Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin

Aptamer là các đoạn oligonucleotide (DNA hoặc RNA sợi đơn) hoặc peptide có khả năng liên kết đặc hiệu và ái lực cao với một phân tử đích cụ thể. 67 trang.

• Đề tài: Nghiên Cứu Sàng Lọc Và Thu Nhận Aptamer Đặc Hiệu Kháng Sinh Neomycin

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
• 1.1. Tổng quan về kháng sinh Neomycin
• 1.1.1. Giới thiệu về kháng sinh Neomycin
• 1.1.2. Kháng sinh trong chăn nuôi
• 1.1.3. Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm
• 1.1.4. Các thông tin về hàm lượng kháng sinh an toàn trong thực phẩm
• 1.1.5. Các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh hiện nay
• 1.2. Tổng quan về aptamer
• 1.2.1. Giới thiệu về aptamer
• 1.2.2. Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of ligands by Exponential enrichment) sàng lọc aptamer
• 1.2.3. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị và máy móc
• 2.2. Môi trường và dung dịch nuôi cấy
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp PCR
• 2.3.2. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer
• 2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
• 2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose
• 2.3.5. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng
• 2.3.6. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli
• 2.3.7. Phương pháp tách DNA từ vi khuẩn E. coli chủng DH5a
• 2.3.8. Phương pháp ELISA
• 2.3.9. Phương pháp giải trình tự nucleic acid tự động
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
• 3.1. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết kháng sinh Neomycin
• 3.1.1. Kết quả tạo thư viện
• 3.1.2. Kết quả sàng lọc aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin
• 3.2. Kết quả tách dòng aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin
• 3.2.1. Nhân bản trình tự aptamer ssDNA liên kết kháng sinh Neomycin
• 3.2.2. Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng
• 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli
• 3.2.4. Kết quả tách plasmid từ vi khuẩn E. coli
• 3.3. Kết quả xác định khả năng liên kết giữa kháng sinh Neomycin và aptamer
• 3.4. Xác định trình tự aptamer đặc hiệu kháng sinh Neomycin
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng quan về Aptamer và vai trò trong phát hiện Neomycin

Aptamer là các đoạn oligonucleotide (DNA hoặc RNA sợi đơn) hoặc peptide có khả năng liên kết đặc hiệu và ái lực cao với một phân tử đích cụ thể. Được phát hiện vào năm 1990 bởi hai nhóm nghiên cứu độc lập (Ellington & Szostak; Tuerk & Gold), aptamer nhanh chóng nổi lên như một giải pháp thay thế ưu việt cho kháng thể trong nhiều lĩnh vực, từ chẩn đoán y học đến kiểm soát an toàn thực phẩm. Khác với kháng thể có bản chất protein, aptamer được tổng hợp hoàn toàn in vitro thông qua một quy trình gọi là SELEX (in vitro selection), cho phép tạo ra các phân tử nhận diện với độ ổn định cao, kích thước nhỏ và chi phí sản xuất thấp. Neomycin, một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi để điều trị và phòng bệnh. Tuy nhiên, việc lạm dụng dẫn đến nguy cơ tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm như sữa, thịt, gây ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe người tiêu dùng và góp phần tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc. Do đó, việc phát triển các phương pháp phát hiện neomycin nhanh chóng, nhạy và chính xác là một nhu cầu cấp thiết. Aptamer đặc hiệu với neomycin chính là chìa khóa để giải quyết bài toán này, mở đường cho việc chế tạo các cảm biến sinh học aptamer (aptasensor) thế hệ mới.

1.1. Khái niệm và ưu điểm vượt trội của Oligonucleotide Aptamer

Aptamer, với bản chất là acid nucleic, sở hữu nhiều ưu điểm so với kháng thể truyền thống. Thứ nhất, aptamer có kích thước phân tử nhỏ hơn, cho phép chúng thâm nhập vào các vị trí khó tiếp cận và không gây ra đáp ứng miễn dịch khi sử dụng in vivo. Thứ hai, quy trình sản xuất aptamer bằng phương pháp SELEX hoàn toàn nhân tạo, không phụ thuộc vào hệ thống sinh học động vật, giúp loại bỏ sự biến thiên giữa các lô sản xuất và giảm thiểu chi phí. Thứ ba, aptamer có độ bền cao với nhiệt độ và các điều kiện môi trường khắc nghiệt, dễ dàng biến đổi hóa học để gắn thêm các phân tử chức năng (chất phát huỳnh quang, enzyme) mà không làm mất hoạt tính. Những đặc tính này làm cho aptamer trở thành công cụ lý tưởng cho việc phát triển các bộ kit chẩn đoán và cảm biến sinh học.

1.2. Tầm quan trọng của việc sàng lọc Aptamer đặc hiệu Neomycin

Việc sàng lọc và thu nhận aptamer có độ đặc hiệu của aptamer cao với neomycin mang ý nghĩa thực tiễn to lớn. Một aptamer đặc hiệu chỉ liên kết với neomycin mà không phản ứng chéo với các kháng sinh khác cùng nhóm aminoglycoside hoặc các phân tử khác trong mẫu thực phẩm. Điều này đảm bảo kết quả phân tích có độ chính xác cao, tránh các trường hợp dương tính giả. Aptamer đặc hiệu neomycin là thành phần cốt lõi để xây dựng các aptasensor có khả năng phát hiện tồn dư kháng sinh ở nồng độ rất thấp, đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm quốc tế. Sự thành công của nghiên cứu này sẽ cung cấp một công cụ mạnh mẽ và hiệu quả cho ngành công nghiệp thực phẩm, giúp kiểm soát chất lượng sản phẩm và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Thách thức từ tồn dư kháng sinh và hạn chế phương pháp cũ

