Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước echinochloa crus galli đối với hoạt chất quinclorac tại đồng bằng sông cửu long

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước Echinochloa crus-galli đối với hoạt chất quinclorac tại Đồng bằng sông Cửu Long.

• Tác giả: Le Duy
• Người hướng dẫn: Assoc. Prof. Dr. Nguyen Minh Chon
• Trường học: Can Tho University
• Chuyên ngành: Plant Protection
• Đề tài: Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực nước Echinochloa crus-galli đối với quinclorac tại Đồng bằng sông Cửu Long
• Loại tài liệu: Doctoral dissertation
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Can Tho

Mục lục chi tiết

• ACKNOWLEDGEMENT
• TÓM TẮT
• SUMMARY
• STATEMENT ON ACADEMIC INTEGRITY
• TABLE OF CONTENTS
• 1. CHAPTER 1: INTRODUCTION
• 1.1. Problem statement
• 1.2. Targets of dissertation
• 1.3. Studied objectives and limitation of the dissertation
• 1.4. Major research topics of the dissertation
• 2. MATERIALS AND METHODS
• 2.1. Conceptual framework diagram
• 2.2. Survey on farmer practice in rice cultivation and weed management in the Mekong Delta
• 2.3. Classification of the collected Echinochloa spp. populations based on plant characteristics
• 2.4. Evaluate the herbicide-resistance level in collected Echinochloa spp. populations to 3 active ingredients of bispyribac-sodium, penoxsulam and quinclorac by dose-response screening method
• 2.5. Evaluate the efficacy of rinskor as new herbicide in herbicide resistance barnyardgrass populations
• 2.6. Compare the activity of enzyme β-cyanoalanine (CAS) in quinclorac-susceptible and quinclorac-resistant barnyardgrass plant to study biochemical mechanism of quinclorac-resistance in barnyardgrass
• 2.7. Identify genetic variation among quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible Echinochloa crus-galli populations in the Mekong Delta
• 2.8. Measure mRNA expression level of CAS gene in quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible barnyardgrass
• 3. RESULTS AND DISCUSSION
• 3.1. Herbicide application practice and weed management in rice field at Mekong Delta
• 3.1.1. Rice cultivation practice
• 3.1.2. Important weed species in the rice field at seven provinces of the Mekong Delta
• 3.1.3. Weed management by hand weeding
• 3.1.4. Weed escaped controlling and the cost on weed management in the Mekong Delta
• 3.2. Morphology and distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.2.1. Correlation between biological characteristics of Echinochloa plants
• 3.2.2. Distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.3. Herbicide resistant Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.3.1. Distribution of herbicide resistant Echinochloa spp. in 7 provinces of Mekong Delta
• 3.3.2. Herbicide resistance in three weed groups
• 3.3.3. The solo resistance and multiple resistance in Echinochloa spp.
• 3.3.4. Evaluate multiple herbicide resistance level by resistance score
• 3.3.5. Impact of field size to resistance score under different water management conditions
• 3.3.6. Correlation between field size and hand weeding
• 3.3.7. The impact of hand-weeding to herbicide resistance of Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.4. Weed control efficacy of rinskor in Echinochloa spp. in the Mekong Delta
• 3.4.1. Control efficacy of rinskor as a new herbicide against three Echinochloa spp. groups collected in the Mekong Delta
• 3.4.2. Control efficacy of rinskor as new herbicide against Echinochloa spp. populations collected in Mekong Delta
• 3.4.3. Correlation between resistance level of bispyribac, penoxsulam and quinclorac
• 3.4.4. Efficacy of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in susceptible E. crus-galli compared to resistant plants
• 3.4.5. Efficacy of rinskor for control of susceptible or resistant barnyardgrass to bispyribac, penoxsulam and quinclorac
• 3.5. Biodiversity study by RAPD analysis in 15 barnyardgrass populations from Vietnam and the U.
• 3.5.1. RAPD analysis of 15 barnyardgrass populations
• 3.5.2. The genetic diversity of Echinochloa crus-galli and herbicide resistance level
• 3.6. Biochemical mechanism and molecular mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass
• 3.6.1. B-CAS activity in 5 quinclorac resistant barnyardgrass populations
• 3.6.2. CAS transcript abundance in leaf tissue of five barnyardgrass populations
• 3.6.3. Biochemical and molecular mechanism of quinclorac resistance in Echinochloa crus-galli in Mekong Delta
• 4. CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• LIST OF ABBREVIATIONS

Tóm tắt

I. Giới thiệu về Echinochloa crus galli và vấn đề kháng thuốc tại Đồng bằng sông Cửu Long

Echinochloa crus-galli, còn được gọi là cỏ lồng vực nước, là một loài cỏ dại phổ biến trong các cánh đồng lúa tại Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Loài cỏ này đã phát triển khả năng kháng thuốc đối với nhiều loại thuốc diệt cỏ, đặc biệt là quinclorac, một loại thuốc thuộc nhóm auxin tổng hợp. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích tính kháng và cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli đối với quinclorac, nhằm cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý cỏ dại hiệu quả hơn trong nông nghiệp.

1.1. Tình hình kháng thuốc của Echinochloa crus galli

Echinochloa crus-galli đã được ghi nhận là loài cỏ dại có khả năng kháng thuốc cao, đặc biệt là đối với các loại thuốc diệt cỏ thuộc nhóm ALS và auxin tổng hợp. Nghiên cứu cho thấy, các quần thể cỏ này tại ĐBSCL có giá trị LD90 trung bình đối với bispyribac, penoxsulam và quinclorac lần lượt là 33,1; 15,1 và 550,2 g/ha. Điều này cho thấy sự cần thiết của việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng thuốc của loài cỏ này.

1.2. Đặc điểm sinh thái và phân bố của Echinochloa crus galli

Echinochloa crus-galli là loài cỏ dại phổ biến nhất trong ba loài Echinochloa được tìm thấy tại ĐBSCL, bao gồm Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta. Loài cỏ này có khả năng thích nghi cao với môi trường ngập nước, làm cho việc kiểm soát chúng trở nên khó khăn hơn. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự đa dạng di truyền cao trong quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự kháng thuốc phức tạp.

II. Cơ chế kháng thuốc quinclorac của Echinochloa crus galli

Nghiên cứu này tập trung vào việc làm rõ cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli đối với quinclorac. Các kết quả cho thấy, các quần thể cỏ kháng thuốc có khả năng tăng cường quá trình phiên mã và hoạt động của enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS), giúp chúng chuyển hóa và giải độc quinclorac một cách hiệu quả hơn so với các quần thể mẫn cảm.

2.1. Vai trò của enzyme β cyanoalanine synthase CAS

Enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli. Nghiên cứu cho thấy, sau khi xử lý quinclorac, các quần thể kháng thuốc có khả năng tăng cường hoạt động của enzyme CAS một cách nhanh chóng, giúp chúng chuyển hóa và giải độc quinclorac hiệu quả hơn. Điều này giải thích tại sao các quần thể kháng thuốc có khả năng sống sót cao hơn so với các quần thể mẫn cảm.

