Luận văn thạc sĩ về hạt nano từ tính và ứng dụng kháng thể trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

• Tác giả: Trương Thị Bích Châu
• Người hướng dẫn: PGS. TS Trần Hoàng Hải
• Trường học: Đại học Quốc gia TP.HCM
• Chuyên ngành: Vật liệu và linh kiện nano
• Đề tài: Nghiên cứu hạt nano từ tính kết hợp kháng thể cho chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: TP. HCM

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về hạt nano từ
• 1.2. Vật liệu từ
• 1.3. Tính chất của hạt nano oxit sắt từ
• 1.3.1. Tính chất vật liệu nano
• 1.3.2. Tính siêu thuận từ của oxit sắt từ Fe3O4
• 1.4. Chất lỏng từ
• 1.4.1. Khái niệm
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
• 2.1. Tổng hợp hạt trần nano oxít sắt từ Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa
• 2.2. Quy trình tổng hợp hạt ôxít sắt bọc SiO2
• 2.3. Chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe3O4@SiO2 với APTES và glutaraldehyde
• 2.4. Kiểm tra độ tinh thể của kháng thể bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12%–SDS
• 2.5. Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford
• 2.6. Cộng hợp kháng thể lên hạt từ
• 2.7. Xác định hiệu suất cộng hợp
• 2.8. Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ
• 3.1. Tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 (F2)
• 3.2. Phân tích các liên kết bằng phổ hấp thụ hồng ngoại FT – IR
• 3.3. Phân tích cấu trúc tinh thể bằng phổ nhiễu xạ tia X
• 3.4. Phân tích hình thái và kích thước hạt bằng ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
• 3.5. Khảo sát lớp vỏ bọc silica trên mẫu F2
• 3.6. Phân tích các liên kết bằng phổ FT – IR với mẫu FS
• 3.7. Khảo sát lượng TEOS nhỏ vào
• 3.8. Phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ F2, FS1, FS2, FS4
• 3.9. So sánh phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ trước và sau khi chức năng hóa bề mặt
• 3.10. Phương pháp nhiệt trọng lượng TGA
• 3.11. Ứng dụng các hạt nano từ tính với các lớp kháng thể trên bề mặt ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm
• 3.11.1. Chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết với kháng thể NS1
• 3.11.2. Xác định thành phần protein trong kháng huyết thanh thương mại bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 10%
• 3.11.3. Miễn dịch huỳnh quang với kháng thể thương mại NS3
• 3.11.4. Khảo sát chọn nồng độ kháng thể NS3 liên kết vào hạt từ
• 3.11.5. Độ hấp thu của kháng thể NS3
• 3.11.6. Khảo sát đối chứng giữa kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả Viện Pasteur và Viện Y tế cộng đồng
• 3.11.7. Chẩn đoán ung thư gan với Glypican 3
• 3.11.8. Gắn Glypican 3 lên hạt từ
• 3.11.9. Khảo sát đối chứng giữa kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả siêu âm gan tại Bệnh viện Ung bứu Cần Thơ
• 3.11.10. Kết luận chung
• DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG BIỂU

I. Tổng quan về hạt nano từ tính

Hạt nano từ tính là một trong những vật liệu quan trọng trong công nghệ nano, đặc biệt trong lĩnh vực y sinh. Chúng có kích thước nhỏ, thường dưới 100 nanomet, và có khả năng tương tác với từ trường. Hạt nano từ tính được chế tạo từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là oxit sắt như Fe3O4. Tính chất của hạt nano này bao gồm độ bão hòa từ cao, tính siêu thuận từ và khả năng tương thích sinh học. Đặc biệt, tính siêu thuận từ cho phép chúng không có hiện tượng từ trễ, giúp dễ dàng điều khiển và tách chiết trong các ứng dụng y sinh. Việc sử dụng hạt nano trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát hiện sớm và chính xác các bệnh lý. Theo nghiên cứu, công nghệ nano có thể giúp phát hiện các vi khuẩn và virus ở mức độ nano mét, nhờ vào phương pháp liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.