Vấn đề tồn dư kháng sinh trong thực phẩm, đặc biệt là neomycin, đang là một mối lo ngại toàn cầu. Việc tiêu thụ gián tiếp các sản phẩm chứa dư lượng neomycin không chỉ gây ra các phản ứng dị ứng ở những người nhạy cảm mà còn là nguyên nhân chính dẫn đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, một trong những mối đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất thế kỷ 21. Theo tài liệu nghiên cứu, tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở Việt Nam đang ở mức báo động, với nhiều mẫu thịt, sữa được phát hiện có dư lượng vượt ngưỡng cho phép. Để giải quyết vấn đề này, nhiều phương pháp phân tích đã được áp dụng. Tuy nhiên, các phương pháp truyền thống như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS) tuy cho độ chính xác cao nhưng lại đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, quy trình phức tạp và thời gian phân tích kéo dài. Trong khi đó, các phương pháp miễn dịch như ELISA tuy nhanh hơn nhưng lại phụ thuộc vào kháng thể, vốn có độ ổn định không cao và chi phí sản xuất lớn. Chính những hạn chế này đã thúc đẩy các nhà khoa học tìm kiếm một giải pháp mới, và aptamer đã chứng tỏ được tiềm năng vượt trội của mình.

2.1. Nguy cơ từ dư lượng kháng sinh Neomycin trong chuỗi thực phẩm

Neomycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside có phổ kháng khuẩn rộng, thường được dùng trong điều trị bệnh viêm vú ở bò sữa. Điều này làm tăng nguy cơ neomycin tồn dư trong sữa và các sản phẩm từ sữa. Việc người tiêu dùng thường xuyên tiếp xúc với lượng nhỏ kháng sinh này có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột, giảm khả năng miễn dịch và nghiêm trọng hơn là tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng thuốc phát triển. Khi một người bị nhiễm khuẩn bởi các chủng kháng thuốc, việc điều trị sẽ trở nên vô cùng khó khăn và tốn kém. Do đó, việc kiểm soát chặt chẽ tồn dư kháng sinh neomycin là bắt buộc để đảm bảo an toàn thực phẩm.

2.2. So sánh các kỹ thuật phát hiện Neomycin hiện có trên thị trường

Hiện nay, có nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát hiện neomycin. Các phương pháp hóa lý như HPLC và LC-MS/MS được coi là tiêu chuẩn vàng về độ chính xác, nhưng chi phí đầu tư và vận hành cao khiến chúng không phù hợp cho việc sàng lọc quy mô lớn. Phương pháp ELISA, dựa trên tương tác kháng nguyên - kháng thể, có chi phí thấp hơn và dễ thực hiện hơn. Tuy nhiên, kháng thể sử dụng trong ELISA có thể bị biến tính bởi nhiệt độ hoặc pH, và việc sản xuất chúng đòi hỏi quy trình phức tạp trên động vật. Sự ra đời của cảm biến sinh học aptamer hứa hẹn sẽ khắc phục được nhược điểm của cả hai nhóm phương pháp trên, mang đến một giải pháp vừa nhạy, đặc hiệu, vừa ổn định và tiết kiệm chi phí.

III. Phương pháp SELEX Chìa khóa sàng lọc Aptamer Neomycin

Quy trình sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin dựa trên một công nghệ nền tảng mang tên SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Đây là một phương pháp SELEX mạnh mẽ cho phép lựa chọn các trình tự oligonucleotide có ái lực liên kết cao nhất với một phân tử đích từ một thư viện DNA ngẫu nhiên khổng lồ. Quy trình này mô phỏng quá trình tiến hóa của Darwin trong ống nghiệm. Bắt đầu với một thư viện chứa hàng nghìn tỷ (10¹⁴ - 10¹⁵) chuỗi DNA hoặc RNA khác nhau, các nhà khoa học tiến hành ủ thư viện này với phân tử đích (neomycin). Chỉ những chuỗi có cấu trúc không gian phù hợp mới có thể liên kết với neomycin. Các chuỗi không liên kết sẽ bị rửa trôi. Những chuỗi đã liên kết thành công sẽ được thu lại, khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để tạo ra một thư viện mới, làm giàu các trình tự có khả năng liên kết. Quá trình chọn lọc và khuếch đại này được lặp đi lặp lại qua nhiều vòng (thường từ 7-15 vòng), với điều kiện sàng lọc ngày càng nghiêm ngặt hơn để tăng độ đặc hiệu của aptamer. Cuối cùng, các aptamer có ái lực cao nhất sẽ được tách dòng, giải trình tự và xác định.

3.1. Nguyên lý cốt lõi của kỹ thuật chọn lọc In Vitro Selection

Cốt lõi của phương pháp SELEX là quá trình in vitro selection (chọn lọc trong ống nghiệm). Không giống như sản xuất kháng thể cần đến cơ thể sống, toàn bộ quá trình SELEX diễn ra bên ngoài tế bào. Nguyên lý này dựa trên khả năng của các phân tử ssDNA (DNA sợi đơn) có thể tự cuộn gập thành các cấu trúc không gian ba chiều phức tạp và độc đáo. Từ một thư viện DNA ban đầu với độ đa dạng cực lớn, quá trình chọn lọc áp lực (selective pressure) sẽ loại bỏ dần các chuỗi có ái lực liên kết thấp, chỉ giữ lại và nhân lên những chuỗi liên kết mạnh nhất với phân tử đích. Quá trình này đảm bảo các aptamer cuối cùng có độ đặc hiệu và ái lực rất cao.

3.2. Xây dựng thư viện DNA ban đầu cho quá trình sàng lọc

Bước đầu tiên và quan trọng nhất trong quy trình SELEX là việc tạo ra một thư viện DNA ngẫu nhiên. Thư viện này bao gồm các phân tử ssDNA có cấu trúc chung gồm một vùng ngẫu nhiên ở giữa (thường từ 20-80 nucleotide) được kẹp bởi hai vùng trình tự cố định ở hai đầu. Vùng ngẫu nhiên quyết định sự đa dạng về cấu trúc không gian, trong khi hai vùng cố định đóng vai trò là vị trí bắt cặp cho mồi trong quá trình khuếch đại PCR. Trong nghiên cứu này, thư viện ssDNA có trình tự 5’- ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG –N40– AAG CTT TGG TGT TGG CTT CCG TAT -3’ đã được sử dụng, với vùng N40 đại diện cho 40 nucleotide ngẫu nhiên, tạo ra một không gian cấu trúc đủ lớn để tìm kiếm các aptamer tiềm năng.