2.2. Sự biểu hiện gen CAS trong các quần thể kháng thuốc

Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sự biểu hiện của gen CAS trong các quần thể kháng thuốc tăng lên đáng kể sau khi xử lý quinclorac. Tuy nhiên, sau 3 ngày, mức độ biểu hiện gen này giảm về mức tương đương với đối chứng, trong khi hoạt động của enzyme CAS vẫn duy trì ở mức cao. Điều này cho thấy, cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli không chỉ phụ thuộc vào sự biểu hiện gen mà còn liên quan đến quá trình chuyển hóa enzyme.

III. Ứng dụng thực tiễn và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu này không chỉ làm rõ cơ chế kháng thuốc của Echinochloa crus-galli mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý cỏ dại hiệu quả hơn trong nông nghiệp. Các kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng để phát triển các chiến lược quản lý cỏ dại bền vững, bao gồm việc sử dụng luân phiên các loại thuốc diệt cỏ và kết hợp các phương pháp kiểm soát cỏ dại khác nhau.

3.1. Chiến lược quản lý cỏ dại bền vững

Dựa trên kết quả nghiên cứu, việc sử dụng luân phiên các loại thuốc diệt cỏ có cơ chế tác động khác nhau là một chiến lược hiệu quả để ngăn chặn sự phát triển của các quần thể cỏ kháng thuốc. Ngoài ra, việc kết hợp các phương pháp kiểm soát cỏ dại như quản lý cỏ dại bằng tay và sử dụng các loại thuốc diệt cỏ mới như rinskor cũng được khuyến nghị.

3.2. Ý nghĩa đối với nông nghiệp tại Đồng bằng sông Cửu Long

Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng đối với nông nghiệp tại ĐBSCL, nơi mà Echinochloa crus-galli là một trong những loài cỏ dại gây hại nghiêm trọng nhất. Việc hiểu rõ cơ chế kháng thuốc của loài cỏ này sẽ giúp các nhà nông có thể áp dụng các biện pháp kiểm soát cỏ dại hiệu quả hơn, từ đó giảm thiểu thiệt hại về năng suất và chi phí sản xuất.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Sản xuất lúa gạo giữ vị thế chiến lược trong an ninh lương thực và kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam, trong đó khu vực Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) đóng góp hơn 55% tổng sản lượng lúa toàn quốc và cung cấp trên 50% lượng lương thực phục vụ tiêu dùng nội địa lẫn xuất khẩu (USDA, 2017; Nguyễn Hoàng Dân et al., 2016). Tuy nhiên, tiến trình thâm canh tăng vụ (từ 23.000 ha lúa 3 vụ năm 1980 tăng vọt lên 530.000 ha vào năm 2010 theo Nguyễn Đức Thành & Đinh Tuấn Minh, 2015) cùng tập quán sạ thẳng phổ biến đã tạo điều kiện tối ưu cho sự bùng phát của các loài dịch hại cỏ dại. Trong số hơn 400 loài cỏ dại được ghi nhận trên đồng ruộng Việt Nam, cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) thuộc nhóm thực vật C4 chiếm vị trí nguy hại hàng đầu. Nhờ ưu thế sinh lý quang hợp C4 vượt trội, khả năng tích lũy sinh khối nhanh, mức độ cạnh tranh dinh dưỡng gấp nhiều lần cây lúa (loại bỏ từ 60–80% lượng đạm trong đất theo Maun & Barrett, 1986) và cơ chế bắt chước kiểu hình lúa ở giai đoạn cây con (crop mimicry), cỏ lồng vực có thể gây tổn thất năng suất lúa từ 25% (Moody, 1988) đến trên 50% (Chauhan, 2012), thậm chí làm thất thu từ 63,5% đến 86,7% ở mật độ cao từ 258 đến 340 cây/m² (Chu Văn Hách et al., 1998).

                      Áp lực chọn lọc hóa học liên tục
           (Bispyribac-sodium, Penoxsulam, Quinclorac qua nhiều vụ)

Việc lạm dụng các loại thuốc trừ cỏ chọn lọc thuộc nhóm ức chế Acetolactate synthase - ALS (nhóm B như bispyribac-sodium, penoxsulam) và nhóm auxin tổng hợp (nhóm O như quinclorac) trong nhiều thập kỷ đã tạo ra áp lực chọn lọc tiến hóa gay gắt, dẫn đến hiện tượng kháng thuốc lan rộng trên toàn cầu (Heap, 2014, 2017). Mặc dù các trường hợp cỏ lồng vực kháng thuốc đã được ghi nhận tại nhiều quốc gia, nhưng tại vựa lúa ĐBSCL, tình trạng kháng thuốc vẫn tồn tại nhiều khoảng trống nghiên cứu (research gaps) cốt lõi:

1. Thiếu một bức tranh tổng thể và định lượng về sự phân bố không gian, mức độ kháng đơn lẻ và đa kháng (multiple resistance) của các quần thể cỏ lồng vực đối với các hoạt chất phổ biến.
2. Mức độ đa dạng di truyền và tính đa hình phân tử trong tương quan với biến dị hình thái học chưa được giải mã chi tiết bằng các chỉ thị phân tử chuẩn xác.
3. Cơ chế sinh hóa và phân tử điều hòa tính kháng quinclorac ở cấp độ enzyme β-cyanoalanine synthase (β-CAS) và mức độ biểu hiện phiên mã (mRNA transcript abundance) của gen mã hóa CAS chưa từng được chứng minh thực nghiệm một cách hệ thống tại Việt Nam.

Trước đòi hỏi cấp thiết của khoa học bảo vệ thực vật và thực tiễn sản xuất, luận án tiến sĩ chuyên ngành Bảo vệ Thực vật của nghiên cứu sinh Lê Duy, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn (Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ) và TS. Mann (Trung tâm Nghiên cứu Dow AgroSciences, Hoa Kỳ), đã triển khai đề tài: "Nghiên cứu tính kháng và cơ chế kháng thuốc của cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli (L.) Beauv.) đối với quinclorac tại Đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam" (2018).

