Nghiên cứu sản xuất biosurfactant từ vi khuẩn Pseudomonas sử dụng dầu thô làm nguồn carbon

Nghiên cứu sản xuất biosurfactant từ chủng Pseudomonas sử dụng dầu thô làm nguồn carbon chính, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp.

• Tác giả: Le Viet Hung
• Người hướng dẫn: Dr. Kieu Thi Quynh Hoa
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Biotechnology
• Đề tài: Nghiên Cứu Sản Xuất Biosurfactant Từ Vi Khuẩn Pseudomonas Sử Dụng Dầu Thô Làm Nguồn Carbon
• Loại tài liệu: Graduation Thesis
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• COMMITMENT
• ACKNOWLEDGMENTS
• INDEX
• 1. PART III: MATERIALS AND METHODS
• 1.1. Machines and equipments
• 1.2. Isolation of bacteria using petroleum hydrocarbon as sole carbon source
• 1.3. Selection of a bacterial strain capable of biosurfactant production with high emulsification activity on petroleum hydrocarbon substrate (crude oil)
• 1.4. Identification of the selected bacterial strain
• 1.5. Effect of environmental and culture conditions on biosurfactant production of the selected bacterial strain
• 1.6. Determination of total oil content by gravimetric method
• 2. PART IV: RESULTS
• 2.1. Screening of petroleum hydrocarbon (crude oil) utilizing and bio-surfactant producing bacterial strains
• 2.2. Identification of the selected petroleum hydrocarbon utilizing and biosurfactant producing bacterial strain
• 2.3. Morphological characteristics of the DSVK2 strain
• 2.4. Classification of the DSVK2 strain by 16S rRNA gene sequence analysis
• 2.5. The biosurfactants producing ability on crude oil of the selected bacterial strain
• 2.6. Effect of environmental and culture conditions on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.7. Effect of crude oil concentration on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.8. Effect of nitrogen sources on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.9. Effect of different concentrations of NH4NO3 on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.10. Effect of pH value on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.11. Effect of temperature on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.12. Effect of concentrations of NaCl on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.13. Effect of bacterial concentrations on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain
• 2.14. Biodegradation of crude oil of Pseudomonas sp.
• 3. PART VI: CONCLUSIONS
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ABSTRACT
• Preface

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Sản Xuất Biosurfactant Từ Pseudomonas

Nghiên cứu về biosurfactant đang ngày càng được quan tâm do ưu điểm vượt trội so với chất hoạt động bề mặt hóa học. Biosurfactant có độc tính thấp, thân thiện với môi trường và hiệu quả ở điều kiện khắc nghiệt. Nghiên cứu này tập trung vào khả năng sản xuất biosurfactant của vi khuẩn Pseudomonas, sử dụng dầu thô làm nguồn carbon duy nhất. Mục tiêu là tìm kiếm chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy dầu thô và sản xuất biosurfactant hiệu quả, ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu mỏ. Theo nghiên cứu của Le Viet Hung (2022), Pseudomonas sp. có tiềm năng lớn trong việc cải tạo môi trường ô nhiễm dầu thô. Biosurfactant giúp giảm sức căng bề mặt, nhũ hóa dầu, tạo điều kiện cho vi khuẩn tiếp xúc và phân hủy dầu thô dễ dàng hơn. Đây là hướng đi đầy hứa hẹn trong công nghệ sinh học môi trường, hướng tới sự phát triển bền vững và kinh tế tuần hoàn.

1.1. Giới thiệu chung về biosurfactant và ứng dụng

Biosurfactant là các chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất bởi vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Chúng có cấu trúc phân tử đặc biệt, vừa ưa nước vừa kỵ nước, giúp giảm sức căng bề mặt giữa các pha lỏng, khí hoặc rắn. Ứng dụng biosurfactant rất đa dạng, từ xử lý ô nhiễm môi trường, tăng cường thu hồi dầu mỏ, đến sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm. Biosurfactant có khả năng phân hủy sinh học cao, ít độc hại và có thể được sản xuất từ các nguồn carbon tái tạo, như phụ phẩm nông nghiệp và phụ phẩm công nghiệp.

1.2. Vai trò của vi khuẩn Pseudomonas trong sản xuất biosurfactant

Vi khuẩn Pseudomonas là một trong những chi vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng sản xuất biosurfactant. Nhiều chủng Pseudomonas sp. có khả năng sử dụng dầu thô và các hydrocacbon khác làm nguồn carbon để sinh trưởng và sản xuất biosurfactant. Biosurfactant do Pseudomonas sản xuất thường là các glycolipid hoặc lipopeptide, có hoạt tính bề mặt cao và khả năng nhũ hóa tốt. Nghiên cứu của Lai Thuy Hien và Vuong Thi Nga (2013) đã chứng minh khả năng của Pseudomonas trong việc phân hủy hydrocacbon dầu mỏ.

II. Thách Thức Ô Nhiễm Dầu Thô và Giải Pháp Biosurfactant

Ô nhiễm dầu thô là một vấn đề môi trường nghiêm trọng, gây ảnh hưởng lớn đến hệ sinh thái và sức khỏe con người. Các sự cố tràn dầu có thể gây ra thiệt hại kinh tế lớn, ảnh hưởng đến ngành du lịch, đánh bắt cá và các hoạt động kinh tế khác. Các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu truyền thống, như sử dụng hóa chất phân tán, có thể gây ra tác động tiêu cực đến môi trường. Biosurfactant nổi lên như một giải pháp thay thế tiềm năng, thân thiện với môi trường và hiệu quả trong việc xử lý ô nhiễm dầu. Ứng dụng biosurfactant giúp tăng cường khả năng phân hủy sinh học của dầu thô, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường.

2.1. Tác động của ô nhiễm dầu thô đến môi trường và con người

Ô nhiễm dầu thô gây ra nhiều tác động tiêu cực đến môi trường, bao gồm ô nhiễm nước, ô nhiễm đất và ô nhiễm không khí. Dầu thô có thể gây độc cho các sinh vật biển, ảnh hưởng đến chuỗi thức ăn và gây suy giảm đa dạng sinh học. Con người có thể bị phơi nhiễm với dầu thô thông qua tiếp xúc trực tiếp, ăn hải sản bị ô nhiễm hoặc hít phải hơi dầu. Phơi nhiễm với dầu thô có thể gây ra các vấn đề sức khỏe, như kích ứng da, các bệnh về hô hấp và ung thư. Theo Barron et al. (2020), ô nhiễm dầu làm giảm khả năng phục hồi của các hệ sinh thái.