IV. Quy trình chi tiết sàng lọc Aptamer kháng sinh Neomycin

Quy trình sàng lọc aptamer đặc hiệu neomycin được tiến hành một cách có hệ thống qua nhiều vòng lặp. Đầu tiên, thư viện DNA ban đầu được khuếch đại bằng PCR để tạo ra một lượng lớn các phân tử sợi đôi (dsDNA). Do chỉ có ssDNA mới có khả năng cuộn gập tạo cấu trúc không gian để liên kết với neomycin, sản phẩm PCR sợi đôi phải được xử lý để tạo thành sợi đơn. Enzyme λ exonuclease được sử dụng để cắt chọn lọc một trong hai sợi, tạo ra thư viện ssDNA sẵn sàng cho quá trình sàng lọc. Thư viện này sau đó được ủ với kháng sinh neomycin đã được cố định trên giá thể (cột agarose). Sau thời gian ủ, các phân tử ssDNA không liên kết hoặc liên kết yếu sẽ bị loại bỏ qua nhiều bước rửa với độ nghiêm ngặt tăng dần. Cuối cùng, các phân tử ssDNA có ái lực liên kết mạnh với neomycin được giải hấp (elution) khỏi cột, thu lại và sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR ở vòng tiếp theo. Quá trình này được lặp lại 7 vòng, với việc thay đổi các điều kiện như nồng độ chất tẩy rửa (Tween 20) để tăng tính chọn lọc và thu được aptamer có độ đặc hiệu của aptamer cao nhất.

4.1. Bước tạo ssDNA từ thư viện và quy trình đóng xoắn cấu trúc

Sau khi khuếch đại thư viện bằng PCR, sản phẩm thu được là dsDNA. Để tạo ssDNA, một trong hai mồi PCR được phosphoryl hóa ở đầu 5'. Enzyme λ exonuclease sau đó sẽ nhận biết và phân hủy sợi DNA được phosphoryl hóa này, để lại sợi DNA bổ sung ở dạng sợi đơn. Sau khi thu được ssDNA, chúng được xử lý nhiệt (biến tính ở 94°C) và sau đó làm lạnh từ từ để cho phép các sợi oligonucleotide tự cuộn gập thành các cấu trúc không gian ổn định. Quá trình đóng xoắn này là cực kỳ quan trọng, vì chính cấu trúc 3D độc đáo này quyết định khả năng nhận diện và liên kết đặc hiệu của aptamer với phân tử đích neomycin.

4.2. Các vòng sàng lọc và chiến lược tăng độ nghiêm ngặt

Quá trình sàng lọc gồm 7 vòng với kháng sinh đích và một vòng loại trừ cuối cùng. Trong mỗi vòng, các điều kiện được điều chỉnh để tăng độ nghiêm ngặt. Ví dụ, nồng độ Tween 20 trong dung dịch rửa được tăng dần từ 0,1% ở vòng 1 lên đến 1% ở các vòng giữa. Điều này giúp loại bỏ hiệu quả hơn các tương tác không đặc hiệu, đảm bảo chỉ những aptamer có ái lực liên kết mạnh nhất mới được giữ lại. Theo dõi nồng độ DNA qua mỗi bước (dịch qua cột, dịch rửa, dịch giải hấp) bằng máy NanoDrop cho phép kiểm soát sự làm giàu của thư viện qua từng vòng. Quá trình sàng lọc được dừng lại khi tỷ lệ DNA đặc hiệu thu được đạt khoảng 55% so với lượng đưa vào, cho thấy sự hội tụ của các trình tự có ái lực cao.

V. Kết quả và ứng dụng Hướng tới cảm biến sinh học Aptamer

Sau 7 vòng sàng lọc và một vòng loại trừ, nghiên cứu đã thành công trong việc thu nhận một tập hợp các aptamer có khả năng liên kết mạnh và đặc hiệu với kháng sinh neomycin. Các aptamer tiềm năng này đã được tách dòng vào vector plasmid và biến nạp vào vi khuẩn E. coli để nhân lên. Sau đó, các dòng plasmid được giải trình tự để xác định chuỗi nucleotide chính xác của từng aptamer. Khả năng và ái lực liên kết của các aptamer này với neomycin đã được kiểm chứng thông qua phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Kết quả ELISA cho thấy một số dòng aptamer, đặc biệt là dòng số 6, thể hiện khả năng gắn kết vượt trội với phức hợp Neomycin-BSA so với đối chứng. Phân tích cấu trúc không gian 3D của aptamer dòng số 6 cho thấy nó có khả năng hình thành các cấu trúc túi (pocket) phù hợp để "bắt giữ" phân tử neomycin. Những kết quả này không chỉ khẳng định sự thành công của phương pháp SELEX mà còn mở ra một hướng đi đầy hứa hẹn cho việc ứng dụng các aptamer này trong thực tiễn, đặc biệt là trong việc chế tạo các cảm biến sinh học aptamer (aptasensor) để phát hiện neomycin.

5.1. Xác định ái lực liên kết và độ đặc hiệu của Aptamer thu được

Để đánh giá chất lượng của các aptamer sau sàng lọc, phương pháp ELISA đã được sử dụng. Trong thí nghiệm này, phức hợp Neomycin-BSA được phủ lên giếng ELISA, sau đó các aptamer ssDNA đã được biotin hóa được cho vào để tương tác. Sự hiện diện của phức hợp aptamer-neomycin được phát hiện thông qua enzyme peroxidase liên kết với streptavidin (có ái lực với biotin). Kết quả đo độ hấp thụ quang (OD) cho thấy tín hiệu màu mạnh ở các giếng chứa aptamer tiềm năng, chứng tỏ đã có sự liên kết đặc hiệu xảy ra. Việc so sánh khả năng liên kết với các kháng sinh khác cùng nhóm aminoglycoside sẽ giúp khẳng định độ đặc hiệu của aptamer, một yếu tố then chốt cho ứng dụng thực tiễn.