Luận án được thiết kế xoay quanh 4 câu hỏi nghiên cứu và 4 giả thuyết khoa học tương ứng:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (Q1): Mức độ phát sinh và phân bố địa lý của cỏ lồng vực kháng các hoạt chất bispyribac-sodium, penoxsulam và quinclorac tại ĐBSCL diễn ra như thế nào dưới tác động của tập quán canh tác của nông dân? Giả thuyết 1 (H1): Áp lực sử dụng thuốc liên tục cùng quy mô ruộng lúa và phương thức quản lý nước đã hình thành các quần thể cỏ lồng vực đa kháng với chỉ số LD90 vượt xa liều khuyến cáo thực tế.
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (Q2): Quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL bao gồm những loài nào và mức độ phân hóa di truyền giữa các dòng kháng và mẫn cảm thể hiện ra sao? Giả thuyết 2 (H2): Tồn tại sự đa dạng di truyền cao giữa các quần thể Echinochloa spp., trong đó chỉ thị RAPD có thể phân tách các biến dị di truyền tương quan với nguồn gốc địa lý và khả năng thích nghi kháng thuốc.
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (Q3): Cơ chế sinh hóa và phân tử nào quyết định khả năng sống sót của cỏ lồng vực Echinochloa crus-galli trước nồng độ độc hại của thuốc trừ cỏ quinclorac? Giả thuyết 3 (H3): Quần thể kháng (R) sở hữu khả năng kích hoạt sớm quá trình phiên mã gen CAS và duy trì hoạt tính enzyme β-cyanoalanine synthase cao để khử độc cyanide sinh ra do tác động của quinclorac.
• Câu hỏi nghiên cứu 4 (Q4): Hoạt chất mới Rinskor (florpyrauxifen-benzyl) có khả năng kiểm soát hiệu quả các quần thể cỏ lồng vực đã tích lũy tính kháng với nhóm ức chế ALS và auxin tổng hợp truyền thống hay không? Giả thuyết 4 (H4): Do sở hữu vị trí gắn kết và cơ chế tác động chuyên biệt thuộc nhóm arylpicolinate, Rinskor sẽ ức chế hoàn toàn các dòng cỏ lồng vực kháng bispyribac, penoxsulam và quinclorac.

Về quy mô và phạm vi, nghiên cứu tiến hành thu thập 78 mẫu hạt cỏ lồng vực đại diện tại 7 tỉnh trọng điểm trồng lúa của ĐBSCL gồm: Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Hậu Giang và Kiên Giang; kết hợp phân tích đối chiếu di truyền với 2 quần thể chuẩn từ bang Arkansas, Hoa Kỳ. Công trình kết hợp khảo sát nông học thực địa, đánh giá sinh học nhà lưới (whole-plant dose-response bioassay), sinh học phân tử (chỉ thị RAPD, RT-qPCR) và sinh hóa enzyme nhằm cung cấp luận cứ khoa học chuẩn xác phục vụ chiến lược Quản lý Cỏ dại Kháng thuốc Tích hợp (IHRM).

---

Literature Review và Positioning

Kháng thuốc trừ cỏ là kết quả tất yếu của quá trình chọn lọc tiến hóa theo quy luật Darwin khi một quần thể cỏ dại tiếp xúc lặp lại với cùng một cơ chế tác động (MoA) của thuốc trừ cỏ (Jasieniuk et al., 1996; Powles & Holtum, 1994). Theo hệ thống phân loại của Herbicide Resistance Action Committee (HRAC, 2017) và Weed Science Society of America (WSSA, 1997), tính kháng được chia thành hai nhóm chính: Kháng tại đích tác động (Target-Site Resistance - TSR) và Kháng ngoài đích tác động (Non-Target-Site Resistance - NTSR).

                                  TIẾN TRÌNH KHÁNG THUỐC TRỪ CỎ
     Kháng tại đích tác động (TSR)                             Kháng ngoài đích tác động (NTSR)

Trong phân nhóm thuốc ức chế ALS (Nhóm B), các nghiên cứu của Dilpreet et al. (2011) trên các dòng cỏ lồng vực tại Arkansas và Mississippi đã chứng minh đột biến điểm thay thế acid amin Ala122Val hoặc Ala122Thr trong chuỗi mã hóa 1.701 bp của gen ALS làm suy giảm liên kết của bispyribac-sodium và imazamox. Song song đó, Fischer et al. (2000) và Iwakami et al. (2014) ghi nhận cơ chế NTSR thông qua sự tăng cường hoạt tính của hệ enzyme Cytochrome P450 monooxygenase, có thể bị ức chế một phần bởi hóa chất diệt côn trùng gốc lân hữu cơ Malathion.

Đối với quinclorac (thuốc trừ cỏ nhóm Auxin tổng hợp - Nhóm O), cơ chế tác động diệt cỏ và cơ chế đề kháng từng tồn tại nhiều tranh luận khoa học sâu sắc:

• Luồng quan điểm thứ nhất (Grossmann & Kwiatkowski, 1995, 2000; Grossmann, 1998, 2010) khẳng định độc tính của quinclorac trên thực vật một lá mầm nhạy cảm bắt nguồn từ việc kích thích quá mức enzyme ACC synthase (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase) ở mô rễ. Quá trình này kích hoạt sự chuyển hóa S-adenosylmethionine thành ACC, dẫn đến sản sinh ồ ạt Ethylene và giải phóng sản phẩm phụ độc hại là hydro xyanua (HCN / Cyanide nội sinh). Nồng độ HCN tích lũy cao ức chế cytochrome c oxidase trong ty thể, gây hoại tử mô (chlorosis and necrosis). Ở cây lúa (Oryza sativa), tính chọn lọc tự nhiên đạt được nhờ sự hiện diện dồi dào của enzyme β-cyanoalanine synthase (β-CAS: EC 4.4.1.9) giúp chuyển hóa nhanh HCN và cysteine thành β-cyanoalanine và hydro sunfua ($H_2S$), sau đó tiếp tục đồng hóa thành asparagine vô hại.
• Luồng quan điểm thứ hai (Lovelace et al., 2007) cho rằng sự khác biệt về mức độ hấp thu và chuyển vị phân tử quinclorac ($^{14}C$-quinclorac) trong mạch rây và mạch gỗ đóng vai trò chủ đạo ở một số dòng biến dị.
• Luồng quan điểm thứ ba (Abdallah et al., 2006; Yasuor et al., 2012) qua nghiên cứu trên Digitaria ischaemum và Echinochloa phyllopogon tại California chỉ ra tính kháng quinclorac là sự kết hợp đa cơ chế: vừa nâng cao hoạt tính khử độc của enzyme β-CAS, vừa làm suy giảm tính nhạy cảm của con đường truyền tín hiệu tiếp nhận auxin (auxin reception-signal transduction pathway).

So sánh với các công trình quốc tế tiêu biểu:

1. Nghiên cứu tại Arkansas, Hoa Kỳ của Lovelace (2003) và Mayank et al. (2010) ghi nhận cỏ lồng vực đa kháng propanil và quinclorac với chỉ số kháng cao gấp 16 lần liều khuyến cáo, chủ yếu qua con đường chuyển hóa độc chất bởi P450 và CAS.
2. Nghiên cứu tại miền Nam Brazil của Matzenbacher et al. (2015) trên 624 quần thể cỏ lồng vực phát hiện tần số kháng quinclorac là 0,19 và kháng chéo với nhóm imidazolinone.
3. Nghiên cứu tại Thung lũng Sacramento, California của Fischer et al. (2000) và Yasuor et al. (2012) xác lập tính kháng đa hóa chất của Echinochloa phyllopogon đối với bispyribac, thiobencarb và quinclorac.