2.2. Ưu điểm của biosurfactant so với các phương pháp xử lý truyền thống

Biosurfactant có nhiều ưu điểm so với các phương pháp xử lý ô nhiễm dầu truyền thống. Chúng có khả năng phân hủy sinh học cao, ít độc hại và có thể được sản xuất từ các nguồn carbon tái tạo. Biosurfactant có thể hoạt động hiệu quả trong điều kiện khắc nghiệt, như nhiệt độ cao, độ pH cao và độ mặn cao. Chúng cũng có khả năng nhũ hóa dầu tốt hơn so với các chất hoạt động bề mặt hóa học, giúp tăng cường khả năng phân hủy sinh học của dầu thô. So với phương pháp vật lý, biosurfactant có chi phí thấp hơn và không gây ô nhiễm thứ cấp.

III. Nghiên Cứu Chủng Pseudomonas Sản Xuất Biosurfactant Hiệu Quả

Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập và xác định các chủng Pseudomonas có khả năng sản xuất biosurfactant hiệu quả từ dầu thô. Các chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu, sau đó được sàng lọc dựa trên khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn carbon và sản xuất biosurfactant. Chủng Pseudomonas có khả năng sản xuất biosurfactant cao nhất được xác định bằng phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA. Các điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất biosurfactant cũng được nghiên cứu, bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ dầu thô và nguồn nitơ.

3.1. Phân lập và sàng lọc chủng Pseudomonas sản xuất biosurfactant

Quá trình phân lập và sàng lọc chủng Pseudomonas được thực hiện theo các bước sau: (1) Thu thập mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu. (2) Cấy mẫu vào môi trường chọn lọc chứa dầu thô làm nguồn carbon duy nhất. (3) Phân lập các khuẩn lạc phát triển trên môi trường chọn lọc. (4) Sàng lọc các chủng phân lập dựa trên khả năng tạo vòng halo trên đĩa thạch chứa dầu thô hoặc khả năng nhũ hóa dầu. (5) Lựa chọn các chủng có khả năng sản xuất biosurfactant cao nhất để nghiên cứu tiếp.

3.2. Xác định chủng Pseudomonas bằng phương pháp phân tích 16S rRNA

Để xác định chủng Pseudomonas có khả năng sản xuất biosurfactant cao nhất, phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA được sử dụng. DNA của chủng vi khuẩn được chiết xuất, sau đó vùng gen 16S rRNA được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Trình tự nucleotide của vùng gen 16S rRNA được xác định và so sánh với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu gen. Kết quả so sánh cho phép xác định chủng vi khuẩn đến mức loài. Nghiên cứu của Le Viet Hung (2022) đã xác định chủng DSVK2 tương đồng 99.5% với Pseudomonas stutzeri.

IV. Tối Ưu Hóa Quá Trình Sản Xuất Biosurfactant Từ Pseudomonas

Để nâng cao hiệu suất sản xuất biosurfactant, các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men được nghiên cứu và tối ưu hóa. Các yếu tố này bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ dầu thô, nguồn nitơ và nồng độ muối. Ảnh hưởng của từng yếu tố được đánh giá bằng phương pháp thí nghiệm có kiểm soát. Kết quả nghiên cứu cho phép xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất biosurfactant từ chủng Pseudomonas đã chọn. Việc tối ưu hóa quá trình lên men giúp giảm chi phí sản xuất và tăng tính khả thi của việc ứng dụng biosurfactant trong thực tế.

4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hiệu suất sản xuất biosurfactant

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hiệu suất sản xuất biosurfactant bằng cách nuôi cấy chủng Pseudomonas ở các nhiệt độ và pH khác nhau. Kết quả cho thấy nhiệt độ và pH tối ưu cho quá trình sản xuất biosurfactant là 30°C và pH 8.0, tương ứng. Ở điều kiện tối ưu, hiệu suất sản xuất biosurfactant đạt cao nhất.

4.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon và nguồn nitơ đến sản xuất biosurfactant

Nguồn carbon và nguồn nitơ là hai thành phần dinh dưỡng quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của các nguồn carbon và nguồn nitơ khác nhau đến hiệu suất sản xuất biosurfactant. Kết quả cho thấy dầu thô là nguồn carbon thích hợp cho chủng Pseudomonas đã chọn. NH4NO3 là nguồn nitơ tốt nhất, với nồng độ tối ưu là 0.4% (w/v). Việc lựa chọn nguồn carbon và nguồn nitơ phù hợp giúp tăng hiệu suất sản xuất biosurfactant.

V. Đánh Giá Khả Năng Phân Hủy Dầu Thô Của Pseudomonas sp

Nghiên cứu đánh giá khả năng phân hủy dầu thô của chủng Pseudomonas sp. đã chọn bằng cách theo dõi sự giảm nồng độ dầu thô trong môi trường nuôi cấy theo thời gian. Nồng độ dầu thô được xác định bằng phương pháp trọng lượng. Kết quả cho thấy chủng Pseudomonas sp. có khả năng phân hủy dầu thô hiệu quả, với nồng độ dầu thô giảm đáng kể sau 20 ngày nuôi cấy. Khả năng phân hủy dầu thô của chủng Pseudomonas sp. cho thấy tiềm năng ứng dụng trong cải tạo môi trường ô nhiễm dầu.

5.1. Phương pháp xác định nồng độ dầu thô bằng phương pháp trọng lượng

Phương pháp trọng lượng được sử dụng để xác định nồng độ dầu thô trong môi trường nuôi cấy. Mẫu môi trường nuôi cấy được chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó dung môi được loại bỏ bằng cách bốc hơi. Phần còn lại là dầu thô, được cân để xác định khối lượng. Nồng độ dầu thô được tính bằng cách chia khối lượng dầu thô cho thể tích mẫu. Phương pháp trọng lượng là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để xác định nồng độ dầu thô.

5.2. Kết quả phân hủy dầu thô của Pseudomonas sp. sau 20 ngày

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng Pseudomonas sp. có khả năng phân hủy dầu thô hiệu quả. Sau 20 ngày nuôi cấy, nồng độ dầu thô giảm từ 28,950 mg/l xuống còn 10,712 mg/l. Hiệu suất phân hủy dầu thô đạt khoảng 63%. Kết quả này cho thấy chủng Pseudomonas sp. có tiềm năng lớn trong việc xử lý dầu thô.

VI. Kết Luận và Triển Vọng Ứng Dụng Biosurfactant Từ Pseudomonas

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phân lập và xác định chủng Pseudomonas sp. có khả năng sản xuất biosurfactant hiệu quả từ dầu thô. Các điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất biosurfactant đã được xác định. Chủng Pseudomonas sp. cũng cho thấy khả năng phân hủy dầu thô hiệu quả. Kết quả nghiên cứu này mở ra triển vọng ứng dụng biosurfactant trong cải tạo môi trường ô nhiễm dầu, góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững. Cần có thêm nghiên cứu để đánh giá tính chất sinh học và tính chất kháng khuẩn của biosurfactant.