5.2. Tiềm năng phát triển Aptasensor để phát hiện tồn dư kháng sinh

Aptamer đặc hiệu neomycin thu được là vật liệu nhận diện lý tưởng để phát triển các aptasensor. Đây là các thiết bị phân tích nhỏ gọn, kết hợp phần tử nhận diện sinh học (aptamer) với một bộ chuyển đổi tín hiệu (quang, điện hóa, áp điện). Khi aptamer liên kết với neomycin, sự thay đổi cấu trúc của nó sẽ tạo ra một tín hiệu có thể đo lường được. Các cảm biến sinh học aptamer có ưu điểm là cho kết quả nhanh (vài phút), độ nhạy cao, dễ sử dụng tại hiện trường mà không cần đến phòng thí nghiệm phức tạp. Việc thương mại hóa các bộ kit phát hiện neomycin dựa trên công nghệ aptamer sẽ là một bước tiến lớn trong việc đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lạm dụng kháng sinh trong nông nghiệp và chăn nuôi đang là mối đe dọa nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Theo các thống kê ngành, khoảng 5% tổng lượng kháng sinh tại Việt Nam được sử dụng trực tiếp trong thú y và nông nghiệp nhằm mục đích trị bệnh hoặc kích thích sinh trưởng. Tình trạng tồn dư kháng sinh không kiểm soát đã dẫn đến thực trạng báo động: khảo sát thực tế trên 149 mẫu thịt gia cầm thương phẩm cho thấy có tới 44,96% số mẫu vượt ngưỡng dư lượng cho phép từ 2,5 đến 1.100 lần. Đặc biệt, trong điều trị bệnh viêm vú ở bò sữa, kháng sinh nhóm Aminosid như Neomycin thường xuyên được sử dụng qua đường bơm trực tiếp vào bầu vú, khiến sữa nguyên liệu có nguy cơ cao tích tụ dư lượng vượt quá mức giới hạn tối đa cho phép (MRL là 1500 µg/kg theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT). Việc phơi nhiễm Neomycin thụ động hàng ngày gây ra nguy cơ ngộ độc thận không hồi phục, tổn thương ốc tai vĩnh viễn và thúc đẩy sự lan rộng của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc.

Xuất phát từ yêu cầu cấp thiết về kiểm soát an toàn thực phẩm, luận văn tập trung vào mục tiêu xây dựng quy trình công nghệ sàng lọc và phân lập các đoạn aptamer ssDNA có ái lực gắn kết đặc hiệu cao với kháng sinh Neomycin từ thư viện oligonucleotide ngẫu nhiên chứa khoảng 10^14 đến 10^15 phân tử. Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ Tế bào Động vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) trong năm 2015.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc làm chủ công nghệ SELEX cải tiến, tạo tiền đề chế tạo các thế hệ cảm biến sinh học (biosensor) và bộ kit thử nhanh có độ nhạy cao. Giải pháp này giúp cắt giảm ước tính 40% chi phí phân tích và rút ngắn thời gian phát hiện dư lượng Neomycin so với các phương pháp sắc ký phức tạp hiện hành.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng dựa trên hai nền tảng lý thuyết sinh học phân tử và dược lý học cốt lõi:

• Lý thuyết tiến hóa phân tử in vitro và tương tác Aptamer (Ellington & Szostak, 1990; Tuerk & Gold, 1990): Aptamer là các đoạn oligonucleotide đơn phân tử (ssDNA hoặc RNA) có khả năng tự cuộn gập thành các cấu trúc không gian ba chiều phức tạp (như hairpin-loop, pseudoknot, G-quadruplex). Chúng nhận diện và liên kết với cơ chất đích thông qua lực tương tác tĩnh điện, liên kết hydro và tương tác xếp chồng base với ái lực tương đương hoặc vượt trội so với kháng thể đơn dòng.
• Cơ chế tác động dược lý của kháng sinh nhóm Aminosid: Neomycin liên kết đặc hiệu với tiểu đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn, ức chế phức hợp khởi đầu tổng hợp chuỗi polypeptide và gây đọc sai mã thông tin di truyền của mRNA, dẫn đến tiêu diệt tế bào vi khuẩn.

Các khái niệm then chốt trong nghiên cứu bao gồm: quy trình SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), thư viện DNA sợi đơn (ssDNA), enzyme cắt chọn lọc Lambda Exonuclease, giới hạn dư lượng tối đa (MRL), và phản ứng miễn dịch liên kết enzyme (ELISA).

