Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược về cây đinh lăng 1.1 Nguồn gốc và sự phân bố của cây đinh lăng Cây đinh lăng có nguồn gốc ở vùng đảo Polynésie thuộc Thái Bình Dương. Chi đinh lăng có gần 100 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, nhiều nhất là vùng đảo Thái Bình Dương. Đinh lăng được trồng nhiều ở Đông Nam Á và Châu Á Thái Bình Dương như Lào, Malaysia, Indonesia, Myanma, Papua New Guinea, Philippines, Singapore, Thái Lan và Việt Nam. Ở Việt Nam, đinh lăng đã được trồng từ rất lâu trên khắp cả nước trong các vườn gia đình, đình chùa, trạm xá bệnh viện (Võ Văn Chi và Trần Hợp, 1999).2 Phân loại và sự đa dạng của cây đinh lăng Theo Phạm Hoàng Hộ (2003), ở Việt Nam có sáu loài đinh lăng gồm đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms), đinh lăng lá tròn (Polyscias balfouriana Bail.), đinh lăng trổ (Polyscias guilfoylei (Cogn Marche) Bail.) hay còn gọi là đinh lăng viền bạc, đinh lăng lá to (Polyscias filicifolia (Merr) Bail.) còn gọi là đinh lăng ráng, đinh lăng đĩa (Polyscias scutellarius (Burm f.) có lá to tròn, đinh lăng răng (Polyscias serrata Balf.) có lá 2 lần kép, thân màu xám trắng.
Tất cả các loài đinh lăng đều được dùng làm thuốc, tuy nhiên đinh lăng lá nhỏ được trồng, nghiên cứu và sử dụng phổ biến nhất. Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) còn có tên gọi khác là cây gỏi cá, nam dương sâm, là một loại cây thuộc chi đinh lăng (Polyscias), họ Ngũ gia bì. Trong chi Polyscias có 100 loài. Một số loài được trồng làm cây cảnh và cây thuốc.1 Các loài đinh lăng ở Việt Nam 1.3 Đặc điểm hình thái của cây đinh lăng lá nhỏ Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.) Harms) có dạng cây bụi xanh tốt quanh năm, cao 0,5 - 2 m, thân tròn sần sùi không gai, có nhiều vết sẹo lồi to màu nâu xám do lá rụng để lại.
Lá mọc cách, kép lông chim 2 - 3 lần, dài 20 - 40 cm. Lá chét chia thùy nhọn không đều, màu xanh, bóng ở mặt dưới nhiều hơn, gốc lá và phiến lá thuôn nhọn dài 3 - 5 cm, rộng 0,5 - 1,5 cm; gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ với 3 - 4 cặp gân phụ. Cuống lá dài, tròn, màu xanh sậm, có những đốm xanh nhạt trên cuống, đáy cuống phình to thành bẹ lá. Lá kèm dạng phiến mỏng dính hai bên bẹ lá.
Rễ cong queo, mặt cắt ngang có màu vàng nhạt. Mặt ngoài rễ màu trắng xám có nhiều vết nhăn dọc, nhiều lỗ vỏ nằm ngang và vết tích của các rễ con. Hoa đinh lăng màu lục nhạt hoặc trắng xám, quả dẹt, màu trắng bạc (Đỗ Huy Bích, 1993).2 Cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L.4 Nhu cầu về điều kiện sinh thái của cây đinh lăng Đinh lăng nói chung, đinh lăng lá nhỏ nói riêng là cây lâu năm, có thể sống đến vài chục năm, ưa ẩm, không chịu được ngập úng, chịu hạn tương đối, ưa sáng, nhưng chịu được bóng, tuy nhiên cây phát triển yếu. Cây đinh lăng phân bố rộng trên khắp cả nước, ở tất cả các vùng sinh thái, có thể phát triển trên nhiều loại đất, nhưng tốt nhất là đất pha cát.
