MỞ ĐẦU Ngày nay, công nghệ protein đang được ứng dụng rộng rãi và phát triển dẫn đến công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp được nghiên cứu mạnh để đáp ứng nhu cầu thị trường. Chỉ tính riêng trong năm 2008, tổng giá trị toàn cầu của protein tái tổ hợp đạt 87 tỷ đô là và tăng lên đến 163 tỷ đô la trong năm 2016. Việc ứng dụng protein tái tổ hợp trong các ngành công nghiệp, đặc biệt ngành công nghiệp dược phẩm, đang được mở rộng. Tuy nhiên giá thành hiện nay của các chế phẩm protein tái tổ hợp vẫn còn ở mức cao mặc dù sản lượng sản xuất từ việc lên men vi sinh vật liên tục cao với chi phí khá khiêm tốn.
Nguyên nhân chủ yếu đến từ bước tinh sạch và thu nhận sản phẩm sau khi nuôi cấy chiếm hơn 60% tổng chi phí sản xuất và chiếm 70% chi phí vốn đầu tư đối với các sản phẩm sinh hóa. Các phương pháp được sử dụng để tinh sạch trong quy mô công nghiệp thường yêu cầu nhiều bước sắc ký nhằm thu nhận được lượng protein tinh sạch cao tuy nhiên sản lượng lại rất thấp. Do đó, ứng dụng đuôi ái lực trong việc tinh sạch protein tái tổ hợp hiện nay đang là một phương pháp tối ưu. Các đuôi ái lực có bản chất là protein có thể dễ dàng tinh sạch và thu nhận protein mục tiêu đạt độ tinh sạch cao và hiệu quả tốt.
Tuy nhiên, việc lựa chọn hệ thống đuôi ái lực để ứng dụng trong việc tinh sạch protein cũng là một sự lựa chọn khó khăn và phụ thuộc khá nhiều vào protein mục tiêu. Hiện nay, một số nghiên cứu đã chỉ ra việc sử dụng Carbonhydrate-binding module 20 (CBM20) như một đuôi ái lực để ứng dụng tinh sạch protein có hiệu quả tinh sạch khá cao và chi phí thấp. Do đó, với mục đích cung cấp thêm một sự lựa chọn trong việc sản xuất và tinh sạch protein tái tổ hợp, chúng tôi thực hiện nghiên cứu thử nghiệm một hệ thống sàng lọc nhờ đuôi ái lực CBM20 nhằm sàng lọc các loại protein tái tổ hợp có độ tinh sạch cao và chi phí thấp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Cùng với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ protein, trong những năm gần đây việc sử dụng các protein tái tổ hợp trong nhiều lĩnh vực được gia tăng mạnh mẽ.
Ngày nay, sản xuất một protein tái tổ hợp mới đem lại giá trị lợi nhuận hàng tỷ đô la, trong đó khoảng 25% dược phẩm thương mại là dược phẩm sinh học [1]. Ngoài ra, các enzyme ứng dụng trong lĩnh vực nhiên liệu sinh học hiện là một trong những sản phẩm có nhu cầu sản xuất cao. Một số loại enzyme lipase sản xuất từ nấm như: Candida rugosa (methanol) , Burkholderia cepacia (Methanol), Candida rugosa (Amano AY-30)(Methanol, n-hexane)…; hoặc một số enzyme ứng dụng trong sản xuất bioethanol như: Aspergillus niger (Cellulasea and β- glucosidase), Trichoderma.Tuy nhiên, đối với mục tiêu ở quy mô công nghiệp thường yêu cầu nhiều bước sắc ký liên tiếp nhau, mặc dù việc này có thể giúp thu nhận sản phẩm có độ tinh sạch khá cao nhưng sản lượng thu sản phẩm từ quá trình sắc ký nhiều bước như vậy lại khá thấp. Do đó, yêu cầu về việc giảm chi phí và tăng năng suất sản xuất thông qua quá trình đơn giản hóa quy trình tinh sạch sản phẩm được đặt ra [5].