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu và thiết kế thư viện: Nghiên cứu sử dụng thư viện ssDNA nhân tạo có độ dài chuẩn khoảng 100 bp, gồm vùng ngẫu nhiên N40 (40 nucleotide) nằm giữa hai trình tự cố định ở đầu 5' và 3' phục vụ gắn mồi PCR (ApF2 và ApR2-Ph). Cỡ mẫu quần thể khởi đầu đạt độ phức tạp khoảng 10^14 đến 10^15 phân tử oligonucleotide độc bản. Cột ái sắc được cố định với 30 mg hạt agarose gắn kháng sinh Neomycin.
• Phương pháp chọn mẫu và sàng lọc SELEX: Áp dụng phương pháp SELEX cải tiến gồm 7 vòng sàng lọc dương tính (với cột agarose gắn Neomycin) và 1 vòng sàng lọc loại trừ (negative selection với hạt agarose trần). Lý do lựa chọn SELEX là khả năng làm giàu lũy thừa các phân tử có ái lực cao nhất từ một thư viện ngẫu nhiên khổng lồ mà không cần sử dụng động vật thí nghiệm. Độ nghiêm ngặt được nâng dần qua từng vòng bằng cách tăng nồng độ chất tẩy Tween 20 từ 0,1% lên 1,0% và thay cột mới từ vòng thứ 4.
• Phương pháp phân tích và xử lý mẫu: Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) khuếch đại mạch đôi, sau đó xử lý bằng enzyme Lambda exonuclease ở 37°C trong 4 giờ (bất hoạt ở 75°C trong 10 phút) để phân giải có chọn lọc mạch mang đầu 5'-phosphoryl, thu hồi ssDNA tinh sạch. Sản phẩm sau 7 vòng sàng lọc được tinh sạch bằng bộ kit chuyên dụng, gắn vào vector tách dòng pCR2.1-TOPO và biến nạp vào tế bào khả biến vi khuẩn Escherichia coli chủng DH5α qua phương pháp sốc nhiệt 42°C trong 60 giây. Khả năng liên kết được kiểm tra định lượng bằng phương pháp Direct ELISA (đo mật độ quang OD450/OD630) và giải trình tự nucleotide tự động theo nguyên lý Sanger.
• Timeline nghiên cứu: Toàn bộ quá trình tạo thư viện, tối ưu hóa điều kiện PCR, chu trình 8 vòng SELEX, biến nạp và phân tích cấu trúc được triển khai nghiêm ngặt trong lộ trình nghiên cứu tập trung.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

• Làm giàu thư viện ssDNA thành công với độ đặc hiệu cao: Phản ứng PCR nhân bản thư viện ban đầu tạo ra băng vạch sáng rõ, kích thước đồng nhất khoảng 100 bp trên gel agarose 1%. Ở vòng sàng lọc đầu tiên, từ 26,45 ng/µl ssDNA đưa vào cột, nồng độ dịch giải hấp bằng DMSO thu được đạt 12,95 ng/µl (tương đương 48,96% lượng ssDNA ban đầu), khẳng định phần lớn các phân tử oligonucleotide đã nhanh chóng gắn kết với đích Neomycin trong 1 giờ ủ.
• Nâng cao độ chọn lọc qua chuỗi vòng SELEX ngặt nghèo: Qua 7 vòng chọn lọc với áp lực chất tẩy Tween 20 tăng từ 0,1% lên 1,0%, lượng ssDNA liên kết không đặc hiệu bị rửa trôi triệt để (nồng độ dịch rửa giảm dần qua các bước từ 3,31 ng/µl xuống dưới 1,71 ng/µl). Tỷ lệ ssDNA đặc hiệu thu hồi sau bước giải hấp ở các vòng cuối đạt trên 55% so với tổng lượng đưa vào, đáp ứng chính xác tiêu chuẩn dừng quy trình SELEX.
• Loại trừ hoàn toàn liên kết nền bằng Negative SELEX: Vòng loại trừ với hạt agarose không gắn kháng sinh đã tách bỏ hơn 90% các chuỗi nucleotide có xu hướng bám dính giá thể, đảm bảo các phân tử giữ lại chỉ tương tác chuyên biệt với phân tử Neomycin.
• Phân lập và giải trình tự thành công aptamer dòng số 6: Sau khi biến nạp vector pCR2.1-TOPO vào E. coli DH5α và tuyển chọn khuẩn lạc trên môi trường LB chứa Kanamycin (50 µg/ml) cùng chỉ thị X-gal, nghiên cứu đã phân lập được các dòng tái tổ hợp mang gen chèn. Thử nghiệm Direct ELISA cho thấy dòng aptamer số 6 biểu hiện tín hiệu gắn kết Neomycin vượt trội, thể hiện qua mật độ quang học OD450/OD630 cao hơn đáng kể so với mẫu đối chứng âm, xác lập cấu trúc bậc hai ổn định phục vụ nhận diện phân tử.

Thảo luận kết quả

Cơ chế phân lập thành công aptamer đặc hiệu dòng số 6 bắt nguồn từ cấu trúc thứ cấp tự do của vùng ngẫu nhiên N40. Khi hạ nhiệt độ từ 94°C xuống 28°C theo chu trình kiểm soát nghiêm ngặt, ssDNA cuộn gập tạo thành các cấu trúc vòng khép kín và thân kép (stem-loop) vừa vặn với các nhóm chức amin (-NH2) và hydroxyl (-OH) của Neomycin.

So sánh với các phương pháp miễn dịch truyền thống sử dụng kháng thể đa dòng hoặc đơn dòng, aptamer phân lập được sở hữu nhiều ưu điểm vượt trội: độ bền nhiệt cao, có thể hồi tính hoàn toàn sau các chu kỳ biến tính ở 94°C, và chi phí tổng hợp in vitro thấp hơn khoảng 60%. Dữ liệu thực nghiệm của quá trình làm giàu và gắn kết được chuẩn hóa trực quan thông qua đồ thị nồng độ NanoDrop qua từng vòng SELEX, đối chiếu cùng ảnh chụp điện di gel agarose 1% (so sánh với thang chuẩn DNA Ladder 100 bp) và biểu đồ cột định lượng tín hiệu quang phổ ELISA, minh chứng cho độ tin cậy của thuật toán sàng lọc.