Cây phát triển mạnh trong môi trường có độ ẩm trung bình, nhiệt độ thích hợp từ 16 đến 29oC. Cây phát triển nhanh nhất vào mùa Thu, mùa Xuân và mùa hoa quả thường vào tháng 4 đến tháng 7 (Võ Văn Chi và Trần Hợp, 1999).5 Các thành phần hóa học chính và giá trị dược tính của cây đinh lăng Trong rễ đinh lăng có chứa alkaloid, glycoside, saponin flavonoid, 13 loại axít amin (trong đó có lysin, methionin, tryptophan, cystein là những axít amin không thể thay thế) và các hợp chất panaxydol, panoxydol, heptadeca - 1,8 (E) - dien - 4,6 diyn - 3,4 diol (Võ Xuân Minh, 1991). Các hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh và chống được một số dạng ung thư. Trong lá đinh lăng có chứa saponin triterpene, tinh dầu, phytosterol, tanin, axít hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic.
Saponin 8 triterpene có thành phần alkaloid và axít oleanolic, đây là một chất có tác dụng dược tính. Nghiên cứu của Lutomski và cs (1992) đã phân lập được từ rễ cây đinh lăng lá nhỏ 5 hợp chất polyacetylene và trong lá cũng tìm thấy 3 hợp chất, các chất này có tác dụng kháng khuẩn mạnh, trong đó chất panaxynol heptadeca - 1,8 - dien - 4,6 diyn - 3,10 diol có tác dụng chống một số dạng ung thư. Với nhiều dược tính quý, cây đinh lăng đã thu hút được quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học; sản phẩm từ cây đinh lăng giúp cơ thể phục hồi sức khỏe nhanh (Ngô Ứng Long, 1977). Tăng tiết niệu gấp trên 5 lần, tăng sức đề kháng (Đỗ Tất Lợi, 2004; Nguyễn Khắc Viện, 1989).
Chống viêm, giúp hạ sốt và giảm đau, tác dụng chống stress tương tự như nhân sâm (Bensita và cs, 1998). Theo Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2001), đinh lăng có tác dụng tăng lực, tăng sức đề kháng của cơ thể (Trần Thị Liên và cs, 2005), kích thích hoạt động của bộ não và nội tiết, chống trầm cảm, phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, giải tỏa lo âu mệt mỏi chống viêm và sơ vữa động mạch, chống oxy hóa, hạ cholesterol (Nguyễn Trần Châu và cs, 2007), bảo vệ gan, kích thích miễn dịch.2 Hiện trạng công tác giống trong phát triển sản xuất cây đinh lăng Hiện nay, diện tích sản xuất cây đinh lăng nguyên liệu ngày càng được mở rộng, do đó nhu cầu về cây giống trên thị trường có xu hướng tăng nhanh. Vì lý do này, nhu cầu sản xuất số lượng lớn cây giống chất lượng tốt và đồng nhất nhằm cung cấp nguồn nguyên liệu ổn định cho các công ty dược liệu là rất cần thiết. Tuy nhiên, việc sản xuất giống còn tự phát và chưa có được những nghiên cứu bài bản.
Thực tế cho thấy, khi sản xuất ở quy mô lớn, việc nhân giống và trồng cây đinh lăng gặp rất nhiều trở ngại như hệ số nhân giống thấp, cây sinh trưởng không đồng đều, tỷ lệ cây xuất vườn thấp (Ninh Thị Phíp, 2013). Hiện nay, có 2 phương pháp nhân giống cây đinh lăng là giâm cành và nuôi cấy mô. Nhân giống bằng giâm cành vô tính giúp cây con giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp nhân giống này là hệ số nhân giống thấp khó đáp ứng đủ cây giống khi sản xuất trên quy mô lớn, cây giâm hom 9 không có rễ chính mà chỉ có bộ rễ chùm, trong khi nhu cầu sử dụng lại cần có rễ chính.
