Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Cây đu đủ (Carica papaya L., thuộc chi Carica, họ Đu đủ - Caricaceae) là loài thực vật nhiệt đới được trồng phổ biến tại Việt Nam với diện tích ước tính khoảng 10.000 đến 17.000 hecta và sản lượng hằng năm đạt 200.000 đến 350.000 tấn quả. Các bộ phận của cây đu đủ như quả, lá, rễ, hạt và nhựa mủ đã được y học dân gian sử dụng rộng rãi và được nhiều công trình khoa học trong nước cũng như quốc tế nghiên cứu về thành phần hóa học cùng các hoạt tính sinh học (kháng khuẩn, kháng nấm, kháng giun sán, chống oxy hóa, hạ huyết áp, ức chế tế bào u bướu). Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào cây đu đủ cái hoặc quả và lá của cây đu đủ nói chung.

Tại khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng và nhiều địa phương ở Việt Nam, hoa và lá của cây đu đủ đực từ lâu đã được nhân dân sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để hỗ trợ điều trị các bệnh về đường hô hấp (viêm họng, ho, khản tiếng), bệnh bài tiết (sỏi thận, đái buốt, đái rắt) và hỗ trợ điều trị các bệnh ung thư (ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan). Mặc dù được sử dụng nhiều trong thực tế, các bộ phận của cây đu đủ đực vẫn chưa có đầy đủ cơ sở dữ liệu khoa học về thành phần hóa học định danh cũng như các thử nghiệm hoạt tính sinh học cụ thể. Thêm vào đó, nám da và các rối loạn tăng sắc tố do sự tích lũy quá mức melanin (xúc tác bởi enzyme tyrosinase) đang là vấn đề thẩm mỹ và da liễu phổ biến, thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các hợp chất ức chế tyrosinase an toàn từ thực vật. Trước thời điểm luận án thực hiện, chưa có công bố nào về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ bộ phận hoa cây đu đủ đực. Do đó, việc nghiên cứu có hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hoa và lá cây đu đủ đực là một yêu cầu khoa học cấp thiết.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án xác định hai mục tiêu chính:

  1. Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học của hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.).
  2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của các hợp chất phân lập được, nhằm tìm kiếm các hoạt chất làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.); các cao chiết phân đoạn ($n$-hexane, chloroform, dichloromethane, ethyl acetate) và các hợp chất hóa học được phân lập từ các cao chiết này.
  • Phạm vi nghiên cứu:
    • Không gian và thời gian thu mẫu: Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực được thu hái tại khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016. Tên khoa học được TS. Ngô Văn Trại (Viện Dược liệu) giám định; tiêu bản mang số hiệu DD001 được lưu giữ tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
    • Nội dung thực nghiệm: Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ở quy mô phòng thí nghiệm; thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư in vitro trên 3 dòng tế bào ung thư ở người (ung thư phổi A549, ung thư vú MCF-7, ung thư gan Hep3B) và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao chiết cùng các hợp chất tinh khiết.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Tác giả đã tổng hợp và phân tích có hệ thống các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây đu đủ (Carica papaya L.):