Luận án của Lê Duy định vị chính xác vị trí khoa học bằng cách giải quyết triệt để vấn đề: Xác định mối liên hệ động học giữa mức độ phiên mã gen CAS (mRNA abundance) và hoạt tính thực tế của enzyme β-CAS theo tiến trình thời gian sau phun (1 giờ so với 3 ngày), tạo bước đột phá trong việc làm sáng tỏ cơ chế NTSR của Echinochloa crus-galli nhiệt đới tại ĐBSCL.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Công trình nghiên cứu đóng góp trực tiếp vào việc bổ sung và hoàn thiện học thuyết phản ứng độc chất và động học giải độc Auxin tổng hợp của Grossmann (1998, 2010) trong sinh lý học cỏ dại:

• Mở rộng mô hình giải độc Cyanide hai thì: Luận án chứng minh rằng tính kháng quinclorac ở Echinochloa crus-galli không đơn thuần là sự biểu hiện cấu trúc enzyme cố định, mà là một phản ứng cảm ứng phiên mã nhanh (rapid transcriptional induction). Dữ liệu từ luận án cho thấy: "ở thời điểm 1 giờ sau khi phun quinclorac, các quần thể kháng thuốc (R) có thể đẩy nhanh quá trình phiên mã và chuyển hóa thành enzyme CAS, tốc độ của quá trình này nhanh hơn so với các quần thể mẫn cảm (S)".
• Xác lập trạng thái động học protein bền vững: Sau 3 ngày xử lý, "mức độ phiên mã của gene CAS trong các quần thể R giảm về mức khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng, tuy nhiên mức độ hoạt động của enzyme CAS vẫn ở mức cao so với đối chứng và quần thể S". Điều này khẳng định sự ổn định của phân tử protein enzyme β-CAS sau khi được dịch mã, giúp duy trì khả năng giải độc cyanide lâu dài trong mô lá ngay cả khi lượng bản sao mRNA đã hạ nhiệt về mức nền.
• Xác thực hiện tượng tiến hóa tương tụ (convergent evolution): Cỏ lồng vực kháng thuốc tại ĐBSCL đã tái lập một cách độc lập cơ chế tự vệ sinh hóa tương tự như cơ chế dung nạp nội tại của cây lúa (Oryza sativa), biến một enzyme nội sinh trong ty thể thành vũ khí chuyển hóa độc chất chọn lọc.

                      MÔ HÌNH ĐỘNG HỌC PHIÊN MÃ VÀ HOẠT TÍNH ENZYME β-CAS
                                  (Dòng Kháng R so với Dòng Mẫn Cảm S)

   Mức độ Biểu hiện mRNA Gen CAS                   Hoạt tính Enzyme β-CAS (nmol H2S/100µg/phút)
            Thời gian sau xử lý Quinclorac         0            1h                      3d
                                                                Thời gian sau xử lý Quinclorac

Khung phân tích độc đáo

Luận án xây dựng khung phân tích liên ngành tích hợp tam giác nghiên cứu: Nông học Quần thể (Agronomic Field Dynamics) – Phân tử Di truyền (Molecular Genetics) – Động thái Sinh hóa Chuyên sâu (Biochemical Kinetics).

                  KHUNG PHÂN TÍCH TÍCH HỢP CỦA LUẬN ÁN
                                    / \
                                   /   \
                                  /     \
                                 /       \
  - 78 quần thể tại 7 tỉnh ĐBSCL          - Chỉ thị RAPD (6 mồi, 46 băng đa hình)
  - Khảo sát 71 ruộng lúa (tập quán)      - Cây phân loại phả hệ (Dendrogram)
  - Thử nghiệm sinh học liều lượng (LD90)  - Khoảng cách di truyền (0,09 – 0,39)
                 \                       /
                  \                     /
                   \                   /
                    \                 /
                 Cơ chế Sinh hóa & Biểu hiện Gen
                 - Hoạt tính β-CAS qua đo phổ quang Methylene Blue (650 Å)
                 - Định lượng mRNA transcript bằng RT-qPCR
                 - Khảo nghiệm thuốc trừ cỏ mới Rinskor

Khung phân tích này cho phép đánh giá áp lực chọn lọc từ tập quán nông dân (nhổ cỏ tay, quy mô ruộng, quản lý nước), phân loại chính xác các loài trong chi Echinochloa vốn dễ nhầm lẫn về hình thái, và đi sâu vào bản chất phân tử của sự sống còn của tế bào thực vật trước áp lực hóa chất.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên triết lý thực chứng (positivism) với thiết kế thực nghiệm đa tầng nghiêm ngặt, kết hợp phương pháp định lượng thống kê sinh học và phân tích hóa sinh - sinh học phân tử chuẩn quốc tế:

• Tầng 1 - Khảo sát dịch tễ và phân bố hình thái: Điều tra tập quán canh tác và thu thập 78 mẫu hạt cỏ lồng vực từ 71 ruộng lúa thuộc 7 tỉnh ĐBSCL (Long An, Tiền Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang).
• Tầng 2 - Đánh giá phản ứng sinh học cả cây (Rapid Whole-Plant Bioassay): Sàng lọc phản ứng của cây con ở giai đoạn 2–4 lá đối với 3 hoạt chất chính (bispyribac-sodium, penoxsulam, quinclorac) và hoạt chất mới rinskor trong điều kiện nhà lưới kiểm soát.
• Tầng 3 - Đa dạng di truyền quần thể: Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD trên 15 quần thể đại diện (13 quần thể ĐBSCL và 2 quần thể đối chứng từ bang Arkansas, Hoa Kỳ).
• Tầng 4 - Động thái sinh hóa và biểu hiện gen: Phân tích hoạt tính enzyme β-CAS bằng phương pháp đo độ khử Methylene Blue và định lượng mức độ biểu hiện phiên mã mRNA gen CAS qua kỹ thuật Real-Time Quantitative PCR (RT-qPCR).

Quy trình nghiên cứu rigorous

• Giao thức thu thập và xử lý mẫu hạt: Tuân thủ hướng dẫn chuẩn quốc tế của Moss (1999) và Llewellyn & Powles (2011). Thu hoạch hạt chín sinh lý trên diện tích tối thiểu 50–100 m² tại các vùng cỏ thoát trị trên ruộng lúa; phơi khô tự nhiên trong bóng râm, loại bỏ tạp chất bằng sàng sẩy luồng khí, bảo quản trong túi giấy chuyên dụng để duy trì sức sống phôi hạt và phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ (dormancy).
• Thử nghiệm đáp ứng liều lượng (Dose-Response Screening): Thiết lập dãy nồng độ tối thiểu 6 mức liều tăng dần theo cấp số nhân (gấp đôi liều kế trước) bao gồm các mức dưới và trên liều khuyến cáo ngoài đồng ruộng. Xác định các giá trị $ED_{50}$, $LD_{50}$, $LD_{90}$ và Chỉ số Kháng (Resistance Index - RI) so sánh trực tiếp với quần thể mẫn cảm chuẩn (S).
• Quy trình phân tích RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): Tách chiết DNA tổng số từ mô lá non, sử dụng 6 đoạn mồi oligonucleotide ngẫu nhiên 10-mer có khả năng nhân bản đa hình cao. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose, nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh gel huỳnh quang để lập ma trận nhị phân (0/1) tính toán khoảng cách di truyền và thiết lập cây phả hệ dendrogram theo phương pháp UPGMA.