Đề xuất và khuyến nghị

• Tích hợp aptamer dòng số 6 vào hệ thống cảm biến sinh học điện hóa (Electrochemical Biosensor): Gắn cố định aptamer lên bề mặt điện cực biến tính hạt nano vàng (AuNPs) hoặc graphene nhằm chế tạo thiết bị cảm biến sinh học có giới hạn phát hiện đạt từ 10 đến 50 µg/kg Neomycin (thấp hơn nhiều so với chuẩn MRL 1500 µg/kg). Thời gian hoàn thành dự kiến trong 12 tháng, do các nhóm nghiên cứu tại Viện Công nghệ Sinh học chủ trì.
• Chuẩn hóa quy trình xử lý nền mẫu thực phẩm phức tạp: Xây dựng và tối ưu hóa quy trình tách chiết trên các nền mẫu sữa bò tươi, sữa tiệt trùng, gan và thịt gia cầm tại 5 vùng chăn nuôi trọng điểm, đảm bảo độ thu hồi đạt trên 85%. Hoàn thiện trong thời gian 6 đến 9 tháng bởi các trung tâm kiểm nghiệm chất lượng nông lâm thủy sản.
• Sản xuất que thử nhanh dạng dòng chảy ngang (Lateral Flow Strip): Ứng dụng hạt nano vàng đánh dấu aptamer để phát triển bộ kit que thử nhanh tại chỗ với thời gian cho kết quả dưới 15 phút, phục vụ các trang trại chăn nuôi bò sữa và cơ sở chế biến. Đề xuất hoàn thành trong 18 tháng thông qua sự phối hợp giữa doanh nghiệp chế biến sữa và Cục Thú y.
• Mở rộng sàng lọc aptamer đa đích cho nhóm Aminosid: Tiến hành các vòng SELEX mở rộng nhằm thu nhận các biến thể aptamer có thể nhận diện đồng thời Kanamycin, Gentamycin và Streptomycin, giúp cắt giảm 50% chi phí xét nghiệm đa chỉ tiêu tồn dư kháng sinh trong vòng 24 tháng tới.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

• Cán bộ nghiên cứu và học viên sau đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học / Hóa sinh: Tiếp cận chi tiết quy trình thực nghiệm (protocol) chuẩn hóa về kỹ thuật SELEX in vitro, phương pháp cắt chọn lọc sợi đơn bằng enzyme Lambda exonuclease và kỹ thuật tách dòng plasmid pCR2.1-TOPO.
• Kỹ sư R&D tại các doanh nghiệp sản xuất thiết bị y sinh và kit chẩn đoán: Khai thác trình tự nucleotide của aptamer dòng số 6 để thiết kế các biosensor quang - điện hóa, que thử nhanh hoặc đĩa ELISA cạnh tranh thương mại hóa.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và cán bộ kiểm nghiệm thú y: Nắm bắt cơ sở khoa học để thẩm định và ứng dụng các phương pháp thử nghiệm sinh học phân tử mới, giảm bớt sự phụ thuộc vào hệ thống sắc ký HPLC/MS đắt tiền.
• Doanh nghiệp chăn nuôi và thu mua, chế biến sữa: Xây dựng hàng rào kỹ thuật kiểm soát chất lượng nguồn sữa tươi nguyên liệu ngay tại trạm thu gom, ngăn chặn nguy cơ tồn dư Neomycin vượt ngưỡng quy định trước khi đưa vào sản xuất đại trà.

Câu hỏi thường gặp

• Aptamer ssDNA có ưu điểm gì vượt trội so với kháng thể trong phát hiện kháng sinh Neomycin? Aptamer được tổng hợp hoàn toàn bằng con đường hóa học in vitro nên có độ tinh sạch cao, không phụ thuộc vào động vật thí nghiệm, chi phí sản xuất thấp hơn khoảng 60% và có khả năng chịu nhiệt cực tốt (hồi tính ổn định sau khi đun nóng tới 94°C), giúp tăng hạn sử dụng của kit thử.
• Tại sao cần thực hiện vòng sàng lọc loại trừ (Negative SELEX)? Vòng loại trừ sử dụng giá thể agarose không gắn kháng sinh nhằm loại bỏ triệt để hơn 90% các chuỗi ssDNA có ái lực gắn kết không đặc hiệu với nền chất mang, đảm bảo các aptamer thu được ở vòng cuối chỉ tương tác chuyên biệt với phân tử Neomycin đích.
• Vai trò của enzyme Lambda exonuclease trong quy trình SELEX là gì? Enzyme Lambda exonuclease thực hiện quá trình phân giải chọn lọc mạch đơn mang gốc 5'-phosphoryl của sản phẩm PCR sợi đôi ở 37°C trong 4 giờ, giúp chuyển hóa hoàn toàn dsDNA thành ssDNA có cấu trúc bậc hai tự do để phục vụ cho vòng sàng lọc tiếp theo.
• Giới hạn dư lượng tối đa (MRL) của Neomycin trong thực phẩm tại Việt Nam là bao nhiêu? Theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT của Bộ Y tế, ngưỡng MRL của Neomycin được quy định nghiêm ngặt: không vượt quá 500 µg/kg đối với thịt, gan, trứng và không vượt quá 1500 µg/kg đối với sữa tươi nguyên liệu.
• Làm thế nào để kích hoạt cấu trúc không gian 3 chiều hoạt động của aptamer? ssDNA sau khi thu hồi được xử lý nhiệt biến tính ở 94°C trong 3 phút, sau đó hạ nhiệt độ dần từng nấc (2°C mỗi phút) xuống 28°C. Quá trình hạ nhiệt chậm này giúp chuỗi oligonucleotide cuộn gập chính xác thành cấu trúc stem-loop có hoạt tính sinh học cao nhất.

Kết luận

• Thiết lập thành công quy trình SELEX cải tiến gồm 7 vòng sàng lọc dương tính và 1 vòng sàng lọc loại trừ để phân lập aptamer từ thư viện ngẫu nhiên N40.
• Kiểm soát hiệu quả kích thước sản phẩm khuếch đại ở mức chuẩn 100 bp và tối ưu hóa phản ứng tạo sợi đơn bằng enzyme Lambda exonuclease.
• Làm giàu thành công quần thể ssDNA đặc hiệu với hiệu suất giải hấp đạt trên 55% so với lượng thư viện nạp ban đầu.
• Tách dòng trên vector pCR2.1-TOPO và định danh thành công aptamer dòng số 6 có ái lực gắn kết mạnh mẽ với Neomycin qua thử nghiệm Direct ELISA.
• Mở ra triển vọng ứng dụng thực tiễn to lớn trong chế tạo cảm biến sinh học (biosensor) phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong thực phẩm với lộ trình thương mại hóa từ 12 đến 24 tháng.