Về thành phần hóa học

  • Tại Việt Nam: Nguyễn Tường Vân và cộng sự (1983) đã chiết xuất và xác định alkaloid carpaine trong lá đu đủ. Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự (2007) sử dụng kỹ thuật HPLC xác định tỷ lệ $\beta$-carotene (57,050%) và luteine (11,864%) trong lá. Trần Thanh Hà và Trịnh Thị Điệp (2012) phân lập 4 hợp chất từ phân đoạn $n$-hexane của lá gồm $\beta$-sitosterol, daucosterol, sterculin A và cycloart-25-ene-3$\beta$,24($R/S$)-diol. Nguyễn Văn Rư và Vũ Quang Thái (2012) tách chiết chymopapain từ nhựa quả xanh. Hồ Thị Hà (2014) phân lập 6 hợp chất từ cặn dichloromethane lá đu đủ: danielone, carpainone, acid pluchoic, apocynol A, carpaine, pseudocarpaine. Giang Thị Kim Liên và Đỗ Thị Lệ Uyên (2015) khảo sát sơ bộ thành phần hoa đu đủ đực tại Đà Nẵng ghi nhận sự có mặt của alkaloid, ester, acid béo và sterol. Trần Thanh Hải (2016) phân lập kaempferol và kaempferol-3-$O$-$\beta$-glucopyranosid từ phân đoạn ethyl acetate hoa đu đủ đực ở Quảng Nam. Lê Thị Thanh Phương (2017) phân lập kaempferol và daucosterol từ phân đoạn chloroform hoa đu đủ đực. Đỗ Thị Hoa Viên và Trần Văn Lộc (2017) định lượng carpaine chiếm 63% tổng alkaloid lá đu đủ tại Hà Nội. Võ Thị Ngà và cộng sự (2020) phân lập 6 chất (stigmast-4-ene-3-one, $\beta$-sitosterol 3-$O$-$\beta$-glucopyranosid, 3-$O$-(6-$O$-tetradecanoyl-$\beta$-D-glucopyranosyl)-$\beta$-sitosterol, benzyl-$\beta$-D-glucoside, uracil, acid palmitic) từ hoa và cuống lá đu đủ đực tại Bình Định.
  • Trên thế giới: Govindachari T. (1965) xác định cấu trúc carpaine và pseudocarpaine. Tang Chung-Shih (1979) phân lập hai alkaloid piperideine dehydrocarpaine I và II. Canini và cộng sự (2007) tìm thấy acid caffeic, acid $p$-coumaric, acid protocatechuic, kaempferol, quercetin, 5,7-dimethoxycoumarin trong lá. Adlin Afzan và cộng sự (2012) xác định 12 hợp chất từ lá đu đủ gồm carpaine, acid malic, acid quinic, các dẫn xuất caffeoyl/coumaroyl/feruloyl malate và 4 flavonol glycoside (manghaslin, clitorin, rutin, nicotiflorin). Oduola và cộng sự (2012) phân lập dẫn xuất mới caricapinoside từ quả xanh. Agung Nugroho và cộng sự (2017) định lượng 7 flavonoid trong lá đu đủ tại Indonesia và chỉ ra kaempferol-3-($2^G$-rhamnosylrutinoside) chiếm hàm lượng cao nhất.
Nhóm hợp chất Các chất tiêu biểu đã được công bố trong các bộ phận cây đu đủ
Glucosinolate Benzyl isothiocyanate, benzyl glucosinolate, glucotropacolin (hạt, quả).
Phenolic & Flavonoid Rutin, kaempferol, quercetin, myricetin, acid caffeic, acid gallic, acid ferulic, manghaslin, clitorin.
Alkaloid Carpaine, pseudocarpaine, carpainone, dehydrocarpaine I & II, choline.
Sterol & Triterpene $\beta$-sitosterol, daucosterol, stigmasterol, sterculin A, cycloart-25-ene-3$\beta$,24($R/S$)-diol.
Carotenoid $\beta$-carotene, luteine, $\alpha$-carotene, lycopene, $\beta$-cryptoxanthin.