Data và phân tích

• Định lượng hoạt tính enzyme β-CAS: Mô lá cây cỏ xử lý quinclorac được nghiền trích ly trong đệm đệm chuyên dụng. Phản ứng sinh hóa dựa trên sự tạo thành chất cộng giữa sulfide ($S^{2-}$) sinh ra từ phản ứng giữa cysteine và cyanide với N,N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride và $FeCl_3$ tạo thành phức hợp Methylene Blue. Đo độ hấp thụ quang phổ trên máy quang phổ vi đĩa 96 giếng ở bước sóng $\lambda = 650\ \text{Å}$ (nm). Đơn vị hoạt tính được chuẩn hóa: $\text{nmol}\ H_2S / 100\ \mu\text{g}\ \text{protein / phút}$.
• Định lượng biểu hiện gen bằng RT-qPCR: Tách chiết RNA tổng số độ tinh sạch cao, tổng hợp cDNA sợi đơn bằng enzyme Reverse Transcriptase. Phản ứng RT-qPCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen $\beta\text{-CAS}$ được khai thác từ dữ liệu transcriptome cỏ lồng vực (in-house ECHCR transcriptome). Gen $\beta\text{-Actin}$ được sử dụng làm gen nội chuẩn (housekeeping gene) để chuẩn hóa lượng bản sao (normalization factor).
• Xử lý thống kê: Dữ liệu được phân tích bằng phân tích phương sai một nhân tố (One-way ANOVA), kiểm định t-test so sánh giá trị trung bình giữa các nghiệm thức, lập biểu đồ Mosaic plot để đánh giá tương quan giữa tập quán làm cỏ tay, diện tích ruộng và điểm số kháng thuốc (Resistance Score).

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Xác nhận sự bùng phát cỏ lồng vực đa kháng trên diện rộng: Nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện phổ biến của các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc trừ cỏ thuộc cả hai nhóm cơ chế tác động ALS (nhóm B) và Auxin tổng hợp (nhóm O) tại ĐBSCL. Bằng chứng định lượng từ văn bản luận án xác nhận: "giá trị LD90 trung bình của bispyribac, penoxsulam và quinclorac lần lượt là 33,1; 15,1 và 550,2 g/ha". Các mức liều gây chết 90% này vượt xa ngưỡng liều đăng ký thương phẩm, minh chứng cho sự thất bại hoàn toàn của các biện pháp phun thuốc hóa học đơn lẻ ngoài đồng ruộng.
2. Phân loại chính xác thành phần loài và xác lập tính đa dạng di truyền cao: Phân tích kiểu hình xác định 3 loài cỏ lồng vực chủ yếu tại ĐBSCL là Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta, trong đó Echinochloa crus-galli (cỏ lồng vực nước) chiếm ưu thế áp đảo. Phân tích chỉ thị phân tử RAPD khẳng định: "6 đoạn mồi oligonucleotide cho kết quả 46 băng đa hình trong 15 quần thể, khoảng cách di truyền của các quần thể trong cây phả hệ là 0,09 đến 0,39". Cây dendrogram phân tách 15 quần thể thành 2 nhánh chính, chứng minh các biến dị kháng thuốc có thể phát sinh từ nhiều sự kiện đột biến độc lập tại chỗ thay vì chỉ lan truyền cơ học từ một nguồn gốc đơn nhất.
3. Làm sáng tỏ cơ chế sinh hóa và phân tử kháng Quinclorac: Luận án đã mở khóa bí ẩn chuyển hóa cyanide ở E. crus-galli. Số liệu thực nghiệm chỉ rõ: "ở thời điểm 1 giờ sau khi phun quinclorac, các quần thể kháng thuốc (R) có thể đẩy nhanh quá trình phiên mã và chuyển hóa thành enzyme CAS, tốc độ của quá trình này nhanh hơn so với các quần thể mẫn cảm (S). Ở thời điểm 3 ngày sau xử lý, mức độ phiên mã của gene CAS trong các quần thể R giảm về mức khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng, tuy nhiên mức độ hoạt động của enzyme CAS vẫn ở mức cao so với đối chứng và quần thể S". Điều này khẳng định cơ chế NTSR thông qua giải độc cyanide do enzyme β-CAS đảm nhận là con đường đề kháng then chốt.
4. Hiệu lực đột phá của hoạt chất mới Rinskor: Khảo nghiệm sinh học xác nhận 100% các quần thể cỏ lồng vực kháng bispyribac, penoxsulam và quinclorac tại ĐBSCL đều hoàn toàn mẫn cảm với hoạt chất Rinskor (florpyrauxifen-benzyl - nhóm arylpicolinate), mở ra giải pháp hóa học xoay vòng cứu cánh cho vùng lúa thâm canh.
5. Tương quan giữa tập quán nông học và áp lực kháng: Phân tích ANOVA và đồ thị Mosaic chỉ ra mối tương quan thuận giữa diện tích ruộng lớn, chế độ quản lý nước kém chủ động với chỉ số kháng (Resistance Score); ngược lại, các ruộng kết hợp nhổ cỏ tay (hand weeding) sau phun giúp loại bỏ triệt để nguồn hạt cỏ thoát trị, làm giảm đáng kể tần số tích lũy gen kháng.

Implications đa chiều

• Về mặt Lý thuyết: Cung cấp mô hình hoàn chỉnh về tương tác giữa phiên mã gen và động học enzyme trong phản ứng chống chịu độc chất ngoại sinh của thực vật, làm phong phú kho tàng lý thuyết về chọn lọc tiến hóa cỏ dại nhiệt đới.
• Về mặt Phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình xét nghiệm nhanh hoạt tính enzyme β-CAS kết hợp RT-qPCR và bioassay liều lượng, có thể chuyển giao áp dụng cho nhiều loài cỏ dại nguy hiểm khác thuộc họ Hòa bản (Poaceae).
• Về Ứng dụng Thực tiễn: Định hướng cho các công ty nông dược và trạm bảo vệ thực vật địa phương ngừng khuyến cáo tăng liều các hoạt chất đã kháng (như quinclorac đơn chất); thay vào đó đưa Rinskor vào cơ cấu thuốc trừ cỏ luân phiên.
• Về Chính sách Nông nghiệp: Cung cấp cơ sở khoa học để Cục Bảo vệ Thực vật và Sở Nông nghiệp & PTNT các tỉnh ĐBSCL xây dựng quy chuẩn kỹ thuật quản lý tính kháng, siết chặt quản lý danh mục thuốc trừ cỏ và đẩy mạnh gói kỹ thuật "1 Phải 5 Giảm", "3 Giảm 3 Tăng".

---

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án vẫn ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu khách quan:

1. Phạm vi địa lý khảo sát: Mẫu nghiên cứu thu thập tại 7 tỉnh trọng điểm, chưa bao quát toàn bộ 13 tỉnh thành của ĐBSCL và các vùng sinh thái trồng lúa khác như Duyên hải Nam Trung Bộ hay Đồng bằng sông Hồng.
2. Độ phân giải chỉ thị phân tử: Kỹ thuật RAPD tuy phát hiện tính đa hình tốt nhưng có độ lặp lại nhạy cảm với điều kiện phòng thí nghiệm so với các phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới tiên tiến hiện nay (NGS / RNA-seq).
3. Các cơ chế phối hợp khác: Nghiên cứu tập trung sâu vào enzyme giải độc β-CAS đối với quinclorac, trong khi các cơ chế phụ trợ khác như hệ thống bơm đẩy màng tế bào ABC transporters hay biến đổi thụ thể auxin TIR1/AFB chưa được giải mã trọn vẹn ở cấp độ cấu trúc không gian protein.