6.1. Tóm tắt kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng của vi khuẩn Pseudomonas trong việc sản xuất biosurfactant từ dầu thô. Việc tối ưu hóa các điều kiện sản xuất đã giúp nâng cao hiệu suất và giảm chi phí. Kết quả này có ý nghĩa khoa học quan trọng, cung cấp cơ sở cho việc phát triển các công nghệ xử lý ô nhiễm dầu hiệu quả và thân thiện với môi trường.

6.2. Triển vọng ứng dụng biosurfactant trong công nghiệp và môi trường

Biosurfactant có nhiều triển vọng ứng dụng trong công nghiệp và môi trường. Trong công nghiệp, chúng có thể được sử dụng để tăng cường thu hồi dầu mỏ, sản xuất mỹ phẩm và dược phẩm. Trong môi trường, chúng có thể được sử dụng để xử lý ô nhiễm dầu, cải tạo đất và cải tạo môi trường. Việc phát triển các công nghệ sản xuất biosurfactant hiệu quả và bền vững sẽ mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Ô nhiễm hydrocacbon dầu mỏ (Petroleum Hydrocarbon Contamination - PHC) từ các hoạt động thăm dò, khai thác, vận chuyển và chế biến dầu khí đang là vấn đề môi trường nghiêm trọng trên toàn cầu và tại Việt Nam. Khi xảy ra sự cố tràn dầu, lớp màng dầu ngăn cản quá trình trao đổi oxy giữa khí quyển và môi trường nước, làm suy giảm khả năng quang hợp của thực vật phù du, phá hủy các hệ sinh thái nhạy cảm như rừng ngập mặn, rạn san hô và đầm phá, đồng thời gây độc hại trực tiếp đến đời sống thủy sinh vật và sức khỏe con người.

Các biện pháp xử lý truyền thống hiện nay gồm phương pháp vật lý - cơ học (phao quây, máy hút dầu, vật liệu hấp phụ) và phương pháp hóa học (sử dụng chất phân tán, chất nhũ hóa). Tuy nhiên, phương pháp vật lý chỉ thu hồi được lượng dầu nổi trên bề mặt với chi phí vận hành cao, còn phương pháp hóa học tiềm ẩn nguy cơ để lại dư lượng độc hại, gây ô nhiễm thứ cấp cho hệ sinh thái biển. Trước thực trạng đó, giải pháp xử lý sinh học (bioremediation) thông qua vi sinh vật có khả năng phân hủy dầu và tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) được đánh giá là hướng đi thân thiện với môi trường, chi phí thấp và chuyển hóa triệt để hydrocacbon thành sản phẩm cuối cùng là $\text{CO}_2$ và $\text{H}_2\text{O}$.

Chất hoạt động bề mặt sinh học là các phân tử lưỡng ái chứa cả nhóm ưa nước (hydrophilic) và nhóm kỵ nước (lipophilic), có khả năng làm giảm sức căng bề mặt giữa pha dầu và pha nước, giúp phân tán hydrocacbon không tan thành các hạt nhũ tương nhỏ. Nhờ đó, vi khuẩn dễ dàng tiếp xúc và tiết enzym nội bào để oxy hóa, chuyển hóa dầu thô. Tại Việt Nam, các nghiên cứu chuyên sâu và có hệ thống về quá trình sinh tổng hợp biosurfactant từ vi khuẩn bản địa sử dụng dầu thô làm nguồn cacbon duy nhất vẫn còn hạn chế.

Khóa luận tốt nghiệp "Study on production of biosurfactant by strain Pseudomonas using crude oil as sole carbon source" được thực hiện bởi sinh viên Lê Việt Hùng (Lớp K62CNSHE, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam) dưới sự hướng dẫn của TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa (Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học - VAST) và PGS.TS. Nguyễn Văn Giang (Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh - VNUA).

Mục tiêu nghiên cứu: Tìm kiếm và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp biosurfactant trên cơ chất hydrocacbon dầu mỏ phục vụ ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học trên cơ chất dầu thô với hoạt tính nhũ hóa cao.
2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy (nồng độ cơ chất dầu thô, nguồn nitơ, nồng độ nitơ, pH, nhiệt độ, nồng độ muối NaCl, mật độ vi khuẩn) đến hiệu suất sinh biosurfactant của chủng tuyển chọn.
3. Đánh giá khả năng phân hủy hydrocacbon dầu mỏ (dầu thô) của chủng vi khuẩn tuyển chọn thông qua phương pháp phân tích hàm lượng hydrocacbon tổng số (TPH).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn nước biển nhiễm dầu tại Đồ Sơn (Hải Phòng); chủng vi khuẩn tuyển chọn mang ký hiệu DSVK2 (Pseudomonas sp.); cơ chất dầu thô lấy từ tàu dịch vụ dầu khí VSP01 thuộc mỏ Rồng (Vũng Tàu, Việt Nam).
• Phạm vi thực hiện: Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Vi sinh vật Dầu mỏ và Phòng thí nghiệm Trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học (VAST); phân tích ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương; xác định hàm lượng dầu tổng số bằng phương pháp khối lượng tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. Thời gian hoàn thành: Tháng 5 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

Khóa luận xây dựng trên các cơ sở lý thuyết vi sinh vật học dầu mỏ và hóa sinh môi trường:

• Cơ chế phân hủy sinh học hydrocacbon: Vi sinh vật hiếu khí sử dụng enzym oxygenase và peroxidase tấn công oxy hóa đầu mạch n-alkane của hydrocacbon, chuyển hóa qua các con đường trao đổi chất trung gian (chu trình tricarboxylic acid - TCA) để tạo thành các tiền chất như Acetyl-CoA, succinate, pyruvate nhằm tổng hợp sinh khối và sinh năng lượng.
• Bản chất và phân loại biosurfactant: Khác với chất hoạt động bề mặt hóa học, biosurfactant được phân loại dựa trên thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật, gồm 5 nhóm chính: Glycolipid (Rhamnolipid từ Pseudomonas aeruginosa, Sophorolipid từ Torulopsis, Trehalolipid từ Rhodococcus); Lipopeptide/Lipoprotein (Surfactin, Subtilisin từ Bacillus subtilis); Phospholipid và axit béo (Thiobacillus thiooxidans); Polymeric surfactant (Emulsan, Biodispersan từ Acinetobacter calcoaceticus); Particulate surfactant.
• Đặc tính kỹ thuật của biosurfactant: Giảm sức căng bề mặt của nước cất từ 72 mN/m xuống 30–40 mN/m, giảm sức căng liên bề mặt nước/n-hexadecane từ 40 mN/m xuống 1 mN/m; duy trì độ bền hoạt tính ở nhiệt độ cao, dải pH rộng (5–12) và nồng độ muối lên đến 10% NaCl.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quá trình thực nghiệm được triển khai theo các quy trình chuẩn hóa:

• Môi trường nuôi cấy: Môi trường khoáng muối (Mineral Salt Medium - MSM: $\text{MgSO}_4\ 0.2\text{ g/L}$, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{NaCl}$...); Môi trường vi khuẩn hiếu khí tổng số (Total Aerobic Bacteria Medium - TABM: $\text{NH}_4\text{NO}_3\ 2.0\text{ g/L}$, agar $18.0\text{ g/L}$, pH 7.0).
• Phân lập và làm sạch chủng: Mẫu nước nhiễm dầu được nuôi cấy làm giàu trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường MSM bổ sung 2% (w/v) dầu thô làm nguồn cacbon duy nhất, lắc 180 rpm ở 30°C trong 10 ngày. Sau 3 chu kỳ cấy truyền liên tiếp, dịch nuôi cấy được cấy trải trên thạch TABM để thu nhận các khuẩn lạc đơn thuần khiết và lưu giữ trong glycerol ở -80°C.
• Đo chỉ số nhũ hóa ($E_{24}$): Đánh giá khả năng tạo biosurfactant bằng cách trộn 1 mL dịch nuôi cấy với 1 mL dung môi xylene trong ống nghiệm, lắc xoáy vortex ở tốc độ 2000 rpm trong 2 phút, để lắng ổn định ở 4°C trong 24 giờ. Chỉ số $E_{24}$ tính theo công thức Cooper (1986): $$E_{24} = \left(\frac{\text{Chiều cao cột nhũ hóa}}{\text{Tổng chiều cao chất lỏng}}\right) \times 100%$$
• Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn:
  • Hình thái học: Quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch TABM sau 48 giờ ở 30°C; quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (S-4800, Nhật Bản, hiệu điện thế 10 kV) sau khi cố định mẫu bằng glutaraldehyde 2.5%, osmium tetroxide ($\text{OsO}_4$) 1% và khử nước qua các thang cồn 50%–100%.
  • Sinh học phân tử: Tách chiết DNA tổng số bằng Genomic DNA purification kit (Thermo Scientific); khuếch đại gen 16S rDNA bằng phản ứng PCR với cặp mồi 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') và 1492R (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Chu trình nhiệt PCR: 94°C (5 phút); 30 chu kỳ [94°C (60s), 55°C (60s), 72°C (90s)]; kéo dài cuối 72°C (10 phút). Sản phẩm PCR kích thước ~1500 bp được tinh sạch và giải trình tự tự động, so sánh mức độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI).
• Khảo sát tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy: Thí nghiệm theo phương pháp đơn yếu tố trong 18 ngày trên máy lắc 180 rpm với các dải biến thiên: nồng độ dầu thô (1%–6% w/v); nguồn nitơ 0.3% w/v ($\text{KNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $\text{NH}_4\text{Cl}$, $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$); nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}3$ (0.1%–0.6% w/v); pH (4.0–10.0); nhiệt độ (4°C–55°C); nồng độ $\text{NaCl}$ (1%–6% w/v); mật độ vi khuẩn ban đầu (1%–6% v/v, $\text{OD}{600} = 1.0$).
• Xác định hàm lượng dầu tổng số bằng phương pháp khối lượng (Gravimetric method): Chiết toàn bộ lượng dầu còn lại trong hệ nhũ tương bằng dung môi dichloromethane (DCM) cho đến khi dung môi chiết không màu; lọc dịch chiết vào cốc cân đã biết trước khối lượng, làm bay hơi hoàn toàn dung môi đến khối lượng không đổi và cân xác định lượng dầu thô còn lại sau 20 ngày nuôi cấy.

---

Nội dung chính theo từng chương

PART I: Purpose and requirements (Đặt vấn đề, mục tiêu và yêu cầu)

Tác giả nêu rõ tầm quan trọng của năng lượng dầu mỏ cùng những nguy cơ ô nhiễm nghiêm trọng đối với môi trường biển toàn cầu và vùng biển Việt Nam. Phần này xác định mục tiêu trọng tâm là tìm kiếm chủng vi khuẩn có hoạt lực cao trong việc sản sinh biosurfactant trên cơ chất dầu thô và đề ra 3 yêu cầu nghiên cứu kỹ thuật gắn liền với thực nghiệm.

PART II: Literature Review (Tổng quan tài liệu)

Chương này tổng hợp các dữ liệu nghiên cứu lý thuyết và thực tiễn về ô nhiễm dầu mỏ và chất hoạt động bề mặt sinh học:

• Thống kê các vụ tràn dầu lớn: Ghi nhận số liệu các thảm họa tràn dầu trên thế giới (Amoco Cadiz 1978: 68 triệu gallon; Exxon Valdez 1987: 41 triệu $\text{m}^3$; Chiến tranh Vùng Vịnh 1991: 0.82 triệu tấn; Deepwater Horizon 2010: 200 triệu gallon; Peru 2022: 10 nghìn thùng) và các sự cố tại Việt Nam (vụ tàu chở dầu Malaysia tại Cần Giờ 1994: 1.890 tấn diesel và 100 tấn dầu mazut; tàu Neptune Aries đâm vào cảng Cát Lái 1994: 1.864 tấn; tàu Formula One đâm vào tàu Petrolimex 01 tại Vũng Tàu 2001: 1.000 tấn; sự cố dầu tràn dải bờ biển miền Trung 2006: 2.071 tấn; sự cố vỡ van dầu tại Đà Nẵng 2009: 1.500 tấn).
• Phân tích các phương pháp xử lý: So sánh ưu nhược điểm giữa phương pháp vật lý, hóa học và sinh học.
• Tổng quan về vi sinh vật sản sinh biosurfactant: Phân loại cấu trúc phân tử biosurfactant, các chủng vi sinh vật điển hình (Pseudomonas, Bacillus, Acinetobacter, Candida...) và ứng dụng đa ngành trong nông nghiệp, công nghiệp chất tẩy rửa, mỹ phẩm, y dược và thu hồi dầu tăng cường (MEOR).
• Tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế: Điểm lại các công trình của Mukred (2008), Hassanshahian (2012), Liu (2014) trên thế giới; công trình của Lê Phi Nga (2007), Lại Thúy Hiền (2013), Kiều Thị Quỳnh Hoa (2016, 2017, 2020) tại Việt Nam về các chủng phân hủy hydrocacbon và khả năng nhũ hóa $E_{24}$.