Trong những năm gần đây, những phân tử tái tổ hợp có chứa một đuôi ái lực đã được ứng dụng rộng rãi ở quy mô phòng thí nghiệm để biểu hiện và tinh sạch protein mục tiêu. Nhiều hệ thống đuôi ái lực được phát triển với đa dạng các loại protein, domains hoặc peptid ngắn có thể được dùng để gắn với protein mục tiêu [6,7]. Ưu điểm chung của phương pháp sử dụng các đuôi ái lực có bản chất protein là có thể dễ dàng tinh sạch và thu nhận lại protein tái tổ hợp, đồng thời có thể đáp ứng được yêu cầu về nồng độ sản phẩm. Tuy nhiên, việc lựa chọn hệ thống đuôi ái lực thích hợp để tinh sạch protein mục tiêu là một vấn đề khó khăn, việc này phụ thuộc vào đặc tính của protein mục tiêu (tính ổn định, tính kỵ nước,…), các hệ thống biểu hiện và mục tiêu ứng dụng của sản phẩm protein.
Với mục đích cung cấp thêm một sự lựa chọn khác giúp dễ dàng cho việc sản xuất và tinh sạch protein, đề tài thực hiện nghiên cứu thử nghiệm một hệ thống sàng lọc nhờ đuôi ái lực là một đoạn peptide ngắn Carbohydrate-binding module 20 (CBM20), ứng dụng vào việc sàng lọc các loại protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao và chi phí thấp. Nhiên liệu sinh học Ngày nay, nhiên liệu sinh học (biofuel) đang là một chủ đề nóng được giới khoa học quan tâm vì những lợi ích về môi trường mà nhiên liệu mang đến. Ngoài ra, trong thời điểm nhiên liệu hóa thạch ngày càng khan hiếm, việc tìm kiếm một nguồn nhiên liệu sinh học có nguồn gốc tổng hợp đang đặt ra một nhu cầu cần thiết. Trong năm 2010, sản lượng nhiên liệu 7 sinh học được sản xuất đạt mức 105 tỷ lít, tăng 17% so với năm 2009; cung cấp 2,7% lượng nhiên liệu cho xe cộ đi lại [18].
Nhiên liệu sinh học bao gồm được chia làm ba loại với nguồn gốc khác nhau: Diesel sinh học (Biodiesel), Xăng sinh học (Biogasoline), Khí sinh học (Biogas). Trong đó, xăng sinh học đang là đối tượng được quan tâm vì nguồn gốc xuất phát từ việc lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose. Hiện nay, hai loại sản phẩm biogasoline tiềm năng đang được quan tâm: sinh khối lignocellulose chứa các gốc đường (cellulose và hemicellulose) lignin và dầu thực vật không tiêu thụ được (triglyceride) từ sinh khối chất béo [19]. Việc sử dụng để chuyển đổi từ các nguyên liệu hữu cơ không sử dụng có khá nhiều lợi ích: việc thay thế hoàn toàn sử dụng biogasoline sẽ hạn chế hoàn toàn sử dụng nhiên liệu thông thường, hướng đến thay thế hoàn toàn bằng nhiên liệu sinh học; giảm được tác động đến môi trường; việc sử dụng nguồn nguyên liệu hữu cơ là tinh bột, cellulose, lignocellulose từ các nguồn phế liệu sẽ giúp hạn chế việc ảnh hưởng đến nguồn thực phẩm [20].
Tuy nhiên, để hỗ trợ việc tạo ra các nhiên liệu sinh học một cách nhanh chóng và có hiệu quả, phương pháp sử dụng các loại enzyme phân hủy tinh bột đang được sử dụng rộng rãi. Hiện nay, đã có một số công trình nghiên cứu tìm thấy các chủng vi sinh vật biểu hiện lượng lớn (trên 50%) enzyem ứng dụng cho sản xuất biofuel như: lipase (Candida rugosa (methanol), Burkholderia cepacia (methanol), Candida antarctica, Pseudomonas cepacia (methanol và n-haxane)), cellulase (Trichod erma. reesei ATCC 26921), β- glucosidase (Trichoderma reeseii ATCC 26921, Aspergillus niger)… [24] để tạo sản phẩm biofuel từ các nguồn cơ chất đa dạngViệc biểu hiện một số loại enzyem phân hủy tinh bột, cellulose,… .Từ cơ sở trên, nhiều nhà khoa học đã được nghiên cứu trên một số đối tượng như E.coli để sản xuất isopentanol [21], Neurospora crassa để sản xuất ba loại enzyme có khả năng thủy phân cellulose cũng như hemicellulose [22]… Trong đó, hiện nay nổi bật trên cả là việc sử dụng N.crassa trong việc biểu hiện do chủng nấm có khả năng tiết nhiều loại enzyme thủy phân, cũng như có nhiều công bố về đặc tính di truyền, sinh hóa, sinh học phân tử [22]. Ngoài ra, sự tồn tại của đuôi ái lực CBM20 tại đầu C của enzyme PMOs đã mở ra một hướng ứng dụng tinh sạch enzyme này bằng phương pháp ái lực đơn giản bằng cột sắc ký [23].
