Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể Neurokinin 1 người tái tổ hợp cho phát triển dược phẩm

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

2. DANH MỤC CÁC BẢNG

3. DANH MỤC CÁC HÌNH

4. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

6. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

7. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

8. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

8.1. THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN

8.1.1. Các dạng thụ thể và phối tử

8.1.2. Cấu trúc của GPCR

8.1.3. Cơ chế hoạt động của GPCR

8.1.4. Các phương pháp phân tích GPCR

8.2. TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ

8.2.1. Các phối tử tachykinin

8.2.2. Các dạng thụ thể neurokinin

8.3. SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO

8.3.1. Các dạng thụ thể neurokinin-1 ở người

8.3.2. Đáp ứng tế bào được kích hoạt bởi phối tử SP thông qua NK1R

8.3.3. Ứng dụng của các chất đối kháng NK1R

8.3.4. Phân tích chức năng thụ thể dựa vào thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào

8.4. CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN THỤ THỂ TÁI TỔ HỢP

8.4.1. Hệ thống dịch mã phi tế bào

8.4.2. Hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ

8.4.3. Hệ thống biểu hiện ở nấm men

8.4.4. Hệ thống biểu hiện ở các tế bào côn trùng

8.4.5. Hệ thống biểu hiện ở tế bào động vật có vú

8.5. SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY THUỐC VÀ HOẠT CHẤT ĐƯỢC THỬ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU

8.6. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

8.6.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

8.6.1.1. Các vector nhân dòng và biểu hiện

8.6.1.2. Các mồi và đoạn oligonucleotide dùng trong nghiên cứu

8.6.1.3. Các dòng tế bào và môi trường nuôi cấy

8.6.1.4. Tinh chất và dịch chiết methanol thực vật

8.6.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

8.6.2.1. Hóa chất nghiên cứu chính

8.6.2.2. Thiết bị và địa điểm nghiên cứu

8.6.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

8.6.3.1. Phát triển hệ thống vector SFV biểu hiện NK1R

8.6.3.2. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ

8.6.3.3. Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R của người

8.6.3.4. Biểu hiện NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV

8.6.3.5. Đánh giá mức độ biểu hiện và hoạt tính NK1R

8.6.3.6. Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của một số dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp

8.6.3.7. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu

9. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

9.1. THIẾT KẾ HỆ VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI

9.1.1. Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen trong PCR

9.1.2. Thiết kế vector biểu hiện pSFV-KLEPT1

9.1.3. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1

9.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1

9.1.5. Nhân dòng, tách chiết và bảo quản các vector

9.2. TẠO HẠT SFV MANG TRÌNH TỰ NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI

9.2.1. Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ

9.2.2. Tạo hạt SFV tái tổ hợp từ tế bào BHK-21

9.3. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

9.4. ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO BUỒNG TRỨNG CHUỘT HAMSTER TRUNG QUỐC (CHO)

9.4.1. Đánh giá động học biểu hiện protein

9.4.2. Kiểm tra biểu hiện NK1R trên tế bào CHO qua lai Western

9.4.3. Phép thử chức năng thụ thể bằng Fura-2AM

9.5. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO DỊCH CHIẾT METHANOL VÀ TINH CHẤT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN NK1R TÁI TỔ HỢP

9.5.1. Xác định các thông số dược lực học của chất chủ vận và chất đối kháng đặc hiệu NK1R

9.5.2. Đánh giá tương tác giữa thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết methanol và tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam

10. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

11. PHÁT TRIỂN VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R CỦA NGƯỜI TRÊN TẾ BÀO CHO

12. NGHIÊN CỨU CÁC DẠNG BIẾN THỂ CỦA THỤ THỂ

13. NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO CÁC HOẠT CHẤT HƯỚNG ĐÍCH THỤ THỂ NK1R TÁI TỔ HỢP

14. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

I. Vector biểu hiện và thiết kế vector

Nghiên cứu tập trung vào thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện thụ thể Neurokinin 1 (NK1R) tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Vector biểu hiện được phát triển dựa trên hệ thống Semliki Forest Virus (SFV), một công nghệ sinh học tiên tiến cho phép biểu hiện protein màng hiệu quả. Quá trình thiết kế bao gồm việc tạo vector pSFV-KLEPT1 và pSFV-EGFP-NK1, nhằm đảm bảo biểu hiện gen NK1R ở mức cao và ổn định. Thiết kế vector này là bước đầu tiên quan trọng trong việc tạo ra protein tái tổ hợp có chức năng, phục vụ cho các nghiên cứu dược lý học.