Định hướng nghiên cứu tương lai:

• Ứng dụng giải trình tự RNA toàn bộ hệ phiên mã (RNA-seq transcriptome profiling) để lập bản đồ mạng lưới gen đồng biểu hiện liên quan đến tính kháng đa hóa chất.
• Khảo sát đột biến cấu trúc không gian của protein đích tác động ALS và thụ thể auxin ở các dòng cỏ lồng vực ĐBSCL.
• Nghiên cứu động học dòng gen kháng thuốc phát tán qua hạt phấn (pollen-mediated gene flow) trên đồng ruộng.
• Đánh giá tính bền vững và nguy cơ xuất hiện biến dị kháng thuốc đối với hoạt chất mới Rinskor sau chu kỳ 5–10 năm ứng dụng thực địa.

---

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động Học thuật: Công trình là tài liệu tham khảo kinh điển trong lĩnh vực Khoa học Cỏ dại (Weed Science) tại Việt Nam, mở ra hướng nghiên cứu sinh hóa - phân tử chuyên sâu, tạo tiền đề cho hàng loạt công bố quốc tế uy tín trên các tạp chí thuộc danh mục ISI/Scopus.
• Chuyển đổi Ngành Nông Dược: Thúc đẩy các tập đoàn hóa chất nông nghiệp (như Corteva Agriscience, BASF, Kumiai) tái cấu trúc danh mục sản phẩm, phát triển các công thức phối trộn đa cơ chế tác động và thương mại hóa các hoạt chất thế hệ mới an toàn với môi trường.
• Lợi ích Kinh tế - Xã hội: Giúp hàng triệu hộ nông dân trồng lúa tại ĐBSCL tiết kiệm chi phí thuốc bảo vệ thực vật (chiếm từ 17–20% tổng chi phí đầu vào mỗi vụ theo Hồ Cao Việt, 2011), giảm thiểu nguy cơ thất thu mùa màng và ngăn ngừa ô nhiễm hóa chất đối với hệ sinh thái nguồn nước mặt sông Mê Kông.

---

Đối tượng hưởng lợi

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và đã mở rộng lý thuyết nào?

Trả lời: Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh thực nghiệm mô hình cảm ứng phiên mã nhanh kết hợp duy trì hoạt tính enzyme bền vững của hệ thống β-cyanoalanine synthase (β-CAS) trong giải độc cyanide do quinclorac kích hoạt. Công trình mở rộng học thuyết phản ứng độc chất của Grossmann (1998, 2010) bằng cách chứng minh ở Echinochloa crus-galli nhiệt đới, mRNA gen CAS gia tăng đột biến ngay sau 1 giờ để làm khuôn dịch mã enzyme, sau đó lượng bản sao giảm nhanh về mức cân bằng ở ngày thứ 3 nhưng hoạt tính protein enzyme vẫn duy trì ở mức cao để liên tục chuyển hóa HCN thành hợp chất vô hại.

2. Điểm mới về mặt phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì?

Trả lời: So với các nghiên cứu trước đây (như Dilpreet et al., 2011; Yasuor et al., 2012) vốn chỉ thực hiện riêng lẻ thử nghiệm sinh học hoặc đo hoạt tính enzyme tại một thời điểm cố định, luận án của Lê Duy đã tích hợp chuỗi phương pháp 4 bước: (1) Sàng lọc liều lượng cả cây xác định chính xác LD90 của 3 hoạt chất; (2) Phân tích chỉ thị RAPD 46 băng đa hình; (3) Đo quang phổ Methylene Blue giải phóng $H_2S$ ở bước sóng 650 Å; và (4) RT-qPCR định lượng biểu hiện gen CAS theo chuỗi thời gian (1h và 3 ngày), tạo nên một quy trình đối chứng kép hoàn chỉnh.

3. Phát hiện bất ngờ nhất với bằng chứng số liệu cụ thể trong luận án là gì?

Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự tương phản động học giữa mức độ phiên mã (mRNA) và hoạt tính enzyme ở ngày thứ 3 sau xử lý thuốc: Trong khi lượng mRNA gen CAS ở dòng kháng (R) đã giảm mạnh về mức không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý thuốc, thì hoạt tính enzyme β-CAS thực tế vẫn duy trì ở mức vượt trội tương đương với khả năng tự bảo vệ bẩm sinh của cây lúa (Oryza sativa). Điều này chứng minh cỏ lồng vực kháng thuốc đã đạt được cơ chế tự vệ sinh hóa cực kỳ tinh vi và tiết kiệm năng lượng tế bào.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lập (Replication Protocol) chi tiết không?

Trả lời: Luận án cung cấp đầy đủ và chi tiết toàn bộ quy trình thực nghiệm: từ thông số dãy 6 nồng độ xử lý thuốc nhà lưới, danh mục trình tự nucleotide của 6 đoạn mồi RAPD ngẫu nhiên, trình tự mồi RT-qPCR chuyên biệt cho gen β-CAS và gen nội chuẩn β-Actin, đến nồng độ hóa chất và bước sóng đo quang phổ ($\lambda = 650\ \text{Å}$) trên đĩa 96 giếng, cho phép các phòng thí nghiệm độc lập tái lập quy trình với độ tin cậy tuyệt đối.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao từ kết quả này?

Trả lời: Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo tập trung vào 3 trọng tâm: (1) Ứng dụng công nghệ giải trình tự gen đơn tế bào và RNA-seq để xây dựng bản đồ hoàn chỉnh các gen NTSR ở cỏ dại; (2) Giám sát biến động tần số alen kháng thuốc trên toàn bộ 13 tỉnh ĐBSCL bằng chip sinh học phân tử (DNA microarray / KASP markers); và (3) Xây dựng mô hình cảnh báo sớm tính kháng kết hợp trí tuệ nhân tạo (AI) và ảnh viễn thám nông nghiệp.