Về hoạt tính sinh học

  • Tác dụng trị giun sán và kháng sinh, kháng nấm: Satrija và cộng sự (1994), Kermanshai và cộng sự (2001) chứng minh benzyl isothiocyanate trong hạt có tác dụng diệt giun sán. Giordani và cộng sự (1996) ghi nhận nhựa đu đủ ức chế nấm Candida albicans. Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình (1999), Đỗ Huy Bích và Đặng Quang Chung (2006), Moses Alo và cộng sự (2012) chứng minh dịch chiết lá và các bộ phận có khả năng kháng các vi khuẩn gram âm, gram dương (E. coli, S. aureus, S. typhi...).
  • Tác dụng ức chế khối u và độc tế bào ung thư: Phạm Kim Mãn và cộng sự (2001) chứng minh cao cồn lá đu đủ ức chế u báng Sarcoma TG-180 trên chuột nhắt. Đỗ Thị Thảo (2006) chỉ ra cặn methanol lá gây độc dòng LU-1 (IC50 = 19,2 $\mu$g/mL). Rumiyati và cộng sự (2006) phát hiện protein bất hoạt ribosome (RIPs) trong lá gây độc tế bào T47D (IC50 = 2,8 $\mu$g/mL), làm tăng biểu hiện p53 (59,4%) và giảm Bcl-2 (63%). Morimoto và cộng sự (2008), Otsuki và cộng sự (2010) ghi nhận dịch chiết nước của lá đu đủ làm tăng các cytokine dạng Th1 (IL-12p40, IL-12p70, INF-$\gamma$, TNF-$\alpha$) kích hoạt quá trình tự chết của tế bào ung thư. Hồ Thị Hà (2014) chỉ ra carpaine và pseudocarpaine gây độc mạnh trên dòng KB, HL-60, LU-1, MCF-7 (IC50 từ 1,13 đến 3,49 $\mu$g/mL) và kích hoạt enzyme caspase 3/7.

Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết

Mặc dù dữ liệu về cây đu đủ khá phong phú, các nghiên cứu hóa học và sinh học hầu như tập trung vào quả, hạt và lá của cây đu đủ cái. Các công bố về bộ phận hoa và lá của cây đu đủ đực còn rất hạn chế, chủ yếu dừng lại ở các phân tích định tính sơ bộ hoặc phân lập một vài hợp chất đơn lẻ. Hơn nữa, hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất tinh khiết phân lập từ hoa đu đủ đực và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các chất này chưa từng được khảo sát toàn diện.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

Luận án dựa trên lý thuyết hóa học các hợp chất thiên nhiên (Natural Products Chemistry) kết hợp với các thử nghiệm sinh học phân tử in vitro:

  • Lý thuyết chiết tách và sắc ký: Dựa trên ái lực phân bố của các chất giữa pha tĩnh và pha động (pha thường và pha đảo) để chia tách hỗn hợp phức tạp thành từng cấu tử tinh khiết.
  • Lý thuyết phổ nghiệm cấu trúc: Sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, NOESY, ROESY) kết hợp phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) để giải đoán chính xác cấu trúc hóa học và vị trí các nhóm thế.
  • Khái niệm và cơ chế ức chế enzyme tyrosinase: Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là enzyme chứa ion đồng giữ vai trò xúc tác hai phản ứng đầu tiên trong chu trình sinh tổng hợp melanin: hydroxyl hóa L-tyrosine thành L-DOPA (hoạt tính monophenolase) và oxy hóa L-DOPA thành DOPAquinone (hoạt tính diphenolase). Các chất ức chế tyrosinase làm giảm sản sinh melanin thông qua việc tạo phức chelat với ion đồng hoặc cạnh tranh vị trí hoạt động của enzyme.