PART III: Materials and Methods (Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu)

Mô tả chi tiết nguồn gốc chủng vi khuẩn, mẫu dầu thô mỏ Rồng VSP01, danh mục hóa chất tinh khiết và hệ thống trang thiết bị thí nghiệm (máy quang phổ Sacoman, kính hiển vi Carl Zeiss, cân phân tích Sartorius, máy lắc ổn nhiệt Backman, máy PCR...). Thiết lập toàn bộ quy trình phân lập, đo chỉ số $E_{24}$, chụp ảnh SEM, khuếch đại gen 16S rDNA và quy trình chiết tách gravimetric.

PART IV: Results (Kết quả nghiên cứu và thảo luận)

1. Sàng lọc và định danh chủng vi khuẩn sinh biosurfactant

• Sàng lọc: Từ 20 chủng vi khuẩn phân lập từ nước biển nhiễm dầu Đồ Sơn có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cacbon duy nhất, chủng mang ký hiệu DSVK2 thể hiện hoạt tính nhũ hóa xylene cao nhất với chỉ số $E_{24}$ đạt 52% sau 12 ngày nuôi cấy trong môi trường MSM.
• Đặc điểm hình thái: Trên môi trường thạch TABM sau 48 giờ ở 30°C, khuẩn lạc DSVK2 có đường kính 2–3 mm, dạng phẳng, mép không đều, bề mặt khô và có màu vàng chanh nhạt. Dưới kính hiển vi điện tử quét SEM, tế bào vi khuẩn có dạng hình que (trực khuẩn), kích thước chiều dài khoảng 2 µm, thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm.
• Phân loại phân tử 16S rDNA: Phân tích trình tự đoạn gen 16S rDNA (~1500 bp) cho thấy chủng DSVK2 đạt độ tương đồng 99.5% với loài Pseudomonas stutzeri trên GenBank. Do đó, chủng được định danh và ký hiệu là Pseudomonas sp. DSVK2.

2. Động thái sinh tổng hợp biosurfactant theo thời gian

Trong điều kiện nuôi cấy cơ bản (2% w/v dầu thô, 0.15% $\text{KNO}3$, 2% w/v $\text{NaCl}$, 2% v/v vi khuẩn, pH 7.0, 30°C, 180 rpm), chủng DSVK2 bắt đầu tiết biosurfactant từ ngày nuôi cấy thứ 4 ($E{24} = 10%$). Hoạt tính nhũ hóa tăng nhanh và đạt mức ổn định từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 (49%–52%), đạt cực đại vào ngày thứ 12 với $E_{24} = 52%$, sau đó giảm nhẹ còn 40% ở ngày thứ 18.

Thời gian nuôi cấy (ngày):   Day 4   --->   Day 8 - Day 12   --->   Day 12 (Đỉnh)   --->   Day 18
Chỉ số nhũ hóa E24 (%):      10.0%           49.0% - 52.0%            52.0%                40.0%

3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất sinh biosurfactant

Các thí nghiệm khảo sát đơn yếu tố sau 12 ngày nuôi cấy thu được kết quả cụ thể:

Bảng tổng hợp kết quả khảo sát các yếu tố nuôi cấy đối với hoạt tính nhũ hóa ($E_{24}$) của chủng DSVK2:

Yếu tố khảo sát	Dải giá trị thử nghiệm	Giá trị tối ưu	Chỉ số $E_{24}$ tại điểm tối ưu	Ghi chú và diễn biến số liệu
Nồng độ dầu thô (w/v)	1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%	3% (w/v)	56.0%	Ở 2% đạt 52%, 4% đạt 53%. Nồng độ 1%, 5%, 6% cho $E_{24} < 50%$ (thấp nhất tại 6% là 42%).
Nguồn nitơ (0.3% w/v)	$\text{KNO}_3$, $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$, $\text{NH}_4\text{NO}_3$, $\text{NaNO}_3$, $\text{NH}_4\text{Cl}$, $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$	$\text{NH}_4\text{NO}_3$	60.1%	$\text{KNO}_3$ (43%), $\text{NaNO}_3$ (36%), $\text{NH}_4\text{Cl}$ (33%), $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ (30%), thấp nhất là $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$ (20%).
Nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}_3$ (w/v)	0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%	0.4% (w/v)	64.0%	Nồng độ 0.1% đạt 41%, 0.2% đạt 48%. Hoạt tính cao và ổn định nhất ở 0.4%.
Giá trị pH	4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0	pH 8.0	66.0%	Không sinh biosurfactant ở pH 4 và 5 ($E_{24} = 0%$). pH 6 đạt 25.7%, pH 10 đạt 12%. Duy trì $E_{24} > 60%$ từ pH 6 đến 9.
Nhiệt độ nuôi cấy (°C)	4, 15, 20, 25, 30, 37, 45, 50, 55°C	30°C	Cực đại	Hoàn toàn không sinh biosurfactant ở 4°C, 50°C và 55°C ($E_{24} = 0%$). Ở 15, 20 và 45°C hoạt tính đạt $\le 50%$.
Nồng độ muối $\text{NaCl}$	1% – 6% (w/v)	Khảo sát chi tiết	Ổn định	Duy trì hoạt tính tốt trong điều kiện nồng độ muối biển.
Mật độ vi khuẩn cấy giống	1% – 6% (v/v) ($\text{OD}_{600}=1$)	Khảo sát chi tiết	Tối ưu	Đảm bảo mật độ ban đầu thích hợp cho quá trình thích ứng và nhân sinh khối.

Sau khi kết hợp các điều kiện nuôi cấy tối ưu đã được lựa chọn (pH 8.0, nhiệt độ 30°C, nồng độ cơ chất dầu thô 3% w/v, nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}3$ 0.4% w/v), chỉ số nhũ hóa tổng hợp $E{24}$ của chủng Pseudomonas sp. DSVK2 đã tăng từ 52.8% lên đến 69.0%.

