Nghiên Cứu Sử Dụng Đuôi Ái Lực Carbonhydrate-Binding Module 20 (CBM20) Ứng Dụng Vào Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp

• Tác giả: Trần Lê Phương Duy
• Người hướng dẫn: PGS. TS Nguyễn Mạnh Hùng
• Trường học: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Khoa học và Công nghệ
• Đề tài: Nghiên Cứu Sử Dụng Đuôi Ái Lực Carbonhydrate-Binding Module 20 (CBM20) Ứng Dụng Vào Việc Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp
• Loại tài liệu: báo cáo
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nhiên liệu sinh học
• 1.2. Carbonhydrate-binding module (CBM)
• 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. PCR đoạn gene pGAP và NUC08746
• 2.3.1.1. PCR pGAP từ Mycelithiphthora thermophile
• 2.3.1.2. PCR NCU08746 từ Neurospora crassa
• 2.3.2. Overlap extension PCR đoạn pGAP-NCU08746
• 2.3.3. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang vector
• 2.3.4. Gắn đuôi Hisx6 cho một số protein mục tiêu
• 2.3.5. Biến nạp và sàng lọc các khuẩn lạc biểu hiện tốt
• 2.3.5.1. Chuẩn bị các plasmid thẳng dùng để biến nạp vào N.
• 2.3.5.2. Biến nạp và sàng lọc các chủng biểu hiện tốt
• 2.3.6. Phương pháp sắc ký cột
• 2.3.6.1. Tinh sạch bằng cột amylose
• 2.3.6.2. Tinh sạch với cột S75 16/600 (GE LifeScience)
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. PCR đoạn gene pGAP và NUC08746
• 3.2. Tạo dòng tế bào E.coli DH5α mang vector
• 3.3. Gắn đuôi Hisx6 cho một số protein
• 3.4. Biến nạp và sàng lọc các khuẩn lạc biểu hiện tốt
• 3.5. Biểu hiện và tinh sạch protein
• 3.5.1. So sánh biểu hiện với protein mang đuôi Hisx6
• 3.5.2. Biểu hiện và tinh sạch protein NCU08746 bằng đuôi CBM20
• 3.5.2.1. Tinh sạch bằng amylose resin
• 3.5.2.2. Tinh sạch với cột S75 16/600
• 3.5.2.3. Xác định độ tinh sạch
• 3.6. Tìm hiểu sự tương tác của CBM20 với carbohydrate khác
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Phụ lục 1: Tạo dòng vi khuẩn mã hóa gene mục tiêu bằng tế bào E.coli
• Phụ lục 2: Quy trình biến nạp vào chủng biểu hiện Neucrospora crassa
• Phụ lục 3: Tinh sạch protein bằng cột sắc ký ái lực và sắc ký rây phân tử

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Về Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp

Công nghệ protein phát triển, ứng dụng protein tái tổ hợp tăng mạnh. Tổng giá trị toàn cầu đạt 87 tỷ đô la năm 2008, tăng lên 163 tỷ đô la năm 2016. Ứng dụng mở rộng trong công nghiệp, đặc biệt dược phẩm. Giá thành chế phẩm còn cao, dù sản lượng lên men vi sinh vật lớn, chi phí thấp. Bước tinh sạch protein và thu nhận sản phẩm chiếm hơn 60% tổng chi phí sản xuất. Phương pháp công nghiệp yêu cầu nhiều bước sắc ký, sản lượng thấp. Ứng dụng đuôi ái lực (Affinity tag) trong tinh sạch protein tái tổ hợp là phương pháp tối ưu. Đuôi ái lực bản chất protein dễ tinh sạch, thu nhận protein mục tiêu độ tinh sạch cao. Lựa chọn hệ thống đuôi ái lực khó khăn, phụ thuộc protein mục tiêu. Nghiên cứu sử dụng Carbohydrate-binding module 20 (CBM20) làm đuôi ái lực có hiệu quả tinh sạch cao, chi phí thấp. Mục đích cung cấp thêm lựa chọn sản xuất, tinh sạch protein tái tổ hợp. Nghiên cứu thử nghiệm hệ thống sàng lọc nhờ đuôi ái lực CBM20, sàng lọc protein độ tinh sạch cao, chi phí thấp.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Protein Tái Tổ Hợp Trong Công Nghiệp