Phương pháp thực nghiệm thực tế

  1. Xử lý và chiết xuất mẫu: Mẫu bột khô hoa và lá cây đu đủ đực được chiết ngâm dầm kết hợp hỗ trợ của sóng siêu âm với dung môi methanol ở 50°C trong 30 phút, lặp lại nhiều lần đến khi chiết kiệt, cô quay chân không thu cao methanol tổng. Tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: $n$-hexane, chloroform, dichloromethane và ethyl acetate.
  2. Kỹ thuật phân lập và tinh chế:
    • Sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản tráng sẵn DC-Alufolien 60 $\text{F}{254}$ và RP-18 $\text{F}{254\text{s}}$ (Merck), phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc thuốc thử $\text{H}_2\text{SO}_4$ 10% hơ nóng.
    • Sắc ký lớp mỏng điều chế (prep-TLC) sử dụng silica gel 60G $\text{F}_{254}$.
    • Sắc ký cột (CC) pha thường với chất hấp phụ silica gel cỡ hạt 40–63 $\mu$m (240–430 mesh, Merck) và sắc ký cột pha đảo YMC RP-18 cỡ hạt 30–50 $\mu$m (Fujisilisa Chemical Ltd.).
  3. Kỹ thuật xác định cấu trúc:
    • Điểm nóng chảy (mp) đo trên máy Kofler micro-hotstage.
    • Phổ khối lượng ESI-MS đo trên hệ máy Agilent 6120 và Agilent 1100 LC-MSD; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrometer.
    • Phổ NMR ($^1\text{H}$, $^{13}\text{C}$, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY) ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer với chất chuẩn nội Tetramethylsilane (TMS).
  4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro:
    • Độc tính tế bào của các cao chiết: Đánh giá bằng phương pháp MTT (Mosmann, 1983) trên 3 dòng tế bào A549, MCF-7, Hep3B (GS. Jeong-Hyung Lee, Đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc cung cấp), đo mật độ quang ở bước sóng 570 nm bằng máy Elisa (Mark Pro, Biorad), tính tỷ lệ sống sót CS (%). Đối chứng dương: Camptothecin.
    • Độc tính tế bào của các hợp chất tinh khiết: Đánh giá trên các dòng A549, MCF-7, Hep3B (GS. Pezzuto, Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, Đại học Milan cung cấp) nuôi cấy trong môi trường DMEM đơn lớp bổ sung 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, 1,0 mM sodium pyruvate; xác định giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu$g/mL).
    • Ức chế enzyme tyrosinase: Thực hiện phối hợp với phòng thử nghiệm Sinh học - Khoa Dược - Trường Đại học Yonsei (Hàn Quốc), đo khả năng ức chế enzyme tyrosinase trong việc chuyển hóa L-DOPA/L-tyrosine, xác định tỷ lệ ức chế I (%) và giá trị $\text{IC}_{50}$ ($\mu$M) so sánh với đối chứng dương acid kojic.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày bối cảnh nghiên cứu, tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ kinh nghiệm dân gian sử dụng hoa và lá đu đủ đực để chữa bệnh nhưng thiếu minh chứng khoa học. Xác định rõ mục đích, 3 đối tượng, phạm vi nghiên cứu (thu mẫu tháng 12/2016 tại Quảng Nam - Đà Nẵng), 4 nội dung nghiên cứu, các phương pháp lý thuyết và thực nghiệm, ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn cùng cấu trúc tổng thể gồm 4 chương của luận án (130 trang, 41 bảng, 58 hình, 29 phụ lục).

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này gồm 25 trang, tập trung tổng kết các tài liệu khoa học:

  • Đặc điểm thực vật và sinh thái học: Cây đu đủ mang tính đồng chu nhưng phân hóa thành 3 dạng giới tính: cây đực, cây cái và cây lưỡng tính; giới tính có thể biến đổi theo nhiệt độ và thời tiết khô hạn. Nêu rõ các giống đang trồng ở Việt Nam (giống ta, Mehico, So Lo, Trung Quốc, Thái Lan, Đài Loan - F1 chiếm ưu thế).
  • Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học: Tổng quan chi tiết các nhóm chất (glucosinolate, phenolic, flavonoid, alkaloid, carotenoid, sterol, triterpene, acid hữu cơ) và các tác dụng dược lý đã được nghiên cứu của các bộ phận cây đu đủ.
  • Cơ sở lý thuyết về enzyme tyrosinase: Tổng quan về cơ chế chuyển hóa L-tyrosine và L-DOPA hình thành melanin, phân loại các chất ức chế tyrosinase tự nhiên (flavonoid như kaempferol, quercetin; aldehyde như anisaldehyde, cuminaldehyde; acid kojic) và tổng hợp (tropolone, 4-hexyl resorcinol, dẫn xuất mercaptoimidazole). Xác lập luận cứ khoa học để định hướng nghiên cứu trên hoa và lá đu đủ đực.

Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương này gồm 6 trang, mô tả chi tiết:

  • Thông tin mẫu thực vật hoa và lá thu tại Quảng Nam - Đà Nẵng (mã tiêu bản DD001, giám định bởi TS. Ngô Văn Trại).
  • Quy cách làm sạch, sấy ở 50–60°C, nghiền mịn và bảo quản mẫu.
  • Chi tiết hóa chất, dung môi tinh chế qua cột Vigereux và hệ thống trang thiết bị phân tích (Kofler, Agilent 6120, FT-ICR-MS, Bruker AM500).
  • Quy trình chuẩn của phương pháp chiết rắn - lỏng siêu âm, chiết lỏng - lỏng phân đoạn, sắc ký CC, TLC, phương pháp đo phổ và các quy trình thử nghiệm hoạt tính sinh học tế bào in vitro (MTT, SRB) và ức chế tyrosinase.

Chương 3. Thực nghiệm

Chương này gồm 18 trang, ghi nhận các quy trình phân lập cụ thể và thông số hóa lý của 30 hợp chất:

  • Tạo cao chiết:
    • Từ bột hoa đu đủ đực: điều chế các cao phân đoạn $n$-hexane (CPH), chloroform (CPC), dichloromethane (CPD) và ethyl acetate (CPET).
    • Từ bột lá đu đủ đực: điều chế các cao phân đoạn $n$-hexane (CPLH) và chloroform (CPLC).
  • Phân lập 30 hợp chất:
    • Từ cao chloroform hoa (CPC): phân lập C1 (rutin), C2 (acid gallic), C3 (daucosterol).
    • Từ cao dichloromethane hoa (CPD): phân lập CP1, CP3 (vitexoid), CP4 (lariciresinol), CP5 (dehydrodiconiferyl alcohol), CP6 (benzyl-$O$-$\beta$-D-glucopyranoside), CP9 (6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid), CP10 (6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid), CP11 (hỗn hợp 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolide và leucine), CP12A (caricapapayol), CP14 (2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol), CP17A (ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat), CP19 (indole-3-aldehyde), CP20 (3$\beta$,7$\alpha$-dihydroxycholest-5-ene), CP21 (cholest-5-ene-3$\beta$,7$\beta$-diol), CP22 (saringosterol).
    • Từ cao ethyl acetate hoa (CPET): phân lập CPE1 (kaempferol), CPE2 (quercetin), CPE3 (quercitrin), CPE4 (kaempferol-3-$O$-$\beta$-D-glucopyranoside), CPE5 (kaempferol-3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside), CPE6 (quercetin 3-$O$-$\beta$-D-galactopyranoside), CPE7 (kaempferol-3-$O$-$\alpha$-L-arabinopyranoside), CPE8 (myricitrin).
    • Từ cao chloroform lá (CPLC): phân lập CPL-C1 (tetratriacontanyl palmitate), CPL-C2 (1-hentriacontanol), CPL-C3 (vanillin), CPL-C4 (stigmasterol).
  • Ghi nhận đầy đủ điểm chảy (mp), dữ liệu phổ $^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR và MS của từng chất phân lập.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này gồm 59 trang, là nội dung cốt lõi của luận án:

  • Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết: Khảo sát tác dụng của các cao phân đoạn hoa (CPH, CPC, CPD, CPET) và lá (CPLH, CPLC) trên 3 dòng tế bào A549, MCF-7 và Hep3B.
  • Biện giải cấu trúc hóa học 30 hợp chất: Trình bày chi tiết lập luận xác định cấu trúc dựa trên tương tác phổ 1D và 2D-NMR (HSQC, HMBC, COSY) và HR-ESI-MS:
    • Caricapapayol (CP12A) - hợp chất mới: Xác định công thức phân tử và cấu trúc không gian qua các mũi thế đặc trưng và tương tác HMBC.
    • Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (CP17A) - hợp chất mới: Xác định chuỗi ester acid béo trihydroxy chưa no.
    • 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (CP1): Chứng minh cấu trúc của hợp chất pyrrole lần đầu phân lập từ tự nhiên.
    • Phân tích chi tiết 18 hợp chất lần đầu tìm thấy trong loài và các dẫn xuất flavonoid glycoside, steroid, phenolic đã biết.
  • Kết quả hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất: Đánh giá 24/30 hợp chất trên 3 dòng tế bào A549, MCF-7, Hep3B. Ghi nhận 19/24 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế với giá trị $\text{IC}_{50}$ nằm trong khoảng từ $26,72 \pm 0,76$ đến $93,07 \pm 5,03$ $\mu$g/mL.
  • Kết quả hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase: Cao methanol và 9 hợp chất từ hoa đu đủ đực được đánh giá. Kết quả có 7/9 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế enzyme với $\text{IC}_{50}$ trong khoảng từ $14,3 \pm 2,7$ đến $82,1 \pm 3,6$ $\mu$M. Hợp chất mới caricapapayol (CP12A) thể hiện hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh, tiệm cận với chất đối chứng dương acid kojic.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Phát hiện các hợp chất mới và mới từ tự nhiên:
    • Phân lập và xác định cấu trúc của 02 hợp chất mới: caricapapayol (ký hiệu CP12A) và ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (ký hiệu CP17A).
    • Phân lập được 01 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy từ nguồn gốc tự nhiên: 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (ký hiệu CP1).
    • Xác định được 18 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ cây đu đủ (Carica papaya L.): vitexoid, lariciresinol, dehydrodiconiferyl alcohol, 6-hydroxy-2,6-dimethyl-2,7-octadienoic acid, 6-hydroxy-2,6-dimethyloct-7-enoic acid, hỗn hợp 3-hydroxy-3-methyl-5-hexanolide và leucine, 2,6-dimethylocta-2,7-diene-1,6-diol, indole-3-aldehyde, 3$\beta$,7$\alpha$-dihydroxycholest-5-ene, cholest-5-ene-3$\beta$,7$\beta$-diol, saringosterol, quercitrin, kaempferol-3-$O$-$\alpha$-L-rhamnopyranoside, quercetin 3-$O$-$\beta$-D-galactopyranoside, kaempferol-3-$O$-$\alpha$-L-arabinopyranoside, tetratriacontanyl palmitate, 1-hentriacontanol và vanillin.
Phân loại đóng góp Tên hợp chất / Dữ liệu sinh học Ký hiệu trong luận án
Hợp chất mới Caricapapayol CP12A
Hợp chất mới Ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat CP17A
Lần đầu từ tự nhiên 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde CP1
Lần đầu từ loài (C. papaya) Vitexoid, lariciresinol, dehydrodiconiferyl alcohol, saringosterol, quercitrin, 1-hentriacontanol, vanillin... (18 chất) CP3, CP4, CP5, CP22, CPE3, CPL-C2, CPL-C3...
Hoạt tính độc tế bào ung thư (in vitro) 19/24 hợp chất có hoạt tính ức chế dòng A549, MCF-7, Hep3B ($\text{IC}_{50} = 26,72 \pm 0,76 - 93,07 \pm 5,03$ $\mu$g/mL) Thử nghiệm trên 3 dòng tế bào người
Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 7/9 hợp chất từ hoa có hoạt tính ($\text{IC}_{50} = 14,3 \pm 2,7 - 82,1 \pm 3,6$ $\mu$M); CP12A ức chế mạnh tương đương acid kojic Đánh giá so sánh với acid kojic
  1. Đóng góp dữ liệu hoạt tính sinh học mới:
    • Lần đầu tiên công bố dữ liệu thử nghiệm độc tính tế bào in vitro trên ba dòng tế bào ung thư ở người (A549, MCF-7, Hep3B) của 24/30 hợp chất từ hoa và lá đu đủ đực, xác định 19 hợp chất có tác dụng ức chế.
    • Lần đầu tiên công bố dữ liệu ức chế enzyme tyrosinase in vitro của cao methanol và 9 hợp chất phân lập từ hoa cây đu đủ đực; chứng minh hợp chất mới caricapapayol có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh gần tương đương với chất đối chứng dương acid kojic.