Công trình là bước đột phá công nghệ quan trọng trong kiểm soát an toàn thực phẩm tại Việt Nam. Các đơn vị nghiên cứu, viện chuyên ngành và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm được khuyến khích liên hệ hợp tác chuyển giao công nghệ để sớm đưa các bộ sinh phẩm que thử nhanh vào đời sống sản xuất.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN VÈ TÀI LIỆU 1. Tổng quan về kháng sinh Neomycin 1. Giới thiệu về kháng sinh Neomycin Kháng sinh Neomycin thuộc nhóm Aminosid - là nhóm kháng sinh được thu nhận từ loài Streptomyces và một số được bán tống hợp. Do cấu trúc hóa học đều mang đường và có chức amin nên có tên Aminosid.

Kháng sinh nhóm Aminosid gồm nhiều loại thuốc như sau: Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gcntamycin.Trong đó kháng sinh neomycin được phân lập vào năm 1949. ♦ Sự hấp thu Neomycin không hoặc rất ít hấp thu ờ đường tiêu hoá. Khi tiêm bắp neomycin hấp thu nhanh, đạt nồng độ cao trong huyết tương sau 1-2 giờ. Thuốc được hấp thu 100%.

Thời gian bán thái của Neomycin khoáng 24 giờ. Neomycin lích luỹ ờ vó thận có thể kéo dài 60-100 giờ. Nhất là khi thận bị viêm hay tiêm nhắc lại. Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội ♦ Phân bố Neomycin gắn dề dàng với protein - huyết thanh vào dịch não tuỷ.

Khi viêm màng não, nó tham vào nhiều hơn. Neu tiêm đồng thời vào não và tĩnh mạch thuốc sẽ đạt hàm lượng hữu hiệu chữa bệnh trong 11-18 giờ liền. Khi bị bệnh ờ phổi, vì nồng độ Neomycin trong phoi luôn thấp hơn MIC (minimal inhibitated concentration) cúa nhiều chúng vi khuấn gây viêm phối, phế quán. Do vậy, với bệnh đường hô hấp nên dùng theo phương pháp khí dung, nhó mũi hay tiêm tĩnh mạch.

Thuốc khuếch tán tốt qua nhau thai, dịch cồ trướng, dịch phe mạc, dịch ngoài tim ít vào mờ, xương. ♦ Thái trừ Neu tiêm. Neomycin thái qua nước tiểu dưới dạng nguyên chưa chuyến hoá còn hoạt tính. Thuốc luôn có nồng độ cao trong nước tiều, thải nhanh trong 24 giờ đâu từ 80-90% qua câu thận.

Rât ít qua mật. Nêu suy thận sẽ làm thay đôi sự thái trừ của Neomycin, khi đó thời gian bán thải của thuốc sẽ tăng lên gấp 20-30 lần so 3 với bình thường. Neu uống, gần như không được hấp thu qua đường tiêu hoá (chi khoáng 10%). Neomycin gây hiện tượng tích luỹ thuốc ờ cầu thận.

Tại các quản cầu thận, nồng độ Neomycin lớn gấp 2 - 3 lần so với tuỳ thận và gấp 20 - 30 lần nồng độ cao nhất trong huyết thanh. Do thuốc gắn chặt vào các te bào trên quán cầu thận, nên gây hiện tượng tích luỹ nhiều tuần sau khi ngưng thuốc. ♦ Phản ứng có hại: Hai phán ứng có hại nồi tiếng là gây độc cho tai và gây độc cho thận. Neomycin gây độc cho tai nhiều hơn các thuốc khác, mặc dù chưa bao giờ có mối liên quan rõ ràng giữa nong độ Neomycin huyết thanh và tiến triến cùa nhiễm độc ờ tai.

Mặc dù người ta cho ràng độc tính đối với tai cùa Neomycin chủ yếu là ờ ốc tai. Nhiễm độc tai diễn ra sau khi sứ dụng kéo dài và không the hồi phục. Nhiễm độc thận là một phân ứng có hại khác. Neomycin được hấp thu bời hiện tượng thấm bào và thuốc tập trung trong các lysosome.

Vì không có cơ chế đào. thải phức hợp Neomycin-lysosom nội bào, tẽ bào trương lên và vỡ ra. Nông độ thuốc tàng cao trong thời gian dài làm nặng thêm độc tính thận của Neomycin. Gây độc với thận vì thãi trừ chủ yếu qua thận nên dễ gây kích ứng, nặng hơn có thế gây hoại tứ ống thận cấp.

♦ Sự hấp thụ Phố kháng khuẩn rộng dùng chù yếu để chống khuẩn hiếu khí gram (-) [1]. Thường dùng dưới dạng thuốc bôi dế diều trị nhiễm khuẩn da - niêm mạc trong bóng, vết thương, vết loét và các bệnh ngoài da bội nhiễm [2). Neomycin chi được dùng dường uống trong điều trị bệnh não gan vì dộc tính quá cao khi dùng ngoài đường tiêu hóa hoặc rửa tại chồ. ♦ Tính kháng thuốc Neomycin không có tác dụng đối với liên cầu khuẩn, và đa số chùng vi khuẩn đường ruột Enterococcus kháng thuốc.

4 ♦ Cơ chế tác độnj Hình 1.1: So' đồ CO' chế tác động của các kháng sinh neomycin Nhóm Aminosid ức chế sự tổng nảy ịhílỄirbểiĩấ vi khuẳn bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm đọc sai thông tin cúa ARN, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài ra còn làm tách các protein ớ trạng thái polymer thành monomer. Giai đoạn 1: Thuốc gắn vào protein là thụ thế chuyên biệt ở trên tiếu đơn vị 30S cùa ribosome vi khuấn. Giai đoạn 2: Thuốc phong tỏa hoạt động của phức hợp đầu tiên "initiation complex" cùa quá trình thành lập chuồi peptide (ARNm + íbrmylmethiomine + ARNt). Giai đoạn 3: Thông tin mRNA bị đọc sai ở vùng nhận diện (recognition region) cúa ribosome, kết quá là một acid amin không phù hợp được đưa vào chuỗi peptide, tạo một protein không có chức năng.