4. Khả năng phân hủy dầu thô của chủng Pseudomonas sp. DSVK2

Khả năng phân hủy dầu thô được định lượng qua phân tích khối lượng TPH:

• Hàm lượng dầu thô ban đầu trong môi trường nuôi cấy: 28,950 mg/L.
• Hàm lượng dầu thô còn lại sau 20 ngày thử nghiệm: 10,712 mg/L.
• Chủng vi khuẩn DSVK2 đã chuyển hóa và làm giảm 18,238 mg/L dầu thô trong môi trường thử nghiệm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính đạt được

1. Phân lập và tuyển chọn thành công từ 20 chủng vi khuẩn bản địa tại vùng biển Đồ Sơn chủng Pseudomonas sp. DSVK2 có khả năng phát triển mạnh trên cơ chất dầu thô mỏ Rồng và sinh chất hoạt động bề mặt sinh học với hoạt tính nhũ hóa cao ($E_{24} = 52%$).
2. Xác định chính xác vị trí phân loại phân tử của chủng DSVK2 là trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 2 µm, có trình tự 16S rDNA tương đồng 99.5% với Pseudomonas stutzeri.
3. Xác lập bộ thông số điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp biosurfactant của chủng DSVK2 gồm: nhiệt độ 30°C, pH 8.0, nồng độ dầu thô 3% (w/v), nguồn nitơ $\text{NH}_4\text{NO}3$ ở nồng độ 0.4% (w/v). Trong các điều kiện này, chỉ số nhũ hóa $E{24}$ tăng từ 52.8% lên 69.0%.
4. Chứng minh khả năng phân hủy sinh học trực tiếp hydrocacbon dầu thô trong môi trường lỏng, làm giảm hàm lượng dầu từ 28,950 mg/L xuống 10,712 mg/L sau 20 ngày nuôi cấy.

Đóng góp thực tiễn và giải pháp đề xuất

• Cung cấp một nguồn chủng vi sinh vật bản địa (Pseudomonas sp. DSVK2) có khả năng thích nghi cao với điều kiện sinh thái biển Việt Nam (chịu mặn, ưa kiềm nhẹ pH 8.0), có tiềm năng ứng dụng trực tiếp trong công nghệ xử lý sinh học (bioremediation) các sự cố tràn dầu ven biển và xử lý nước thải nhiễm dầu công nghiệp.
• Làm sáng tỏ ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng vô cơ và nồng độ cơ chất dầu mỏ đến hoạt tính tiết biosurfactant, cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm cho việc xây dựng môi trường lên men sản xuất chế phẩm sinh học quy mô pilot.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các thí nghiệm trong khóa luận mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (bình tam giác 250 mL); quy trình tối ưu hóa thực hiện theo phương pháp khảo sát từng biến đơn lẻ (OFAT - One Factor At a Time) chứ chưa áp dụng mô hình toán học đáp ứng bề mặt (RSM). Khóa luận chưa thực hiện tách chiết và phân tích cấu trúc hóa học chuyên sâu của phân tử biosurfactant (bằng phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, HPLC, FT-IR hay LC-MS/NMR) để xác định rõ nhóm cấu trúc rhamnolipid hay glycolipid cụ thể.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Mở rộng nghiên cứu tinh sạch và xác định cấu trúc phân tử của hợp chất biosurfactant do chủng Pseudomonas sp. DSVK2 sinh ra.
  • Thử nghiệm nuôi cấy trên hệ thống bioreactor quy mô lớn hơn để tối ưu hóa động học quá trình lên men.
  • Nghiên cứu công nghệ cố định tế bào chủng DSVK2 trên các chất mang xốp (như bọt xốp polyurethane - PUF) và đánh giá hiệu quả làm sạch dầu trong mô hình nước biển tự nhiên tại hiện trường.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh: Thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Vi sinh vật học, Công nghệ môi trường, Hóa sinh và Khoa học biển đang thực hiện các đề tài về vi sinh vật chuyển hóa hydrocacbon, chất hoạt động bề mặt sinh học hoặc công nghệ xử lý ô nhiễm môi trường biển.
• Các nội dung kỹ thuật đáng tham khảo:
  • Quy trình phân lập, làm giàu chọn lọc vi sinh vật sử dụng hydrocacbon từ mẫu nước biển ô nhiễm.
  • Kỹ thuật xác định chỉ số nhũ hóa $E_{24}$ với dung môi xylene theo phương pháp Cooper.
  • Quy trình tách chiết DNA, thiết lập phản ứng PCR với cặp mồi 27F/1492R để khuếch đại gen 16S rDNA và phân tích phả hệ vi sinh vật.
  • Phương pháp khối lượng (Gravimetric method) kết hợp chiết dung môi hữu cơ dichloromethane để định lượng TPH trong mẫu nước nhiễm dầu.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn DSVK2 được phân lập từ đâu và có đặc điểm phân loại như thế nào?
Chủng DSVK2 được phân lập từ mẫu nước biển nhiễm dầu tại Đồ Sơn, Hải Phòng. Chủng có dạng hình que (trực khuẩn, dài khoảng 2 µm), thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, khuẩn lạc màu vàng chanh nhạt, mép không đều. Kết quả giải trình tự gen 16S rDNA cho thấy chủng tương đồng 99.5% với loài Pseudomonas stutzeri và được ký hiệu là Pseudomonas sp. DSVK2.

2. Điều kiện nuôi cấy tối ưu để chủng DSVK2 sinh tổng hợp biosurfactant đạt hiệu suất cao nhất là gì?
Các điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định gồm: môi trường khoáng muối MSM, cơ chất dầu thô 3% (w/v), nguồn nitơ $\text{NH}_4\text{NO}3$ ở nồng độ 0.4% (w/v), giá trị pH 8.0, nhiệt độ nuôi cấy 30°C, lắc 180 rpm. Dưới điều kiện này, chỉ số nhũ hóa $E{24}$ đạt 69.0%.

3. Hoạt tính nhũ hóa ($E_{24}$) của chủng DSVK2 biến thiên như thế nào theo thời gian nuôi cấy?
Chủng DSVK2 bắt đầu sinh biosurfactant từ ngày thứ 4 ($E_{24} = 10%$), tăng nhanh và ổn định từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 12 (49%–52%), đạt đỉnh cao nhất vào ngày thứ 12 ($E_{24} = 52%$ trong điều kiện cơ bản) và giảm nhẹ xuống 40% ở ngày thứ 18.

4. Nguồn nitơ nào là phù hợp nhất cho chủng DSVK2 trong các nguồn được khảo sát?
Trong 6 nguồn nitơ được khảo sát ở nồng độ 0.3% (w/v), $\text{NH}_4\text{NO}3$ cho hiệu quả sinh biosurfactant cao nhất với $E{24} = 60.1%$, vượt trội so với $\text{KNO}_3$ (43%), $\text{NaNO}_3$ (36%), $\text{NH}_4\text{Cl}$ (33%), $(\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$ (30%) và $(\text{NH}_4)_2\text{HPO}_4$ (20%). Nồng độ $\text{NH}_4\text{NO}_3$ tối ưu tiếp tục được xác định là 0.4% (w/v).