Ý nghĩa thực tiễn và kiến nghị

  • Cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm giải thích và chứng minh giá trị chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian của hoa và lá cây đu đủ đực.
  • Định hướng việc khai thác, chuẩn hóa nguồn nguyên liệu hoa đu đủ đực sẵn có tại địa phương để nghiên cứu phát triển các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đặc biệt là các chế phẩm hỗ trợ phòng ngừa, điều trị ung thư và các chế phẩm ức chế tyrosinase làm giảm sắc tố, hỗ trợ điều trị nám da.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về cơ chế phân tử của caricapapayol (CP12A) và các phân đoạn có hoạt tính cao trên các mô hình thử nghiệm in vivo.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của luận án

  • Các thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư và ức chế enzyme tyrosinase mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm trong điều kiện in vitro, chưa tiến hành thử nghiệm trên cơ thể sống (in vivo).
  • Trong số 30 hợp chất phân lập, chỉ có 24 chất được đánh giá độc tính tế bào và 9 chất từ hoa được thử nghiệm ức chế enzyme tyrosinase do giới hạn về lượng mẫu phân lập tinh khiết của một số hợp chất.
  • Mẫu thực vật mới được thu thập tại một địa điểm (Quảng Nam - Đà Nẵng) vào một thời điểm nhất định (tháng 12/2016), chưa khảo sát biến động hàm lượng hoạt chất theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Nghiên cứu mở rộng việc bán tổng hợp hoặc tối ưu hóa quy trình chiết xuất hoạt chất caricapapayol (CP12A) và các flavonoid glycoside nhằm thu nhận lượng chất lớn hơn phục vụ nghiên cứu ứng dụng.
  • Khảo sát chi tiết cơ chế tác động tế bào học và tín hiệu phân tử của caricapapayol đối với quá trình ức chế tổng hợp sắc tố melanin trên mô hình dòng tế bào hắc tố (Melanoma).
  • Triển khai đánh giá độc tính bán trường diễn và hoạt tính chống ung thư trên mô hình động vật thực nghiệm (in vivo).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo khoa học chuyên sâu, phục vụ thiết thực cho:

  • Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học: Thuộc các chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Hóa dược, Dược liệu học và Sinh học phân tử; có thể tham khảo trực tiếp quy trình phân lập các phân đoạn phân cực, bộ dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D-NMR và phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của các khung cấu trúc mới và các dẫn xuất glucoside quý.
  • Các nhà nghiên cứu Dược liệu và Y học cổ truyền: Sử dụng các dữ liệu nồng độ ức chế $\text{IC}_{50}$ trên các dòng tế bào A549, MCF-7, Hep3B và số liệu ức chế tyrosinase làm căn cứ khoa học vững chắc để phát triển các bài thuốc dân gian từ hoa đu đủ đực thành các sản phẩm thực phẩm chức năng hoặc dược mỹ phẩm chuẩn hóa.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án đã phát hiện ra những hợp chất mới nào từ cây đu đủ đực?

Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của 2 hợp chất hoàn toàn mới là caricapapayol (ký hiệu CP12A) và ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat (ký hiệu CP17A), cùng 1 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy từ nguồn gốc tự nhiên là 1-benzyl-5-(hydroxymethyl)-1H-pyrrole-2-carbaldehyde (ký hiệu CP1). Ngoài ra, có 18 hợp chất khác lần đầu tiên được phân lập từ loài Carica papaya L.

2. Các dòng tế bào ung thư nào được sử dụng để thử hoạt tính sinh học trong luận án và kết quả đạt được ra sao?

Ba dòng tế bào ung thư ở người được sử dụng là:

  • Dòng tế bào ung thư phổi A549;
  • Dòng tế bào ung thư vú MCF-7;
  • Dòng tế bào ung thư gan Hep3B. Kết quả thử nghiệm trên 24 hợp chất cho thấy 19 hợp chất có hoạt tính ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư này với giá trị $\text{IC}_{50}$ dao động trong khoảng từ $26,72 \pm 0,76$ đến $93,07 \pm 5,03$ $\mu$g/mL.

3. Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất từ hoa đu đủ đực đạt mức độ nào?

Trong số 9 hợp chất phân lập từ hoa đu đủ đực được thử nghiệm, có 7 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase với giá trị $\text{IC}_{50}$ từ $14,3 \pm 2,7$ đến $82,1 \pm 3,6$ $\mu$M. Đặc biệt, hợp chất mới caricapapayol (CP12A) thể hiện khả năng ức chế mạnh, tiệm cận với chất đối chứng dương thông dụng là acid kojic.

4. Các phương pháp và thiết bị phổ nghiệm chính nào được tác giả sử dụng để xác định cấu trúc hóa học?

Cấu trúc của 30 hợp chất được xác định thông qua việc đo điểm nóng chảy trên máy Kofler micro-hotstage, đo phổ khối lượng ESI-MS trên hệ máy Agilent 6120 / Agilent 1100, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS trên máy FT-ICR-Mass spectrometer, cùng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, $^1\text{H}$-$^1\text{H}$ COSY, NOESY) trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (chuẩn nội TMS).

5. Mẫu thực vật nghiên cứu được thu hái ở đâu và cơ quan nào giám định tên khoa học?

Mẫu hoa và lá cây đu đủ đực được thu hái tại khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng vào tháng 12 năm 2016. Tên khoa học Carica papaya L. do TS. Ngô Văn Trại thuộc Viện Dược liệu giám định. Tiêu bản thực vật mang số hiệu DD001 được lưu giữ tại Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Kết luận

Luận án tiến sĩ Hóa hữu cơ của nghiên cứu sinh Đỗ Thị Thúy Vân đã hoàn thành việc nghiên cứu toàn diện và có hệ thống về thành phần hóa học cùng hoạt tính sinh học của hoa và lá cây đu đủ đực (Carica papaya L.) thu hái tại Quảng Nam - Đà Nẵng. Bằng các phương pháp chiết tách, sắc ký và hệ thống phổ hiện đại ($^1\text{H}$-NMR, $^{13}\text{C}$-NMR, 2D-NMR, HR-ESI-MS), công trình đã phân lập và xác định cấu trúc 30 hợp chất, trong đó phát hiện 2 hợp chất mới (caricapapayol, ethyl-(9E)-8,11,12-trihydroxyoctadecenoat), 1 hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên và 18 hợp chất lần đầu phân lập từ loài này. Đánh giá sinh học in vitro đã khẳng định hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên 3 dòng tế bào người (A549, MCF-7, Hep3B) của 19 hợp chất và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 7 hợp chất từ hoa đu đủ đực, nổi bật là caricapapayol có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh gần tương đương acid kojic. Kết quả nghiên cứu đã cung cấp những dẫn liệu khoa học thực nghiệm có giá trị cao, góp phần bổ sung vào kho tàng hợp chất thiên nhiên và làm sáng tỏ cơ sở khoa học của việc sử dụng cây đu đủ đực trong y học dân gian.