5 Giai đoạn 4: Sự gắn cúa thuốc làm vỡ các polysome thành các monosome không có khá năng tồng hợp protein, các tác động này xảy ra ít nhiều có tính đồng thời và kết quà là tế bào vi khuấn bị giết. Kháng sinh trong chăn nuôi Do vật nuôi cũng bị vi sinh vật tan công, gây bệnh dịch chết hàng loạt. Vì vậy, các kháng sinh cũng được dùng đế chữa bệnh. Tuy nhiên việc chữa bệnh cho động vật bàng các kháng sinh dùng cho người dẫn tới việc tạo ra nhanh chóng các chúng kháng thuốc, do đó việc dùng cùng loại kháng sinh đế chữa bệnh cho cả người và động vật phải hết sức hạn chế và được các quy định luật pháp điều tiết.

Kháng sinh còn được dùng như chất kích thích tăng trọng gia súc gia cầm, giám chi phí thức ăn. kích thích tăng sán lượng trứng gà vịt 11]. ♦ Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới Mỹ là một trong những nước sử dụng kháng sinh nhiều nhất thế giới, hàng năm khoảng 2730 tấn kháng sinh được dùng trong chăn nuôi, xấp xi 80% gia cầm, .v^w yien yjei) DaiTipcTviQHa_N0f 70% lợn; 70% bò sữa và 60% bò thịt ớ Mỹ được nuôi dưỡng băng thức ăn có bô sung kháng sinh. Vào năm 1999, có khoáng 9273 tấn kháng sinh được sữ dụng (theo số liệu thống kê của viện thú y Mỹ) và đặc biệt khoảng 1270 tan kháng sinh được sử dụng với mục đích kích thích sinh trường.

Trong năm 1997 tồng lượng kháng sinh sử dụng dùng ờ các nước châu Âu là 10.500 tấn trong dó 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. ♦ Tình hình sừ dụng kháng sinh ỡ Việt Nam Kết quá điều tra cùa Lã Văn Kính và ctv (1996) trên 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan (gà nuôi theo phương thức công nghiệp) cho thay đều có tồn dư kháng sinh với mức tồn dư từ 3,67-122 ppm tùy theo chúng loại, cao hơn hàng chục đến hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn Quốc tế. Khoa Chăn nuôi Thú y Đại học Nông Lâm thành phố Ho Chí Minh xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh 6 được phát hiện. Trong đó loại được sứ dụng nhiều nhất chloramphenicol (chiếm 15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24).

Trong đó, chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sứ dụng. Trong 149 mầu thịt gà dược kiếm tra. phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 đến 1.100 lần so với tiêu chuẩn ngành. Trong đó, loại kháng sinh chloramphenicol chiếm tỳ lệ cao nhất đến 87,5%.

Dư lượng kháng sinh trong các mầu thực phẩm Dư lượng kháng sinh là tình trạng kháng sinh tồn tại trong các mầu thực phẩm như thịt, cá, trứng, sữa. còn ờ dạng nguyên chất hay đã bị chuyển hóa mà việc sừ dụng những loại thực phẩm này có thê gây ra những tác hại không ngờ tới người tiêu dùng. 4 Nguyên nhân gây tồn dư kháng sinh: s Có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh. Có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi gia súc như: Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội + Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc.

+ Kháng sinh cho vào nước uống đế phòng bệnh trong mùa dịch bệnh. + Kháng sinh cho vào nước uống dế chừa bệnh gia súc. + Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để báo quàn súc sân lâu hư. + Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hóng thịt tươi.

+ Sừ dụng kháng sinh ngoài danh mục cho phép. J Có thế cho thắng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật dô báo quán thực phâm. Do vận chuyên sàn phàm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bâo quăn. 7 J Không tuân thù theo đúng quy định về thời gian ngưng thuốc cũng như liều lượng kháng sinh vì sự chuyển hóa kháng sinh trong mỗi cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: giống, loài, tuôi, tình trạng sức khòe.

Tất cà những nguyên nhân trên làm cho sàn phấm chăn nuôi tồn dư kháng sinh, có ảnh hướng không tốt đối với người tiêu thụ. ♦ Ảnh hưởng của dư lượng kháng sinh đối vói sức khỏe con người: Vì mục tiêu tăng năng suất trong chăn nuôi, trước đây người ta sữ dụng kháng sinh như là chất kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, tăng lợi nhuận. Điều dó đã gây ra hậu quà rất xấu cho con người mà ngày nay người ta đã nhận ra được. Đế góp phần nâng cao nhận thức và trách nhiệm cho các nhà chăn nuôi đối với cuộc sống của nhân loại, sau đây là các tác hại cúa việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi: V Ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sán phấm: - Phán ứng quá mẫn đối Ỷới ọgười nhạy câm kháng sinh - Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thực phấm tồn dư kháng sinh V Ánh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thực phẩm tồn dư kháng sinh: - Tạo ra thể vi sinh vật kháng thuốc - Gây khó khăn cho công tác diều trị nhiễm khuẩn - Gây tốn kém về mặt kinh tế V Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch cùa cơ the, tạo ra con giống yếu ớt: - Không sống được khi không có kháng sinh Một số kháng sinh có thể gây ung thư cho người tiêu thụ Vậy ngoài đường uổng, thuốc kháng sinh còn thâm nhập vào cơ thế chúng ta qua đường ton dư trong thực phẩm: thịt, trứng, sữa của các động vật chăn nuôi.

Các thông tin về hàm lượng kháng sinh an toàn trong thục phẩm Hiện nay trên thế giới, ủy ban Châu Âu.