stated. All references related to the studies are acknowledged and properly cited. All of data and research results in this document are not published in publications of any different authors.D Student iv TABLE OF CONTENTS Page SUMMARY. iii TABLE OF CONTENTS .2 Targets of dissertation .3 Studied objectives and limitation of dissertation .4 Major research of dissertation .5 Contributions of dissertation .1 Overview of the Mekong Delta in Vietnam and rice cultivation .2 Definitions of weed and herbicide resistance .3 Overview of Echinochloa spp.

in the rice field. Herbicide for barnyardgrass control .1 Overview of herbicidal active ingredient bispyribac .2 Overview of herbicidal active ingredient penoxsulam .3 Overview of herbicidal active ingredient quinclorac .5 Herbicide resistance and testing methods .1 The importance of herbicide resistance management.2 Target site resistance .3 Non target site resistance .4 Multiple herbicide resistance .5 Popular testing methods for herbicide resistance .6 Herbicide resistance management strategy .1 Minimize weed seed dispersal .3 Herbicide rotation and herbicide mixture .7 Reported mechanism of herbicide resistant barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) .1 Herbicide resistance research in Echinochloa spp.2 Enhancement of β-CAS synthase (detoxification of cyanide) in quinclorac resistance in Echinochloa spp.3 Modification in the transduction pathway of auxin reception-signal in R and S Echinochloa plant .4 Other factors associated to the resistance mechanisms to quinclorac in barnyardgrass .5 Herbicide resistance via pollen mediated gene flow in barnyardgrass .37 MATERIALS AND METHODS .1 Conceptual framework diagram .1 Survey on farmer practice in rice cultivation and weed management in the Mekong Delta .2 Classification of the collected Echinochloa spp. populations based on plant characteristics.3 Evaluate the herbicide-resistance level in collected Echinochloa spp. populations to 3 active ingredients of bispyribac-sodium, penoxsulam and quinclorac by dose-response screening method .4 Evaluate the efficacy of rinskor as new herbicide in herbicide resistance barnyardgrass populations .5 Compare the activity of enzyme β-cyanoalanine (CAS) in quinclorac- susceptible and quinclorac-resistant barnyargrass plant to study biochemical mechanism of quinclorac-resistance in barnyardgrass .6 Identify genetic variation among quinclorac-resistant and quinclorac- susceptible Echinochloa crus-galli populations in the Mekong Delta .7 Measure mRNA expression level of CAS gene in quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible barnyardgrass .57 RESULTS AND DISCUSSION .1 Herbicide application practice and weed management in rice field at Mekong Delta.1 Rice cultivation practice .2 Important weed species in the rice field at seven provinces of the Mekong Delta .3 Weed management by hand weeding .4 Weed escaped controlling and the cost on weed management in the Mekong Delta .2 Morphology and distribution of Echinochloa spp.

in the Mekong Delta .2 Correlation between biological characteristics of Echinochloa plants.3 Distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta .3 Herbicide resistant Echinochloa spp. in the Mekong Delta .1 Distribution of herbicide resistant Echinochloa spp. in 7 provinces of Mekong Delta .2 Herbicide resistance in three weed groups .3 The solo resistance and multiple resistance in Echinochloa spp.4 Evaluate multiple herbicide resistance level by resistance score .5 Impact of field size to resistance score under different water management conditions .6 Correlation between field size and hand weeding .7 The impact of hand-weeding to herbicide resistance of Echinochloa spp.

in the Mekong Delta.4 Weed control efficacy of rinskor in Echinochloa spp. in the Mekong Delta .1 Control efficacy of rinskor as a new herbicide against three Echinochloa spp. groups collected in the Mekong Delta .2 Control efficacy of rinskor as new herbicide against Echinochloa spp. populations collected in Mekong Delta .3 Correlation between resistance level of bispyribac, penoxsulam and quinclorac .4 Efficacy of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in susceptible E.

crus-galli compared to resistant plants .5 Efficacy of rinskor for control of susceptible or resistant barnyardgrass to bispyribac, penoxsulam and quinclorac .5 Biodiversity study by RAPD analysis in 15 barnyardgrass populations from Vietnam and the U.1 RAPD analysis of 15 barnyardgrass populations .2 The genetic diversity of Echinochloa crus-galli and herbicide resistance level .6 Biochemical mechanism and molecular mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass .1 B-CAS activity in 5 quinclorac resistant barnyardgrass populations .2 CAS transcript abundance in leaf tissue of five barnyardgrass populations .3 Biochemical and molecular mechanism of quinclorac resistance in Echinochloa crus-galli in Mekong Delta .101 CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS .103 viii LIST OF TABLES Page Table 3.1 List of primers were used for RAPD analysis in the research .2 Steps in PCR reactions .3 RT-qPCR primer sequence detecting β-CAS and β-Actin synthase .1 Rice cultivation practice of farmer in Mekong Delta .2 Farmer perception about important weed species in rice field at 7 provinces of Mekong Delta .3 Farmer response about most escaped weed after herbicide treatments and need hand-weeding to control .4 The three most popular herbicides for escaped Echinochloa spp. control in Mekong Delta .5 The cost for weed management in Mekong Delta.6 Plant characteristic of Echinochloa spp. collected in Mekong Delta .7 Distribution of Echinochloa species in Mekong Delta .8 Herbicide-resistance level in populations to bispyribac, penoxsulam and quinclorac in different provinces .9 Percent of solo-resistance and multiple-resistance herbicides in three groups of Echinochloa spp.10 Percent of barnyardgrass population resistant to single and multiple herbicides of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in different provinces .11 Resistance Score of bispyribac, penoxsulam and quinclorac herbicide- resistance of 78 Echinochloa spp.12 Average LD90 of 3 Echinochloa groups to bispyribac, penoxsulam, quinclorac and rinskor .13 Average LD90 of barnyardgrass population to bispyribac, penoxsulam, quinclorac and rinskor .14 Six informative primers in RAPD analysis of Echinochloa crus-galli populations.15 Lethal dose of quinclorac needed to kill 90% of the population (LD 90) and the Resistance level of 15 Echinochloa crus-galli populations collected in Vietnam and U.16 Mortality of herbicide susceptible (S) and herbicide resistant (R) barnyardgrass treated by rinskor at different dose .17 Six informative primers in RAPD analysis of Echinochloa crus-galli populations.