5. Khả năng phân hủy dầu thô của chủng Pseudomonas sp. DSVK2 đạt mức định lượng bao nhiêu?
Phân tích hàm lượng dầu tổng số bằng phương pháp khối lượng cho thấy, sau 20 ngày nuôi cấy thực nghiệm, hàm lượng dầu thô trong môi trường giảm từ 28,950 mg/L xuống còn 10,712 mg/L, chứng minh khả năng chuyển hóa và làm giảm 18,238 mg/L dầu thô của chủng Pseudomonas sp. DSVK2.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Lê Việt Hùng đã phân lập và tuyển chọn thành công chủng vi khuẩn Gram âm Pseudomonas sp. DSVK2 từ vùng nước nhiễm dầu tại Đồ Sơn, Hải Phòng có khả năng sử dụng dầu thô mỏ Rồng làm nguồn cacbon duy nhất để sinh tổng hợp biosurfactant. Đề tài đã thiết lập chính xác các thông số nuôi cấy tối ưu (pH 8.0, 30°C, 3% dầu thô, 0.4% $\text{NH}_4\text{NO}3$), giúp nâng chỉ số nhũ hóa $E{24}$ từ 52.8% lên 69.0%. Kết quả định lượng TPH cho thấy hàm lượng dầu thô giảm từ 28,950 mg/L xuống 10,712 mg/L sau 20 ngày, khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tiễn của chủng vi khuẩn bản địa này trong công nghệ xử lý sinh học ô nhiễm tràn dầu tại các vùng biển Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY GRADUATION THESIS STUDY ON PRODUCTION OF BIOSURFACTANT BY STRAIN Pseudomonas USING CRUDE OIL AS SOLE CARBON SOURCE HANOI - 2022 VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE FACULTY OF BIOTECHNOLOGY GRADUATION THESIS STUDY ON PRODUCTION OF BIOSURFACTANT BY STRAIN Pseudomonas USING CRUDE OIL AS SOLE CARBON SOURCE STUDENT : LE VIET HUNG STUDENT’S CODE : 620391 CLASS : K62CNSHE SUPERVISOR : DR. KIEU THI QUYNH HOA ASSOC. NGUYEN VAN GIANG HANOI – 2022 COMMITMENT I hereby declare that this is my research and completion, the research results presented in the thesis are honest, and objective, and have never been used to present any subject project. I hereby declare that all help in the preparation of this thesis has been thanked, and the sources of information cited in this thesis have been acknowledged.

Hanoi, May 2022 Sincerely Le Viet Hung i ACKNOWLEDGMENTS First of all, with deep gratitude, I would like to thank Dr. Kieu Thi Quynh Hoa, Department of Petroleum Microbiology, Institute of Biotechnology (IBT), Vietnam Academy of Science and Technology (VAST), and Assoc. Nguyen Van Giang, Department of Microbial Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture (VNUA) are the person who oriented, guided, and at the same time, helped and created the best conditions to help me complete this thesis. I would like to express my sincere thanks to the staff of the Department of Petroleum Microbiology, IBT, VAST for their enthusiastic support and guidance during the experiment to complete the experiment into a thesis.

At the same time, I would like to thank the teachers of the Department of Microbial Biotechnology, VNUA for imparting valuable knowledge and passion for scientific research. Finally, I would like to sincerely thank my family and friends who have always accompanied, cared for, and encouraged me throughout the whole process of studying, researching, and completing the thesis. Hanoi, May 2022 Sincerely Le Viet Hung ii INDEX COMMITMENT. iii LIST OF ABBREVIATIONS.

vi LIST OF TABLES .vii LIST OF FIGURES. Purpose and requirements:. Petroleum hydrocarbon contamination (PHC). Petroleum hydrocarbon contamination in the world.

Petroleum hydrocarbon contamination in Vietnam. Effects of oil pollution on ecosystems and people. Mechanism of microbial biodegradation of petroleum hydrocarbons. Methods applied for treatment of petroleum hydrocarbon contaminants.

Classification of biosurfactants. Characterization of biosurfactants. Biosurfactants from microorganisms and their applications. Microbial production of biosurfactants.

Effect of environmental factors on production of biosurfactants. The potential application of biosurfactants. Study on biosurfactant producing microorganisms for petroleum hydrocarbon biodegradation. In the world.

Application of Pseudomonas in petroleum hydrocarbon pollution treatment. 19 PART III: MATERIALS AND METHODS. Machines and equipments. Isolation of bacteria using petroleum hydrocarbon as sole carbon source.

Selection of a bacterial strain capable of biosurfactant production with high emulsification activity on petroleum hydrocarbon substrate (crude oil). Identification of the selected bacterial strain. Effect of environmental and culture conditions on biosurfactant production of the selected bacterial strain. Determination of total oil content by gravimetric method.

24 PART IV: RESULTS. Screening of petroleum hydrocarbon (crude oil) utilizing and bio-surfactant producing bacterial strains. Identification of the selected petroleum hydrocarbon utilizing and biosurfactant producing bacterial strain. Morphological characteristics of the DSVK2 strain.

Classification of the DSVK2 strain by 16S rRNA gene sequence analysis. The biosurfactants producing ability on crude oil of the selected bacterial strain. Effect of environmental and culture conditions on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Effect of crude oil concentration on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain.

Effect of nitrogen sources on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Effect of different concentrations of NH4NO3 on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Effect of pH value on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Effect of temperature on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain.

Effect of concentrations of NaCl on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Effect of bacterial concentrations on biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain. Biodegradation of crude oil of Pseudomonas sp. 45 PART VI: CONCLUSIONS.

50 v LIST OF ABBREVIATIONS Abbreviations Explain APG Alkyl polyglycoside BS Biosurfactants CLP Cyclic Lipopeptide E24 Emulsifying index after 24 hours HC Hydrocarbons IBT Institute of Biotechnology MSM Mineral salt medium PAHs Polycyclic aromatic hydrocarbons PHC Petroleum Hydrocarbon Contamination SEM Scanning electron microscope ST Surface tension TABM Total aerobic bacteria medium TPH Total petroleum hydrocarbon VAST Vietnam Academy of Science and Technology VNUA Vietnam National University of Agriculture vi LIST OF TABLES Table 2. Large oil spill in the world. Large oil spill in Vietnam. Classification of biosurfactants by microorganisms.

Microorganisms capable of biosurfactant production. Equipment used for research .21 vii LIST OF FIGURES Figure 2. Mechanism of biodegradation petroleum. Colony morphology of DSVK2 strain on TABM.

Image of DSVK2 strain under scanning electron microscope. Biosurfactant of DSVK2 strain during 18 days of incubation. Biosurfactant production efficiency of DSVK2 during 18 days. Biosurfactant production of DSVK2 strain at different concentrations of crude oil after 12 days incubation.