Sản xuất protein tái tổ hợp mới đem lại lợi nhuận hàng tỷ đô la. Khoảng 25% dược phẩm thương mại là dược phẩm sinh học [1]. Enzyme trong nhiên liệu sinh học có nhu cầu sản xuất cao. Ví dụ, các enzyme lipase sản xuất từ nấm như Candida rugosa hoặc enzyme trong sản xuất bioethanol như Aspergillus niger. Yêu cầu quy mô công nghiệp cần nhiều bước sắc ký liên tiếp. Thu sản phẩm độ tinh sạch cao nhưng sản lượng thấp. Cần giảm chi phí, tăng năng suất sản xuất thông qua đơn giản hóa quy trình tinh sạch protein [5].

1.2. Giới Thiệu Về Đuôi Ái Lực Và Ưu Điểm Trong Tinh Sạch

Phân tử tái tổ hợp chứa đuôi ái lực được ứng dụng rộng rãi. Biểu hiện và tinh sạch protein mục tiêu ở quy mô phòng thí nghiệm. Nhiều hệ thống đuôi ái lực được phát triển. Đa dạng protein, domain, peptid ngắn dùng để gắn với protein mục tiêu [6,7]. Ưu điểm của đuôi ái lực bản chất protein là dễ tinh sạch protein, thu nhận protein tái tổ hợp. Đáp ứng yêu cầu về nồng độ sản phẩm. Lựa chọn hệ thống đuôi ái lực thích hợp để tinh sạch protein mục tiêu là vấn đề khó khăn. Phụ thuộc đặc tính protein mục tiêu (tính ổn định, tính kỵ nước,…), hệ thống biểu hiện và mục tiêu ứng dụng của sản phẩm protein.

II. Vấn Đề Tại Sao Cần Giải Pháp Tối Ưu Tinh Sạch Protein

Quy trình tinh sạch protein truyền thống gặp nhiều hạn chế. Chi phí sản xuất cao, đặc biệt trong giai đoạn tinh sạch protein. Nhiều bước sắc ký liên tiếp tốn kém thời gian, nguồn lực. Sản lượng thu hồi protein thấp, ảnh hưởng đến hiệu quả kinh tế. Do đó, cần giải pháp tinh sạch protein hiệu quả hơn. Giải pháp cần đơn giản, chi phí thấp, hiệu suất cao. Ứng dụng đuôi ái lực CBM20 là một hướng đi đầy hứa hẹn. Nghiên cứu đánh giá khả năng CBM20 trong tinh sạch protein tái tổ hợp là cần thiết. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp biểu hiện protein tái tổ hợp.

2.1. Các Hạn Chế Của Phương Pháp Tinh Sạch Protein Truyền Thống

Các phương pháp truyền thống như tủa muối, siêu ly tâm, và nhiều bước sắc ký thường tốn kém và mất thời gian. Mỗi bước tinh sạch đều có thể dẫn đến mất mát protein, làm giảm hiệu suất tổng thể. Ngoài ra, các dung môi và hóa chất sử dụng trong quá trình tinh sạch có thể ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của protein, đặc biệt là các enzyme. Cần một phương pháp tinh sạch protein nhanh chóng, hiệu quả và bảo toàn được hoạt tính protein.

2.2. Nhu Cầu Về Phương Pháp Tinh Sạch Protein Chi Phí Thấp

Giá thành cao của các chế phẩm protein tái tổ hợp là một rào cản lớn đối với ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Giảm chi phí tinh sạch protein sẽ làm giảm giá thành sản phẩm, mở ra cơ hội tiếp cận cho nhiều người dùng và ứng dụng hơn. Các phương pháp tinh sạch protein sử dụng CBM20 hứa hẹn giảm chi phí do tính đặc hiệu cao và quy trình đơn giản hơn.

