Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ bằng phương pháp nuôi cấy phôi

LỜI CAM ĐOAN

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu sơ lược về cây đinh lăng

1.2. Nguồn gốc và sự phân bố của cây đinh lăng

1.3. Phân loại và sự đa dạng của cây đinh lăng

1.4. Đặc điểm hình thái của cây đinh lăng lá nhỏ

1.5. Nhu cầu về điều kiện sinh thái của cây đinh lăng

1.6. Các thành phần hóa học chính và giá trị dược tính của cây đinh lăng

1.7. Hiện trạng công tác giống trong phát triển sản xuất cây đinh lăng

1.8. Phương pháp nuôi cấy mô và kỹ thuật tạo phôi vô tính ở thực vật

1.8.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và quá trình tạo phôi vô tính

1.8.2. Quá trình tạo phôi vô tính

1.8.3. Ảnh hưởng của các loại mô đến sự tạo phôi vô tính

1.8.4. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến sự tạo phôi vô tính

1.8.5. Nuôi cấy mô và tế bào trong dịch lỏng

1.9. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về nuôi cấy mô/phôi vô tính cây đinh lăng và hàm lượng axít oleanolic/saponin ở một số giống đinh lăng

1.9.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô/phôi vô tính cây đinh lăng trên thế giới và trong nước

1.9.2. Hàm lượng axít oleanolic/saponin ở một số giống đinh lăng

1.10. Ứng dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA trong nghiên cứu đặc điểm di truyền

1.10.1. Kỹ thuật mã vạch DNA (DNA barcode)

1.10.2. Kỹ thuật ISSR

1.11. Thuần dưỡng cây con từ nuôi cấy in vitro ra vườn ươm

1.11.1. Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng của cây trồng sau nuôi cấy mô

1.11.2. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của cây con trong vườn ươm

1.11.3. Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng của cây con sau nuôi cấy mô

2. CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2. Nội dung nghiên cứu

2.3. Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng axít oleanolic của 18 mẫu giống đinh lăng và xác định trình tự DNA barcode của 8 mẫu ĐLLN

2.4. Nội dung 2: Tạo mô sẹo và tạo phôi vô tính dòng ĐLLN ưu tú. Nhân phôi vô tính, tạo phôi vô tính trưởng thành và tạo cây từ phôi vô tính ĐLLN

2.6. Nội dung 4: Khảo sát sự sinh trưởng ở giai đoạn vườn ươm của dòng ĐLLN đã được nuôi cấy và đánh giá độ đồng nhất di truyền cây con

2.7. Phương pháp phân tích dữ liệu

2.7.1. Phân tích trình tự DNA barcode của 8 mẫu giống ĐLLN

2.7.2. Phân tích kết quả điện di chỉ thị ISSR của 8 mẫu đinh lăng nghiên cứu

2.7.3. Phân tích thống kê

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá hàm lượng axít oleanolic của 18 mẫu giống đinh lăng và xác định trình tự DNA barcode của 8 mẫu giống ĐLLN

3.1.1. Kết quả đánh giá hàm lượng axít oleanolic của 18 mẫu giống đinh lăng. Xác định trình tự 3 vùng gen DNA barcode của 8 mẫu giống ĐLLN

3.2. Cảm ứng tạo mô sẹo và tạo phôi vô tính cây ĐLLN

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến sự cảm ứng tạo mô sẹo của mẫu phiến lá và cuống lá cây ĐLLN in vitro

3.2.2. Ảnh hưởng của 2,4-D đến sự cảm ứng tạo mô sẹo của mẫu phiến lá và cuống lá cây ĐLLN từ vườn ươm

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng tạo phôi vô tính ĐLLN từ mô sẹo

3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến khả năng tạo phôi vô tính ĐLLN từ mô sẹo

3.2.5. Ảnh hưởng của loại và nồng độ đường (sucrose, fructose, glucose, maltose) đến khả năng tạo phôi vô tính ĐLLN