Biosurfactant producing of DSVK2 strain with different crude oil content after 12 days incubation. Biosurfactant producing of DSVK2 strain with different nitrogen sources after 12 days incubation. Biosurfactant ability of strain DSVK2 with different nitrogen sources after 12 days. Biosurfactant production of DSVK2 strain at different concentrations of NH4NO3 after 12 days incubation.

Biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain with different concentrations of NH4NO3 after 12 days. Biosurfactant of DSVK2 strain at different pH values after 12 days. Biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain with different pH values after 12 days. Biosurfactant production of DSVK2 strain at different temperatures after 12 days incubation.

Biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain with different temperatures after 12 days. Biosurfactant of DSVK2 strain at different concentrations of NaCl after 12 days. Biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain with different concentrations of NaCl after 12 days. Biosurfactant of DSVK2 strain with different bacterial concentrations.

Biosurfactant production efficiency of DSVK2 strain with different bacterial concentrations after 12 days. Crude oil-degrading ability of Pseudomonas sp. DSVK2 after 20 day-experiment. Crude oil degradation efficiency of Pseudomonas sp.

DSVK2 after 20 day-experiment. 44 ix ABSTRACT Interest in microbial surfactants has been steadily increasing in recent years, as they have numerous advantages compared to chemical surfactants including lower toxicity, better environmental compatibility and effective properties at extreme temperature, pH values and salinity. A highly bio- surfactant-producing strain of Pseudomonas, DSVK2 was selected among the Pseudomonas isolates from marine environments and oil-contaminated sites. Sequence analysis of 16S rDNA showed that the DSVK2 strain similar to 99.5% with 16s rDNA sequence of Pseudomonas stutzeri.

The suitable conditions for the bio-surfactant production by the strain DSVK2 were found to be pH 8.0, 30oC; 3% (v/v) and 0,4% (w/v) for temperature, initial solution pH, initial concentration of carbon substrate (crude oil), and initial concentration of nitrogen substrate NH4NO3, respectively. The emulsification index (E24) increased from 52.8% to 69% under suitable conditions. The crude oil content decreased from 28,950 to 10,712 mg/l after 20 day-experiment by the strain DSVK2 in crude oil estimated. These results revealed that the strain DSVK2 exhibited tremendous potential for bioremediation of petroleum hydrocarbon contaminants.

Preface Petroleum or crude oil is a compound of hydrocarbons (HC) with diverse compositions, used to produce kerosene, diesel oil, and fuel gasoline, known as "black gold". In addition to the economic benefits from oil extraction, the serious environmental pollution problem caused by the oil extraction, transportation, and processing sectors is also a concern of oil-exploring and exporting countries in the World as well as in Vietnam. Oil pollution changes the habitats of many species of plants and animals, acidifies seawater, stretches oil spills, hinders the photosynthesis of phytoplankton, destroys ecosystems, etc. Oil pollution treatment at sea is a matter of concern for countries all over the world.

At present, traditional physical, chemical, and mechanical methods such as using oil floats, oil suction machines, dispersants, etc… are often used to treat oil pollution. However, chemical substances that contain toxins and have a negative effect on marine ecosystems and aquatic environments, with physical method only a small amount of oil can be obtained floating on the surface of the water and high cost. Compared to the traditional way, the method of biodegradation of crude oil by microorganisms is attracting research attention because of its advantages such as thorough treatment, low cost, no secondary pollution, and environmental friendliness. Biodegradation of petroleum HC by microorganisms can occur in two directions: (1) Microorganisms absorb HC by direct interaction between the cell and the oil drop; (2) create a biosurfactant to bring the insoluble HC compound into an emulsion for easy contact with microorganisms, then use the enzymes in the cell to decompose.

A biosurfactant is a compound containing both hydrophilic and lipophilic functional groups in the same molecule produced by microorganisms such as bacteria, yeasts, and molds. With properties such as surfactant, emulsifying, and foaming, they can be concentrated, mutually acting to reduce the surface tension between oil and 1 water phases, making it easier for microorganisms to come into contact with oil molecules and easily decompose the oil. Furthermore, biosurfactants can maintain their activity under varying temperatures, pH, NaCl, Ca 2+, and Mg2+ under extreme conditions. Therefore, biosurfactants are often used to treat oil contamination.

According to some reviews, the bio-surfactant is promising as a future major oil pollution treatment method. Microbial biosurfactant will not only apply in enhancing oil recovery, controlling oil spills, and biodegradation but will apply in wide of environmental protection including treat of waste polluted or other industrial products. In Vietnam, some studies on hydrocarbon petroleum-degrading microorganisms have achieved certain results, successfully isolated microorganisms residing in oil fields, oil wells such as Pseudomonas sp., (Lai Thuy Hien, Vuong Thi Nga, 2013, Kieu Thi Quynh Hoa et al. These microbial has been shown that can be used in petroleum hydrocarbons as a carbon source for energy exchange, this is the important key to determining their oil-degrading.

However, studies on bio-surfactants production by crude oil-utilizing microorganisms and their properties are still limited, have not been paid much attention, and studied systematically, especially in optical properties of intrinsic microorganisms producing bio-surfactant in degradation of seawater contaminated petroleum hydrocarbon. Purpose and requirements 1. Purpose To find microbial strains capable of producing biosurfactants on petroleum HC substrates for application in oil pollution treatment. Requirements - Isolation of bacterial strain capable of biosurfactants generating on petroleum hydrocarbon substrates (crude oil).

2 - Investigation of factors affecting the biosurfactants production of the selected bacterial strain such as temperature, pH, salinity, carbon source (crude oil), nitrogen source - Evaluation of the ability of petroleum hydrocarbons (crude oil) degradation of the selected bacterial strain based on total petroleum hydrocarbon (TPH) analysis. Petroleum hydrocarbon contamination (PHC) Petroleum, also known as crude oil, is a black-yellow liquid formed from geological layers. Petroleum products such as gas, gasoline, mazut oil, kerosene, diesel, lubricants, paraffin wax, asphalt and reagents, pesticides, pharmaceuticals,. The EIA forecasts the outlook for world oil production to reach 620,000 barrels per day to 96.9 million barrels per day in 2021 and 100.46 million barrels per day in 2022.

Although oil is an important energy source with high demand, it also pollutes oil HC is an alarming problem. Petroleum hydrocarbon contamination brings great harm to the human environment, economy, and society. Petroleum hydrocarbon contamination in the world Many causes are resulting in oil pollution, which greatly affects ecosystems and organisms yet as economic values. In the world, oil pollution may be caused by natural disasters, wars, conflicts, pipeline breakdowns, and tanker accidents… Table 2.

Large oil spill in the world No.