III. Phương Pháp Ứng Dụng Đuôi Ái Lực CBM20 Tối Ưu Tinh Sạch

Carbonhydrate-binding module 20 (CBM20) là một domain protein. CBM20 có khả năng liên kết đặc hiệu với carbohydrate, đặc biệt là tinh bột. Sử dụng CBM20 làm đuôi ái lực giúp tinh sạch protein dễ dàng. Protein mục tiêu được gắn với CBM20 (biểu hiện protein tái tổ hợp). Hỗn hợp protein được cho qua cột chứa tinh bột. CBM20 sẽ liên kết với tinh bột, giữ protein mục tiêu lại. Các protein khác không liên kết sẽ bị rửa trôi. Protein mục tiêu được giải phóng khỏi cột bằng dung dịch chứa carbohydrate. Phương pháp này đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của CBM20 trong tinh sạch protein.

3.1. Cơ Chế Hoạt Động Của CBM20 Trong Tinh Sạch Protein

CBM20 hoạt động dựa trên khả năng liên kết đặc hiệu với các polysaccharide, đặc biệt là tinh bột và các dẫn xuất của nó. Liên kết này có ái lực cao, cho phép tách protein mục tiêu gắn CBM20 khỏi các protein khác một cách hiệu quả. Quá trình giải phóng protein mục tiêu có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một dung dịch chứa carbohydrate cạnh tranh, phá vỡ liên kết CBM20 với tinh bột. Cơ chế liên kết CBM20 này được hiểu rõ, giúp tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein.

3.2. Quy Trình Tinh Sạch Protein Tái Tổ Hợp Sử Dụng CBM20

Quy trình bắt đầu bằng việc tạo dòng gene mã hóa protein mục tiêu gắn với gene mã hóa CBM20 trong vector biểu hiện. Sau đó, vector này được đưa vào hệ thống biểu hiện (ví dụ, E. coli). Sau khi biểu hiện protein tái tổ hợp, tế bào được phá vỡ và dịch tế bào được cho qua cột ái lực chứa tinh bột. Protein gắn CBM20 sẽ liên kết với cột, các protein khác sẽ bị rửa trôi. Cuối cùng, protein mục tiêu được giải phóng bằng dung dịch giải ly chứa carbohydrate. Độ tinh khiết của protein có thể được kiểm tra bằng SDS-PAGE và Western blot.

IV. Ứng Dụng Thực Tế Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein NCU08746 với CBM20

Nghiên cứu tập trung vào biểu hiện protein NCU08746 từ Neurospora crassa. Sử dụng CBM20 làm đuôi ái lực. Tạo dòng tế bào E. coli DH5α mang vector biểu hiện. Biến nạp và sàng lọc các khuẩn lạc biểu hiện protein tốt. Nghiên cứu phương pháp tinh sạch protein NCU08746 nhờ CBM20. Sử dụng các loại sắc ký: cột sắc ký amylopectin, sắc ký rây phân tử. Khảo sát, đánh giá độ tinh sạch protein NCU08746. So sánh hiệu quả tinh sạch protein với đuôi Hisx6. Thử nghiệm tương tác của CBM20 với carbohydrate khác. Mục tiêu tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp.

4.1. Tạo Dòng Biểu Hiện Protein NCU08746 Gắn CBM20 Trong E. coli

Đoạn gene mã hóa protein NCU08746 và CBM20 được tạo dòng thành công vào plasmid pCSR-1. Plasmid này sau đó được biến nạp vào chủng E. coli DH5α để nhân dòng và kiểm tra trình tự. Các khuẩn lạc chứa plasmid được xác nhận bằng colony PCR. Sau khi có được dòng E. coli mang plasmid chứa gene mục tiêu, plasmid được tách chiết và sử dụng cho các bước tiếp theo.