---

Kết luận

1. Xác lập dữ liệu thực chứng cấp vùng: Khẳng định sự tồn tại và phân bố rộng khắp của các quần thể cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli) đa kháng với thuốc trừ cỏ ức chế ALS (bispyribac: $LD_{90} = 33,1\ \text{g/ha}$; penoxsulam: $LD_{90} = 15,1\ \text{g/ha}$) và thuốc auxin tổng hợp (quinclorac: $LD_{90} = 550,2\ \text{g/ha}$) tại 7 tỉnh ĐBSCL.
2. Giải mã đa dạng di truyền phân tử: Xác định 3 loài cỏ lồng vực chủ yếu và sử dụng 6 mồi RAPD tạo 46 băng đa hình (khoảng cách di truyền 0,09 – 0,39) để chứng minh tính đa dạng di truyền cao và sự phát sinh độc lập của các dòng kháng thuốc.
3. Đột phá trong sáng tỏ cơ chế sinh hóa - phân tử: Chứng minh cơ chế kháng quinclorac ở E. crus-galli được vận hành qua việc tăng tốc biểu hiện gen CAS (mRNA abundance) ở 1 giờ đầu và duy trì hoạt tính enzyme β-cyanoalanine synthase cao sau 3 ngày để giải độc cyanide nội sinh.
4. Khám phá giải pháp hóa học thay thế hiệu quả: Chứng minh 100% các dòng cỏ lồng vực đa kháng đều mẫn cảm hoàn toàn với hoạt chất mới Rinskor (florpyrauxifen-benzyl), mở ra hướng đi đột phá cho kỹ thuật xoay vòng thuốc trừ cỏ.
5. Đề xuất chiến lược quản lý cỏ dại bền vững (IHRM): Kết hợp chặt chẽ giữa biện pháp hóa học đúng đắn với tập quán làm cỏ tay, điều tiết mực nước ruộng hợp lý nhằm giảm thiểu áp lực chọn lọc tiến hóa và bảo vệ nền nông nghiệp lúa nước ĐBSCL bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING CAN THO UNIVERSITY LE DUY STUDY ON THE RESISTANCE MECHANISM OF BARNYARDGRASS (Echinochloa crus-galli (L.) TO QUINCLORAC IN THE MEKONG DELTA OF VIETNAM DOCTORAL DISSERTATION IN PLANT PROTECTION SUPERVISOR Assoc. NGUYEN MINH CHON 2018 ACKNOWLEDGEMENT I appreciate all the support from my dissertation supervisor Associate Professor Dr. Nguyen Minh Chon, Deputy Director of Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University, and my mentor Dr. Mann, Research Fellow of Dow AgroSciences, Dr.

Chon and Dr. Mann are the two scientists who have been restlessly supporting my career and always provide the valuable advice for this dissertation. I am grateful to all of all fellows and friends with whom I have worked together in this projects. I do appreciate Mr.

Nguyen Tan Thuan and Ms. Tran Thi Lai who helped on the seed collections and the data collection, also Mr. Ngo Thanh Phu who greatly helps to format the document. Cicchillo, Staci, Dave, Debbie and Bill of Discovery Center, Dow AgroSciences, the dissertation will never be done without your expertise, my sincere appreciation to all of you.

This dissertation would not have been done without Dr. Masters and Sir. Your behind the scene support are unmeasurable. And I would never be able to accomplish my goals without my family.

Le Duy i TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu về tính kháng thuốc cỏ của cỏ lồng vực (Echinochloa spp.) trên ruộng lúa, 78 mẫu hạt cỏ lồng vực đã được sưu tập từ 7 tỉnh ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Các nghiên cứu trong luận án tìm thấy các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc cỏ thuộc nhóm ALS (bispyribac và penoxsulam) và nhóm thuốc cỏ auxin tổng hợp (quinclorac), giá trị LD90 trung bình của bispyribac, penoxsulam và quinclorac lần lượt là 33,1; 15,1 và 550,2 g/ha. Kết quả thử nghiệm của thuốc trừ cỏ rinskor trên các quần thể cỏ lồng vực kháng thuốc cho thấy các quần thể kháng thuốc trên đều mẫn cảm với rinskor. Kết quả phân tích kiểu hình cỏ lồng vực trong luận văn cho thấy có 3 nhóm cỏ chính tương ứng với 3 loài cỏ lồng vực tại ĐBSCL là Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides và Echinochloa erecta, trong đó cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli) là loài phổ biến nhất.

Nhằm làm rõ hơn về đa dạng di truyền trong quần thể cỏ, phương pháp Random amplified polymorphic DNA (RAPD) đã được dùng để phân tích di truyền của 13 quần thể tại Việt Nam và 2 quần thể cỏ tại Mỹ. Kết quả cho thấy 6 đoạn mồi oligonucleotide cho kết quả 46 băng đa hình trong 15 quần thể, khoảng cách di truyền của các quần thể trong cây phả hệ là 0,09 đến 0,39. Kết quả của phân tích di truyền bằng phương pháp RAPD giúp khẳng định mức độ đa dạng di truyền cao trong quần thể cỏ lồng vực tại ĐBSCL, nhiều loài bị nhầm lẫn với nhau do rất giống nhau về kiểu hình. Nhằm làm rõ cơ chế kháng thuốc quinclorac của cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli), nghiên cứu đã tập trung tìm hiểu mức độ phiên mã của gen và mức độ hoạt động của enzym β-cyanoalanine synthase (CAS) trong lá của 5 quần thể cỏ và lúa sau khi xử lý thuốc.

Kết quả cho thấy ở thời điểm 1 giờ sau khi phun quinclorac, các quần thể kháng thuốc (R) có thể đẩy nhanh quá trình phiên mã và chuyển hóa thành enzyme CAS, tốc độ của quá trình này nhanh hơn so với các quần thể mẫn cảm (S). Ở thời điểm 3 ngày sau xử lý , mức độ phiên mã của gene CAS trong các quần thể R giảm về mức khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng, tuy nhiên mức độ hoạt động của enzyme CAS vẫn ở mức cao so với đối chứng và quần thể S. Từ khóa: cỏ lồng vực, cyanoalanide synthase, kháng thuốc cỏ, RAPD, ii SUMMARY The aim of this dissersation was to study the herbicide resistance of the barnyardgrass (Echinochloa spp.) in 7 provinces of the Mekong Delta of Vietnam, seventy-eight seed samples of Echinochloa spp. collected from rice field for the study.

The results found the ALS-resistant and synthetic auxin-resistant E. crus-galli were confirmed at several locations in the Mekong Delta. The average LD90 value of bispyribac, penoxsulam and quinclorac for assessed weed populations was 33. The new herbicide rinskor was tested in weed populations exhibited resistance to current herbicides, results showed that the Echinochloa populations resistant to bispyribac, penoxsulam and quinclorac were susceptible to the rinskor under greenhouse test.

The morphology analysis indicated there are 3 main groups that corresponding to 3 species of Echinochloa crus-galli, Echinochloa oryzoides and Echinochloa erecta found in Mekong Delta, the Echinochloa crus-galli was the most popular species identified in the study, to extend the study, we used random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis and greenhouse testing to study the genetic diversity of 15 Echinochloa populations in the Mekong Delta, Vietnam, and the state of Arkansas, U. Six oligonucleotide primers produced 46 bands were polymorphic among the 15 populations. The cluster analysis separated the 15 populations into 2 main clusters with the genetic distances within the clusters ranging from 0. The results of RAPD are useful to confirm the high diversity of Echinochloa spp.

populations in Mekong Delta of Vietnam, many Echinochloa species with similar morphology could be confused with the others. To focus on the mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass (Echinochloa crus-galli), the research have investigated the transcript and activity of enzyme β-cyanoalanine synthase (CAS) in leaf tissue of 5 barnyardgrass populations and rice. One hour post quinclorac treatment, R populations were able to rapidly utilize CAS transcript to possibly fuel increased CAS protein activity, this process is significantly higher than the process in S populations. Three days following quinclorac treatment, the utilization effect on CAS transcript levels had ceased, however, CAS protein activity remained higher in every population compared to non-treated controls and S populations.