3.3. Nhân phôi vô tính, tạo phôi trưởng thành và tạo cây từ phôi vô tính ĐLLN

3.3.1. Ảnh hưởng của trọng lượng mô phôi nuôi cấy ban đầu và tốc độ lắc đến sự gia tăng sinh khối mô phôi vô tính trên hệ thống nuôi cấy lỏng lắc

3.3.2. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến sự gia tăng sinh khối phôi vô tính ĐLLN nhân nuôi bằng bioreactor

3.3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin và IBA đến khả năng tạo phôi vô tính ĐLLN trưởng thành

3.3.4. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến sự tạo cây từ phôi vô tính ĐLLN

3.4. Khảo sát sự sinh trưởng ở giai đoạn vườn ươm của dòng ĐLLN đã được nuôi cấy và đánh giá độ đồng nhất di truyền cây con

3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể và chế độ che sáng đến sự sinh trưởng của cây con ĐLLN trong vườn ươm giai đoạn đầu sau in vitro

3.4.2. Ảnh hưởng của giá thể và liều lượng đạm đến sinh trưởng của cây ĐLLN ra bầu trong vườn ươm

3.4.3. Ảnh hưởng của giá thể và liều lượng lân đến sinh trưởng của cây ĐLLN ra bầu trong vườn ươm

3.4.4. Đánh giá độ đồng nhất di truyền cây con bằng chỉ thị ISSR

3.5. Quy trình nhân giống cây ĐLLN bằng phương pháp nuôi cấy phôi vô tính

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

I. Nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ

Nghiên cứu tập trung vào nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa) thông qua phương pháp nuôi cấy phôi vô tính. Mục tiêu chính là xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh, đảm bảo hệ số nhân cao và chất lượng cây giống đồng nhất. Phương pháp này sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để tạo ra các phôi vô tính từ mô sẹo, sau đó phát triển thành cây hoàn chỉnh. Quá trình này bao gồm các bước: cảm ứng tạo mô sẹo, tái biệt hóa để tạo phôi, nhân sinh khối phôi, và tạo cây từ phôi. Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường MS bổ sung 2,4-D ở nồng độ 2 mg/L là tối ưu cho việc hình thành mô sẹo, với tỷ lệ thành công lên đến 98,9%.

1.1. Phương pháp nuôi cấy phôi vô tính

Phương pháp nuôi cấy phôi vô tính được áp dụng để nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ. Quá trình này bắt đầu bằng việc cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu lá và cuống lá. Mô sẹo sau đó được tái biệt hóa để tạo phôi vô tính. Môi trường MS bổ sung BA 1,5 mg/L và NAA 0,1 mg/L cho kết quả tốt nhất, với tỷ lệ hình thành phôi đạt 80%. Phôi vô tính được nhân sinh khối trong bioreactor, đạt hệ số nhân 22,9 lần sau 30 ngày nuôi cấy. Phương pháp này không chỉ tăng hiệu suất nhân giống mà còn đảm bảo tính đồng nhất di truyền của cây con.

1.2. Kỹ thuật nhân giống in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro được sử dụng để nhân nhanh cây đinh lăng lá nhỏ. Các phôi vô tính được nuôi cấy trong môi trường 1/2 MS bổ sung sucrose 15 g/L, adenine sulfate 10 mg/L, kinetin 0,5 mg/L, và IBA 0,2 mg/L. Môi trường SH cho kết quả tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất, với chiều cao cây đạt 2,5 cm và số lá đạt 8,9 lá/cây. Sau giai đoạn in vitro, cây con được chuyển sang vườn ươm, nơi chúng được trồng trên giá thể cát kết hợp che sáng trong 7 ngày đầu. Tỷ lệ sống của cây con đạt 84,4%, và chiều cao cây đạt 3,04 cm sau 21 ngày.