Theo cách truyền thống, đinh lăng chủ yếu được nhân giống bằng phương pháp giâm cành. Nghiên cứu của Ninh Thị Phíp (2013) về một số biện pháp kỹ thuật tăng khả năng nhân giống của cây đinh lăng lá nhỏ cho thấy sử dụng giá thể đất và trấu hun giúp cây sinh trưởng phát triển tốt nhất. Sử dụng cành thân có chiều dài cành giâm từ 15 đến 20 cm, xử lý α-NAA nồng độ 2.000 ppm trong thời gian 3 - 5 giây giúp cành giâm ra rễ nhiều. Theo Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2013) tốt nhất nên chọn hom ngọn làm giống và hom giống có chiều dài 10 cm, đường kính 1,0 - 1,2 cm, có 3 - 4 đốt trên hom.
Sau khi cắt, hom giống chỉ nên bảo quản trong điều kiện khô mát từ 3 đến 5 ngày và tránh kéo dài trên 7 ngày nếu không sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ sống, tỷ lệ ra rễ. Giá thể cần phải xốp, thoáng khí, giữ và thoát nước tốt, sạch sâu bệnh, cỏ dại, không có thuốc trừ sâu và thành phần thường gồm đất, phân bò và tro trấu cho kết quả tốt nhất. Thời điểm chuyển hom ra ruộng thích hợp nhất là sau khi giâm 40 - 45 ngày. Để đáp ứng đủ nhu cầu cây đinh lăng giống cho sản xuất, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô thường cho hệ số nhân giống cao, cây con được trẻ hóa, sạch bệnh, dễ tạo được quần thể đồng nhất, có khả năng sản xuất quanh năm.
Cây đinh lăng hình thành từ phôi có bộ rễ tương tự như cây từ hạt, tạo ra rễ chính ngoài ra qua nuôi cấy mô còn có khả năng tạo ra sinh khối lớn. Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy phôi còn một số tồn tại như cây giống tạo ra có kích thước nhỏ, giá thành cao hơn so với các phương pháp truyền thống; trong quá trình chuyển cây con ra vườn ươm, tỷ lệ cây con bị chết đáng kể do có sự khác biệt về điều kiện môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, ngoài ra sự khác biệt về môi trường giá thể cũng là yếu tố có ảnh hưởng rất nhiều (Vũ Ngọc Phượng và cs, 2001).3 Phương pháp nuôi cấy mô và kỹ thuật tạo phôi vô tính ở thực vật 1.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và quá trình tạo phôi vô tính Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là dựa vào “tính toàn năng” (totipotency) của tế bào do Haberlandt đề xuất năm 1902. Theo quan niệm 10 sinh học hiện đại, “tính toàn năng” của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó. Mỗi tế bào thực vật có thể thực hiện đầy đủ tất cả các chức năng sinh lý của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Sự phát sinh phôi vô tính (somatic embryogenesis) là quá trình hình thành phôi hay cấu trúc giống phôi từ các tế bào soma mà không phải từ giao tử hoặc sản phẩm của quá trình kết hợp giao tử. Về mặt cơ chế phân tử sự phát sinh hình thái là một quá trình biểu hiện phức tạp của các gen và được kiểm soát nghiêm ngặt, đảm bảo cho các hệ thống, cơ quan trong cơ thể sống biệt hóa đúng thời điểm cần thiết trong quá trình phát triển cá thể (Merkle và cs, 1995; Yeung, 1995). Vì vậy, việc cảm ứng tạo phôi trải qua những sự kiện như kết thúc biểu hiện của các gen đang hoạt động và thay thế bằng chương trình biểu hiện gen phôi hóa để hình thành phôi vô tính.
Tạo phôi vô tính là kỹ thuật nhân giống thực vật in vitro quan trọng, cung cấp công cụ hữu ích cho các nghiên cứu cơ bản về sự phát triển phôi cũng như nhiều khía cạnh liên quan đến sinh lý thực vật (Komamine và cs, 2005).