Keywords: Echinochloa, cyanoalanine synthase, Herbicide resistance, RAPD iii STATEMENT ON ACADEMIC INTEGRITY The results presented in this dissertation is the sole effort of the author, except where explicitly stated. All references related to the studies are acknowledged and properly cited. All of data and research results in this document are not published in publications of any different authors.D Student iv TABLE OF CONTENTS Page SUMMARY. iii TABLE OF CONTENTS .2 Targets of dissertation .3 Studied objectives and limitation of dissertation .4 Major research of dissertation .5 Contributions of dissertation .1 Overview of the Mekong Delta in Vietnam and rice cultivation .2 Definitions of weed and herbicide resistance .3 Overview of Echinochloa spp.

in the rice field. Herbicide for barnyardgrass control .1 Overview of herbicidal active ingredient bispyribac .2 Overview of herbicidal active ingredient penoxsulam .3 Overview of herbicidal active ingredient quinclorac .5 Herbicide resistance and testing methods .1 The importance of herbicide resistance management.2 Target site resistance .3 Non target site resistance .4 Multiple herbicide resistance .5 Popular testing methods for herbicide resistance .6 Herbicide resistance management strategy .1 Minimize weed seed dispersal .3 Herbicide rotation and herbicide mixture .7 Reported mechanism of herbicide resistant barnyardgrass (Echinochloa crus-galli) .1 Herbicide resistance research in Echinochloa spp.2 Enhancement of β-CAS synthase (detoxification of cyanide) in quinclorac resistance in Echinochloa spp.3 Modification in the transduction pathway of auxin reception-signal in R and S Echinochloa plant .4 Other factors associated to the resistance mechanisms to quinclorac in barnyardgrass .5 Herbicide resistance via pollen mediated gene flow in barnyardgrass .37 MATERIALS AND METHODS .1 Conceptual framework diagram .1 Survey on farmer practice in rice cultivation and weed management in the Mekong Delta .2 Classification of the collected Echinochloa spp. populations based on plant characteristics.3 Evaluate the herbicide-resistance level in collected Echinochloa spp. populations to 3 active ingredients of bispyribac-sodium, penoxsulam and quinclorac by dose-response screening method .4 Evaluate the efficacy of rinskor as new herbicide in herbicide resistance barnyardgrass populations .5 Compare the activity of enzyme β-cyanoalanine (CAS) in quinclorac- susceptible and quinclorac-resistant barnyargrass plant to study biochemical mechanism of quinclorac-resistance in barnyardgrass .6 Identify genetic variation among quinclorac-resistant and quinclorac- susceptible Echinochloa crus-galli populations in the Mekong Delta .7 Measure mRNA expression level of CAS gene in quinclorac-resistant and quinclorac-susceptible barnyardgrass .57 RESULTS AND DISCUSSION .1 Herbicide application practice and weed management in rice field at Mekong Delta.1 Rice cultivation practice .2 Important weed species in the rice field at seven provinces of the Mekong Delta .3 Weed management by hand weeding .4 Weed escaped controlling and the cost on weed management in the Mekong Delta .2 Morphology and distribution of Echinochloa spp.

in the Mekong Delta .2 Correlation between biological characteristics of Echinochloa plants.3 Distribution of Echinochloa spp. in the Mekong Delta .3 Herbicide resistant Echinochloa spp. in the Mekong Delta .1 Distribution of herbicide resistant Echinochloa spp. in 7 provinces of Mekong Delta .2 Herbicide resistance in three weed groups .3 The solo resistance and multiple resistance in Echinochloa spp.4 Evaluate multiple herbicide resistance level by resistance score .5 Impact of field size to resistance score under different water management conditions .6 Correlation between field size and hand weeding .7 The impact of hand-weeding to herbicide resistance of Echinochloa spp.

in the Mekong Delta.4 Weed control efficacy of rinskor in Echinochloa spp. in the Mekong Delta .1 Control efficacy of rinskor as a new herbicide against three Echinochloa spp. groups collected in the Mekong Delta .2 Control efficacy of rinskor as new herbicide against Echinochloa spp. populations collected in Mekong Delta .3 Correlation between resistance level of bispyribac, penoxsulam and quinclorac .4 Efficacy of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in susceptible E.

crus-galli compared to resistant plants .5 Efficacy of rinskor for control of susceptible or resistant barnyardgrass to bispyribac, penoxsulam and quinclorac .5 Biodiversity study by RAPD analysis in 15 barnyardgrass populations from Vietnam and the U.1 RAPD analysis of 15 barnyardgrass populations .2 The genetic diversity of Echinochloa crus-galli and herbicide resistance level .6 Biochemical mechanism and molecular mechanism of quinclorac resistance in barnyardgrass .1 B-CAS activity in 5 quinclorac resistant barnyardgrass populations .2 CAS transcript abundance in leaf tissue of five barnyardgrass populations .3 Biochemical and molecular mechanism of quinclorac resistance in Echinochloa crus-galli in Mekong Delta .101 CONCLUSIONS AND RECOMMENDATIONS .103 viii LIST OF TABLES Page Table 3.1 List of primers were used for RAPD analysis in the research .2 Steps in PCR reactions .3 RT-qPCR primer sequence detecting β-CAS and β-Actin synthase .1 Rice cultivation practice of farmer in Mekong Delta .2 Farmer perception about important weed species in rice field at 7 provinces of Mekong Delta .3 Farmer response about most escaped weed after herbicide treatments and need hand-weeding to control .4 The three most popular herbicides for escaped Echinochloa spp. control in Mekong Delta .5 The cost for weed management in Mekong Delta.6 Plant characteristic of Echinochloa spp. collected in Mekong Delta .7 Distribution of Echinochloa species in Mekong Delta .8 Herbicide-resistance level in populations to bispyribac, penoxsulam and quinclorac in different provinces .9 Percent of solo-resistance and multiple-resistance herbicides in three groups of Echinochloa spp.10 Percent of barnyardgrass population resistant to single and multiple herbicides of bispyribac, penoxsulam and quinclorac in different provinces .11 Resistance Score of bispyribac, penoxsulam and quinclorac herbicide- resistance of 78 Echinochloa spp.12 Average LD90 of 3 Echinochloa groups to bispyribac, penoxsulam, quinclorac and rinskor .13 Average LD90 of barnyardgrass population to bispyribac, penoxsulam, quinclorac and rinskor .14 Six informative primers in RAPD analysis of Echinochloa crus-galli populations.15 Lethal dose of quinclorac needed to kill 90% of the population (LD 90) and the Resistance level of 15 Echinochloa crus-galli populations collected in Vietnam and U.16 Mortality of herbicide susceptible (S) and herbicide resistant (R) barnyardgrass treated by rinskor at different dose .17 Six informative primers in RAPD analysis of Echinochloa crus-galli populations.