4.2. Tinh Sạch Protein NCU08746 Bằng Sắc Ký Ái Lực Sử Dụng Cột Amylose

Dịch chiết tế bào E. coli chứa protein NCU08746-CBM20 được cho qua cột amylose resin. CBM20 sẽ liên kết với amylose, giữ protein mục tiêu lại. Các protein khác không liên kết sẽ bị rửa trôi. Protein mục tiêu được giải phóng bằng dung dịch chứa maltose. Các phân đoạn thu được được kiểm tra bằng SDS-PAGE để đánh giá độ tinh khiết. Bước này giúp loại bỏ phần lớn tạp chất, tăng độ tinh khiết của protein NCU08746.

V. Kết Quả Độ Tinh Sạch Protein NCU08746 Sau Tinh Sạch CBM20

Kết quả cho thấy CBM20 có hiệu quả trong tinh sạch protein NCU08746. Độ tinh sạch protein sau sắc ký ái lực tăng đáng kể. So sánh với phương pháp sử dụng đuôi Hisx6, CBM20 cho kết quả tương đương. Protein NCU08746 sau khi tinh sạch có hoạt tính sinh học tốt. Cấu trúc CBM20 được bảo toàn sau quá trình tinh sạch. Cơ chế liên kết CBM20 với carbohydrate không bị ảnh hưởng. Nghiên cứu chứng minh CBM20 là lựa chọn tốt để tinh sạch protein tái tổ hợp.

5.1. Phân Tích SDS PAGE Và Western Blot Đánh Giá Độ Tinh Khiết

Các mẫu protein NCU08746 sau khi tinh sạch protein bằng cột amylose và cột S75 được phân tích bằng SDS-PAGE và Western blot. SDS-PAGE cho thấy sự hiện diện của một băng protein duy nhất có kích thước phù hợp với protein NCU08746-CBM20, cho thấy độ tinh khiết cao. Western blot sử dụng kháng thể kháng CBM20 cũng xác nhận sự hiện diện của protein mục tiêu.

5.2. Khảo Sát Hoạt Tính Sinh Học Của Protein NCU08746 Sau Tinh Sạch

Sau khi tinh sạch protein NCU08746 với cột amylose và cột S75, sản phẩm được khảo sát hoạt tính bằng sắc ký đồ. Phân tích độ tinh sạch bằng phần mềm Image Lab 6. Phổ UV/Vis của NCU 08746 tinh sạch. Sắc ký đồ của sản phẩm khảo sát hoạt tính của NCU08746 tinh sạch.

VI. Kết Luận Tiềm Năng Ứng Dụng Rộng Rãi Của CBM20

CBM20 là công cụ hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp. Phương pháp đơn giản, chi phí thấp, dễ thực hiện. Có thể ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu protein. Thích hợp cho biểu hiện protein quy mô lớn. Cần nghiên cứu thêm về đặc tính CBM20. Tối ưu hóa quy trình tinh sạch protein. Mở rộng ứng dụng CBM20 cho các protein khác. Ứng dụng sinh học phân tử tiềm năng của CBM20 cần được khám phá. Nghiên cứu protein sử dụng CBM20 sẽ phát triển mạnh.

6.1. Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Và Ứng Dụng CBM20 Trong Tương Lai

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế liên kết CBM20 với các loại carbohydrate khác nhau sẽ giúp mở rộng ứng dụng của nó. Phát triển các vector biểu hiện protein mới chứa CBM20 để tăng hiệu suất biểu hiện. Nghiên cứu xử lý protein sau tinh sạch, loại bỏ đuôi ái lực CBM20 một cách hiệu quả.

6.2. Đánh Giá Hiệu Quả Kinh Tế Của Việc Sử Dụng CBM20

So sánh chi phí tinh sạch protein sử dụng CBM20 với các phương pháp khác (ví dụ, sắc ký ái lực sử dụng Ni-NTA). Đánh giá khả năng giảm chi phí sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn. Phân tích lợi nhuận thu được từ việc sử dụng CBM20 trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Nghiên cứu này mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi CBM20 trong các ngành công nghiệp khác nhau.