MỞ ĐẦU Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất. Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến. Môi trường biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá.
Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể. Trong số đó có rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú. Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược. Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương (có chủ quyền biển với diện tích khoảng 1.000 km2) có hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển.
Chính phủ Việt Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển. Tuy nhiên nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần lớn trong các bệnh của con người và động vật. Khoảng nửa sau thế kỷ 19, người ta đã phát hiện vi sinh vật chính là nguyên nhân gây ra các bệnh truyền nhiễm.
Do đó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi sinh vật gây bệnh đã được phát triển thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra Penicillin – hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh và được Abraham, Chain, Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào năm 1941. Thuốc kháng sinh Penicillin trở nên nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều người trong chiến tranh thế giới II. Kể từ đó, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kì sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và lượng sản xuất ngày càng lớn.
Hiện nay, đã có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Nhưng càng ngày càng nhiều các vi sinh vật luan an 2 gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Do vậy, rất cần phải tiếp tục nghiên cứu, tìm kiếm, phát hiện các loại kháng sinh mới, các hoạt chất có tính kháng lao, chống ung thư. Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với tên đề tài: ‘‘Nghiên cứu phân lập và khảo sát hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào của các hợp chất thứ cấp từ ba chủng xạ khuẩn Streptomyces G246, G261, G248 thu thập tại vùng biển miền Trung - Việt Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu: Phát hiện các hợp chất có hoạt tính kháng sinh và gây độc tế bào từ nguồn vi sinh vật đáy biển miền Trung của Việt Nam, cụ thể là: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy của 3 chủng vi sinh vật phân lập từ vùng biển miền Trung – Việt Nam. - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này. Nhiệm vụ nghiên cứu: - Tổng quan tài liệu các nghiên cứu trước đây về các hợp chất thứ cấp cũng như hoạt tính sinh học từ các chủng vi sinh vật biển. - Tìm các quy trình xử lý dịch nuôi cấy để tạo dịch chiết.
Tinh chế các cặn dịch chiết này trên sắc ký cột để thu được các phân đoạn. - Tinh chế các chất có trong các phân đoạn để thu được các hợp chất sạch. - Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch phân lập được. - Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các chất phân lập được.
- Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với một số dòng tế bào ung thư như KB, MCF-7, Hep-G2, Lu-1 của các hợp chất sạch phân lập được. luan an 3 CHƢƠNG 1. Sự phân bố và tính đa dạng của vi sinh vật biển Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ mặn cao. Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước.
Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các hợp chất hữu cơ thứ cấp đặc biệt. Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên cạn. Vi sinh vật biển có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối tượng sinh vật biển mà vi sinh vật có thể liên kết. Hiểu được qui luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ tạo điều kiện thuận lợi để thu thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định hướng các nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1- 4].
Có 109 đơn vị phân loại vi khuẩn trên quả đất trong đó 106 taxa là từ đại dương. Sự phân bố của vi sinh vật biển là 105TB/ml và dự báo các đại dương chứa 3,6.1029 TB vi sinh vật, với phần lớn sinh khối là từ vi khuẩn, cổ khuẩn, xạ khuẩn và nấm đơn bào. Vi khuẩn thường chiếm ưu thế trong nước biển là Pseudomonas sp., và Micrococcus sp. Quần thể vi sinh vật biển có thể chia theo điều kiện sống của chúng.
Các sinh vật biển như hải miên, san khô mềm, thân mềm, rong, da gai và một số vật liệu biển khác như trầm tích được biết là vật chủ của cộng đồng vi sinh vật lớn và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự đặc hữu của từng loài. Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như điện di (DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA, người ta nhận thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên, san hô mềm và một số vật liệu biển khác có tới hơn 25 phyla, trong đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia, ngoài các thành viên của cổ khuẩn. Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên là nấm, xạ khuẩn và microalgae. Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola.
Những nghiên cứu về hải miên chỉ ra các loại vi sinh vật liên kết hải miên trong đó có các thành viên Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Cyanobacteria và Archaea [5]. Nhóm vi khuẩn hiếu khí là các vi khuẩn dị dưỡng, có khả năng phát triển trên luan an 4 nguồn cơ chất sẵn có như hiđrocacbon, lipit, protein ở điều kiện có oxy hay ít oxy. Nhóm vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ: bao gồm vi khuẩn nitrit hóa, nitrat hóa và vi khuẩn khử nitrat. Trong đó nhóm vi khuẩn nitrit hóa sẽ oxy hóa amonium thành nitrit để nhóm vi khuẩn nitrat hóa oxy hóa tiếp thành nitrat.
Còn nhóm vi khuẩn khử nitrat sẽ khử nitrat thành nitơ phân tử, khép kín một chu trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ. Nhóm vi sinh vật sử dụng hydrocacbon và tạo chất hoạt hóa bề mặt là các vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt hóa bề mặt và sử dụng các hyđrocacbon của dầu mỏ làm cơ chất cho sự phát triển. Số lượng của vi khuẩn sử dụng hydrocacbon là chỉ thị cho sự ô nhiễm dầu. Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản.
Những vi sinh vật này có thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới thềm đáy biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu. Khoảng 1% số tế bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát triển trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo. Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh các chất hữu cơ với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học thú vị [1-4]. Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [6].
Hầu hết các hợp chất thứ cấp đã biết từ vi khuẩn được tạo ra bởi xạ khuẩn (actinobacteria) và khuẩn lam (cyanobacteria). Xạ khuẩn và sự hình thành các hợp chất thứ cấp từ xạ khuẩn 1. Xạ khuẩn (Actinobacteria) Xạ khuẩn là ngành đặc biệt thuộc vi khuẩn Gram dương, có sự phát triển theo cấu trúc khoang, sợi (filamentous growth) và đôi lúc giống như nấm. Trước đây, xạ khuẩn thường được phân loại là nấm sợi (filamentous fungi) và thỉnh thoảng được gọi là ″vi khuẩn bậc cao″.
Chúng có đặc điểm hoá sinh học đặc biệt, tạo ra lượng lớn các loại hợp chất tự nhiên, rất nhiều trong số đó có hoạt tính sinh học mạnh như kháng sinh hoặc các hoạt tính dược học khác. Về khía cạnh các hợp chất tự nhiên, các chi quan trọng nhất trong xạ khuẩn là Streptomyces và Actinomyces. Xạ khuẩn biển có trong trầm tích biển và trong rất nhiều các sinh vật biển khác (endophytes). Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện một số chi xạ khuẩn biển mới với các hợp chất đặc luan an 5 trưng và quan trọng [7, 8].
Đặc biệt, các chi này đều có khả năng thích nghi với môi trường có độ mặn khác nhau. Các nghiên cứu hiện nay hầu hết đều sử dụng hệ thống phân loại xạ khuẩn của tác giả Bergey [9, 10]. Hệ thống phân loại này chủ yếu dựa trên các phân tích dải trình tự nucleotide một gene của RNA thay vì các dữ liệu về kiểu hình như truyền thống. Kể từ khi xuất hiện phương pháp so sánh dải trình tự rRNA [2], đã có những tranh luận kéo dài về hiệu quả của marker đơn phân tử (đơn gene), trong việc giải mã và xác định loài mới.