II. Phát triển cây đinh lăng lá nhỏ

Nghiên cứu cũng tập trung vào việc phát triển cây đinh lăng lá nhỏ sau giai đoạn nuôi cấy mô. Cây con được chuyển sang vườn ươm và trồng trên giá thể 1/2 mụn dừa, 1/4 tro trấu, và 1/4 phân hữu cơ vi sinh. Giá thể này kết hợp với bổ sung 0,6 g N, 0,6 g P2O5, và 0,3 g K2O cho mỗi bầu, giúp cây sinh trưởng tốt. Tỷ lệ xuất vườn đạt từ 92,6% đến 100%, với chiều cao cây từ 8,9 đến 12,3 cm. Kết quả đánh giá di truyền bằng kỹ thuật ISSR cho thấy các cây con đều đồng nhất về mặt di truyền so với cây mẹ, chứng tỏ hiệu quả của phương pháp sinh học trong nhân giống.

2.1. Thuần dưỡng cây con

Thuần dưỡng cây con là bước quan trọng sau giai đoạn in vitro. Cây con được trồng trên giá thể cát trong 7 ngày đầu, sau đó chuyển sang giá thể hỗn hợp. Giá thể 1/2 mụn dừa, 1/4 tro trấu, và 1/4 phân hữu cơ vi sinh được chứng minh là tối ưu cho sự sinh trưởng của cây. Chiều cao cây đạt từ 8,9 đến 12,3 cm, với số lá từ 5,4 đến 7,4 lá/cây. Tỷ lệ sống của cây con đạt 84,4%, và tỷ lệ xuất vườn đạt 92,6% đến 100%. Quá trình thuần dưỡng đảm bảo cây con thích nghi tốt với điều kiện ngoại cảnh.

2.2. Đánh giá di truyền

Đánh giá di truyền được thực hiện bằng kỹ thuật ISSR để kiểm tra tính đồng nhất của các cây con. Kết quả cho thấy các cây con được tạo ra từ phôi cây đinh lăng đều đồng nhất về mặt di truyền so với cây mẹ. Điều này chứng tỏ hiệu quả của phương pháp nuôi cấy phôi vô tính trong việc duy trì tính ổn định di truyền. Kỹ thuật này không chỉ giúp nhân giống nhanh chóng mà còn đảm bảo chất lượng cây giống, phù hợp cho sản xuất quy mô lớn.

III. Ứng dụng công nghệ sinh học

Nghiên cứu đã ứng dụng công nghệ sinh học trong việc nhân giống và phát triển cây đinh lăng lá nhỏ. Phương pháp nuôi cấy phôi vô tính kết hợp với kỹ thuật ISSR đã chứng minh hiệu quả trong việc tạo ra cây giống đồng nhất và chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao, đặc biệt trong việc phát triển cây dược liệu quy mô lớn. Phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp và dược liệu, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm.

3.1. Tăng trưởng cây đinh lăng

Tăng trưởng cây đinh lăng được đánh giá thông qua các chỉ số sinh trưởng như chiều cao, số lá, và số rễ. Kết quả cho thấy, cây con được tạo ra từ phôi vô tính có chiều cao đạt từ 8,9 đến 12,3 cm, với số lá từ 5,4 đến 7,4 lá/cây. Trọng lượng tươi của cây đạt từ 20,2 đến 34,3 g/cây. Các chỉ số này chứng tỏ hiệu quả của phương pháp nuôi cấy phôi vô tính trong việc tạo ra cây giống chất lượng cao, phù hợp cho sản xuất quy mô lớn.

3.2. Giá trị dược liệu

Giá trị dược liệu của cây đinh lăng lá nhỏ được đánh giá thông qua hàm lượng axít oleanolic. Kết quả phân tích HPLC cho thấy, dòng ĐLLN D7 có hàm lượng axít oleanolic cao nhất (1,18%). Điều này chứng tỏ tiềm năng dược liệu lớn của cây đinh lăng lá nhỏ. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy phôi vô tính không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen quý hiếm mà còn đảm bảo chất lượng dược liệu, phục vụ cho ngành y học và dược phẩm.

Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu nhân giống cây đinh lăng lá nhỏ polyscias fruticosa bằng nuôi cấy phôi vô tính