Đuôi ái lực Khái niệm đuôi ái lực (affinity tag) xuất hiện khi các kỹ thuật di truyền được phát triển giúp cho việc tinh sạch protein tái tổ hợp trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn. Các hệ thống đuôi ái lực ứng dụng phương pháp sắc ký ái lực để sàng lọc protein. Theo phương pháp này, trình tự gene của protein mục tiêu được dung hợp với một trình tự DNA mã hóa cho các protein hoặc peptid ngắn và được biểu hiện đồng thời với gene mục tiêu. Kết quả là sẽ thu được một hệ thống gồm protein mục tiêu và một đoạn đuôi ái lực.
Đuôi ái lực này có khả năng tạo các liên kết đặc hiệu và thuận nghịch với một phân tử khác (ligand) có trong cơ chất không hòa 8 tan chứa trong cột sắc ký. Khi cho hỗn hợp protein cần làm sạch đi qua cột thì chỉ có protein mục tiêu được giữ lại, còn tất cả các thành phần khác không tương tác được với cơ chất sẽ bị rửa trôi ra khỏi cột. Tiếp đó, protein mục tiêu sẽ được rửa giải ra bằng các phương pháp khác nhau (Hình 1). Do đó, chỉ với một bước sắc ký hấp phụ và quy trình khá đơn giản, việc gắn các đuôi ái lực có thể cho phép sàng lọc được protein mục tiêu có độ tinh sạch và sản lượng cao.
Hệ thống đuôi ái lực được sử dụng để tinh sạch protein mục tiêu [8] Trong những năm gần đây, có nhiều loại đuôi ái lực peptide và protein được phát triển sử dụng để tăng cường sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ cho nghiên cứu. Những loại đuôi ái lực được sử dụng phổ biến hiện nay gồm có: Arg-tag, calmodulin-biding peptide, cellulose- binding domain, DsbA, c-myc-tag, glutathione S-transferase, FLAG-tag, HAT-tag, His-tag, maltose-binding protein, NusA, S-tag, SBP-tag, Strep-tag, và thioredoxin. Những hệ thống đuôi ái lực này có các đặc điểm chung như sau: (a) chỉ cần một bước hấp phụ để tinh sạch protein tái tổ hợp; (b) ít có ảnh hưởng đối với cấu trúc bậc ba và hoạt tính sinh học của 9 protein; (c) có thể dễ dàng loại bỏ để thu nhận protein mục tiêu; (d) phương pháp thực hiện đơn giản và dễ thực hiện; (e) có thể áp dụng được với nhiều loại protein khác nhau [6]. Mặc dù nhiều hệ thống đuôi ái lực đã được áp dụng khá thành công ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng chỉ có đuôi glutathione S-transferase (GST) và đuôi poly-His được sử dụng trong sản xuất.
Những rào cản đối với việc ứng dụng các đuôi ái lực vào sản xuất quy mô lớn là cần phải có những liên kết ái lực tương đối bền vững và các loại cơ chất trong cột sắc ký phải có khả năng chống chịu lại với các chu trình xử lý và khử trùng lặp lại ở quy mô công nghiệp [5]. Ngoài ra, vấn đề chi phí cũng là một trở ngại lớn, ảnh hưởng đến việc sử dụng các đuôi ái lực thương mại ở quy mô sản xuất lớn. Vì vậy, việc phát triển một loại đuôi ái lực mới có thể liên kết với các vật liệu cơ chất rẻ tiền, chịu được các điều kiện hóa học và vật lý là một trong những đóng góp vào sự phát triển của công nghiệp sản xuất protein tái tổ hợp.