1.1. Thiết kế vector pSFV KLEPT1

Vector pSFV-KLEPT1 được thiết kế để chứa trình tự mã hóa thụ thể NK1 người. Quá trình này bao gồm việc sử dụng các kỹ thuật di truyền như PCR để khuếch đại gen NK1R và chèn vào vector. Vector tái tổ hợp này sau đó được nhân dòng và tách chiết để đảm bảo chất lượng trước khi sử dụng trong các thí nghiệm biểu hiện.

1.2. Tạo vector pSFV EGFP NK1

Vector pSFV-EGFP-NK1 được thiết kế để kết hợp gen NK1R với protein huỳnh quang EGFP, giúp theo dõi biểu hiện thụ thể trên tế bào. Quá trình này bao gồm việc cắt và nối các đoạn gen, sau đó kiểm tra bằng điện di và giải trình tự để đảm bảo độ chính xác.

II. Biểu hiện thụ thể NK1 tái tổ hợp

Nghiên cứu đã thành công trong việc biểu hiện thụ thể NK1 tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO. Biểu hiện gen NK1R được đánh giá thông qua các phương pháp như lai Western và phép thử chức năng thụ thể sử dụng Fura-2AM. Kết quả cho thấy protein tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao, đáp ứng với chất chủ vận SP (Substance P). Điều này khẳng định tính khả thi của việc sử dụng vector biểu hiện SFV trong nghiên cứu thụ thể tế bào.

2.1. Đánh giá biểu hiện NK1R trên tế bào CHO

Biểu hiện thụ thể NK1R trên tế bào CHO được đánh giá thông qua phương pháp lai Western, sử dụng kháng thể đặc hiệu. Kết quả cho thấy sự hiện diện của protein tái tổ hợp với mức độ biểu hiện cao, đáp ứng yêu cầu cho các nghiên cứu dược lý.

2.2. Phép thử chức năng thụ thể

Phép thử chức năng sử dụng Fura-2AM được thực hiện để đánh giá hoạt tính của thụ thể NK1 tái tổ hợp. Kết quả cho thấy thụ thể đáp ứng với chất chủ vận SP, thể hiện qua sự thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào, khẳng định tính chức năng của protein tái tổ hợp.

III. Ứng dụng trong phát triển dược phẩm

Nghiên cứu đã ứng dụng thụ thể NK1 tái tổ hợp trong sàng lọc các hoạt chất từ dược liệu Việt Nam. Các dịch chiết methanol và tinh chất từ 10 loài dược liệu được thử nghiệm để đánh giá hoạt tính ức chế thụ thể NK1. Kết quả cho thấy một số dược liệu có tiềm năng trong việc phát triển thuốc hướng đích NK1R, mở ra hướng nghiên cứu mới trong phát triển dược phẩm từ nguồn dược liệu tự nhiên.

3.1. Sàng lọc hoạt chất từ dược liệu

Các dịch chiết methanol từ dược liệu như Bình vôi, Hồ tiêu, và Hòe được thử nghiệm trên thụ thể NK1 tái tổ hợp. Kết quả cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể, khẳng định tiềm năng của các dược liệu này trong phát triển thuốc.

3.2. Đánh giá tương tác thụ thể

Nghiên cứu đã đánh giá tương tác giữa thụ thể NK1 tái tổ hợp và các tinh chất từ dược liệu. Kết quả cho thấy mối tương quan giữa hàm lượng tinh chất và hoạt độ ức chế, cung cấp cơ sở khoa học cho việc phát triển các thuốc hướng đích NK1R.

Luận Văn Thạc Sĩ: Thiết Kế Vector Biểu Hiện Thụ Thể Neurokinin 1 Ứng Dụng Trong Nghiên Cứu Dược Phẩm