1.1. Tính chất của hạt nano oxit sắt từ

Hạt nano oxit sắt từ, đặc biệt là Fe3O4, có nhiều tính chất nổi bật. Đầu tiên, chúng có độ cứng cao và diện tích bề mặt lớn, giúp tăng cường khả năng tương tác với các phân tử sinh học. Tính siêu thuận từ của hạt nano này cho phép chúng dễ dàng bị từ hóa và không giữ lại từ tính khi không có từ trường bên ngoài. Điều này rất quan trọng trong các ứng dụng y sinh, nơi mà sự an toàn và hiệu quả là ưu tiên hàng đầu. Hơn nữa, hạt nano oxit sắt có khả năng tương thích sinh học cao, không gây độc hại cho cơ thể, làm cho chúng trở thành lựa chọn lý tưởng cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán mới. Việc nghiên cứu và phát triển các hạt nano này không chỉ có ý nghĩa khoa học mà còn có giá trị thực tiễn cao trong việc cải thiện chất lượng chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.

II. Ứng dụng của hạt nano từ tính trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

Việc ứng dụng hạt nano từ tính trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm đã mở ra một hướng đi mới trong y học. Các hạt nano này có thể được gắn với kháng thể đặc hiệu để phát hiện các tác nhân gây bệnh như virus và vi khuẩn. Phương pháp này không chỉ giúp phát hiện nhanh chóng mà còn chính xác hơn so với các phương pháp truyền thống. Chẳng hạn, trong chẩn đoán sốt xuất huyết, hạt nano có thể được sử dụng để phát hiện kháng thể NS1 trong huyết thanh bệnh nhân. Kết quả cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cao hơn nhiều so với các phương pháp hiện có. Hơn nữa, việc sử dụng hạt nano trong chẩn đoán giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời giảm thiểu rủi ro cho bệnh nhân. Điều này chứng tỏ rằng công nghệ nano không chỉ là một xu hướng mà còn là một giải pháp thực tiễn cho các vấn đề y tế hiện nay.

2.1. Phương pháp ELISA có sử dụng hạt nano từ tính

Phương pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) là một trong những kỹ thuật phổ biến trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm. Việc kết hợp hạt nano từ tính với phương pháp ELISA đã tạo ra một bước tiến lớn trong việc phát hiện các kháng thể và kháng nguyên. Hạt nano từ tính có thể được sử dụng để tăng cường độ nhạy của phương pháp này, giúp phát hiện các bệnh lý ở nồng độ rất thấp. Nghiên cứu cho thấy rằng việc sử dụng hạt nano trong ELISA không chỉ cải thiện độ nhạy mà còn giảm thiểu thời gian thực hiện xét nghiệm. Điều này đặc biệt quan trọng trong các tình huống khẩn cấp, nơi mà việc chẩn đoán nhanh chóng có thể cứu sống bệnh nhân. Sự kết hợp này không chỉ mang lại hiệu quả cao mà còn mở ra nhiều cơ hội mới cho việc phát triển các phương pháp chẩn đoán tiên tiến trong tương lai.

Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh các bệnh truyền nhiễm đang là mối đe dọa lớn đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu, việc phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm, chính xác và hiệu quả là vô cùng cần thiết. Theo ước tính, khoảng 2,5 tỷ người đang sinh sống trong vùng có lưu hành bệnh sốt xuất huyết, một trong những bệnh truyền nhiễm phổ biến do virus Dengue gây ra. Bệnh truyền nhiễm không chỉ gây ra các biến chứng nghiêm trọng mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh ung thư như ung thư gan. Do đó, mục tiêu nghiên cứu của luận văn là tổng hợp các hạt nano oxit sắt từ tính có tính siêu thuận từ, chức năng hóa bề mặt với các lớp kháng thể đặc hiệu, nhằm ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng kỹ thuật ELISA có sử dụng hạt nano từ tính. Nghiên cứu được thực hiện trong phạm vi phòng thí nghiệm công nghệ nano tại Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh và Đại học Quốc gia Hà Nội, tập trung vào việc tối ưu hóa kích thước, tính chất từ và khả năng gắn kết kháng thể của hạt nano để nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán. Việc ứng dụng các hạt nano từ tính phủ kháng thể trên bề mặt hứa hẹn mang lại giải pháp chẩn đoán nhanh, tiết kiệm chi phí và có thể mở rộng ứng dụng trong y sinh học, đặc biệt trong phát hiện sớm các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về vật liệu nano từ tính, đặc biệt là tính siêu thuận từ của hạt nano oxit sắt Fe3O4. Tính siêu thuận từ là đặc điểm quan trọng giúp hạt nano mất từ tính khi không có từ trường ngoài, tránh hiện tượng từ trễ và tăng hiệu quả ứng dụng trong y sinh học. Lý thuyết về chất lỏng từ (ferrofluid) cũng được áp dụng, trong đó hạt nano từ tính được phân tán trong dung môi với lớp phủ bề mặt nhằm tăng tính ổn định và tương thích sinh học. Các khái niệm chính bao gồm:

• Tính siêu thuận từ và các thông số từ tính như độ từ hóa bão hòa, lực kháng từ.
• Chức năng hóa bề mặt hạt nano bằng các nhóm amin (APTES) và hoạt hóa bằng glutaraldehyde để gắn kháng thể.
• Tương tác đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể trong kỹ thuật ELISA.
• Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS) sử dụng hạt nano từ tính gắn kháng thể để cô đặc và phân tích vi sinh vật gây bệnh.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu hạt nano oxit sắt Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, sau đó phủ lớp silica bằng phương pháp Stober và chức năng hóa bề mặt với APTES và glutaraldehyde. Cỡ mẫu hạt nano được kiểm soát trong khoảng 10-20 nm để đảm bảo tính siêu thuận từ và khả năng gắn kháng thể hiệu quả. Phương pháp chọn mẫu là tổng hợp mẫu trong phòng thí nghiệm với điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt về pH, nhiệt độ và tỷ lệ các hóa chất. Phân tích cấu trúc và tính chất vật liệu được thực hiện bằng các kỹ thuật: phổ hấp thụ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), nhiễu xạ tia X (XRD), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), từ kế mẫu rung (VSM) và phân tích nhiệt trọng lượng (TGA). Hiệu suất gắn kháng thể được xác định bằng phương pháp Bradford. Thời gian nghiên cứu kéo dài khoảng 12 tháng, bao gồm các giai đoạn tổng hợp, chức năng hóa, phân tích và ứng dụng thử nghiệm trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm bằng kỹ thuật ELISA có sử dụng hạt nano từ tính.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 có tính siêu thuận từ: Mẫu hạt nano Fe3O4 (F2) có kích thước trung bình dưới 10 nm, được xác định bằng TEM và công thức Scherrer từ phổ XRD. Đường cong từ hóa đo bằng VSM cho thấy lực kháng từ gần bằng 0 và độ từ hóa bão hòa đạt khoảng 62 emu/g, khẳng định tính siêu thuận từ của hạt.

2. Hiệu quả phủ lớp silica và chức năng hóa bề mặt: Lớp phủ silica (mẫu FS) được tạo thành thành công với độ dày lớp vỏ có thể điều chỉnh bằng lượng TEOS, từ 0,05 ml đến 0,4 ml. Độ từ hóa giảm từ 46,61 emu/g (TEOS 0,1 ml) xuống còn 11,32 emu/g (TEOS 0,4 ml), cho thấy lớp phủ dày làm giảm tính từ nhưng vẫn duy trì tính siêu thuận từ. Lớp phủ silica giúp tăng tính ổn định và tương thích sinh học của hạt.

3. Chức năng hóa bề mặt với APTES và glutaraldehyde: Sau khi chức năng hóa, độ từ hóa của mẫu giảm còn khoảng 34 emu/g nhưng hiệu suất gắn kháng thể tăng đáng kể. Phương pháp gắn kháng thể qua nhóm amin trên bề mặt hạt nano cho hiệu suất gắn đạt khoảng 80-90%, được xác định bằng phương pháp Bradford.

4. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm: Phức hợp hạt nano từ tính gắn kháng thể NS3 và Glypican 3 được sử dụng trong kỹ thuật ELISA cho kết quả đối chứng tốt với các phương pháp chuẩn tại Viện Pasteur và Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ELISA có sử dụng hạt nano từ tính được cải thiện khoảng 15-20% so với phương pháp truyền thống, giúp chẩn đoán sớm và chính xác hơn.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy việc tổng hợp hạt nano Fe3O4 với kích thước nhỏ và tính siêu thuận từ cao là nền tảng quan trọng để ứng dụng trong y sinh học. Lớp phủ silica mỏng vừa đủ giúp bảo vệ hạt khỏi oxi hóa và kết tụ, đồng thời tạo bề mặt thuận lợi cho chức năng hóa. Việc sử dụng APTES để tạo nhóm amin trên bề mặt hạt nano và hoạt hóa bằng glutaraldehyde giúp tăng hiệu quả gắn kháng thể, đảm bảo tính đặc hiệu và ổn định của phức hợp hạt từ – kháng thể. So với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này giảm thiểu hao tốn sinh phẩm và tăng độ bền của phức hợp. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ so sánh độ từ hóa của các mẫu hạt nano trước và sau khi phủ lớp silica, cũng như biểu đồ hiệu suất gắn kháng thể tương ứng. Kết quả ELISA đối chứng với các phương pháp chuẩn chứng minh tính khả thi và tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm như sốt xuất huyết và ung thư gan.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình phủ lớp silica: Giảm lượng TEOS để tạo lớp phủ mỏng hơn nhằm duy trì độ từ hóa cao, tăng hiệu quả gắn kháng thể và khả năng tách miễn dịch từ. Thời gian thực hiện: 3-6 tháng. Chủ thể: nhóm nghiên cứu vật liệu nano.

2. Phát triển bộ kit ELISA sử dụng hạt nano từ tính: Thiết kế bộ kit chẩn đoán nhanh, dễ sử dụng cho các bệnh truyền nhiễm phổ biến, tập trung vào nâng cao độ nhạy và độ đặc hiệu. Thời gian: 6-12 tháng. Chủ thể: phòng thí nghiệm công nghệ sinh học và đối tác công nghiệp.

3. Nghiên cứu ứng dụng mở rộng: Áp dụng phức hợp hạt nano từ – kháng thể trong phân tách tế bào, dẫn truyền thuốc và chẩn đoán các bệnh khác như viêm gan, HIV. Thời gian: 12-18 tháng. Chủ thể: các viện nghiên cứu y sinh và công nghệ nano.

4. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật tổng hợp và ứng dụng hạt nano từ tính cho các nhà khoa học và kỹ thuật viên trong lĩnh vực y sinh. Thời gian: liên tục. Chủ thể: trường đại học và viện nghiên cứu.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu vật liệu nano và công nghệ sinh học: Nghiên cứu về tổng hợp, chức năng hóa và ứng dụng hạt nano từ tính trong y sinh học, phát triển các vật liệu mới có tính năng ưu việt.

2. Chuyên gia y sinh và chẩn đoán bệnh: Áp dụng kỹ thuật ELISA có sử dụng hạt nano từ tính để nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong phát hiện sớm các bệnh truyền nhiễm và ung thư.

3. Doanh nghiệp công nghệ sinh học và dược phẩm: Phát triển sản phẩm chẩn đoán nhanh, bộ kit xét nghiệm và các giải pháp y tế dựa trên công nghệ nano từ tính.

4. Sinh viên và học viên cao học ngành vật liệu, công nghệ nano và y sinh: Học tập, nghiên cứu và phát triển các đề tài liên quan đến vật liệu nano và ứng dụng trong y học hiện đại.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn Fe3O4 làm vật liệu hạt nano từ tính?
   Fe3O4 có độ từ hóa bão hòa cao, tính siêu thuận từ và tương thích sinh học tốt, không độc hại khi sử dụng ở nồng độ thấp, phù hợp cho ứng dụng y sinh.

2. Lớp phủ silica có vai trò gì?
   Silica bảo vệ hạt nano khỏi oxi hóa và kết tụ, tạo bề mặt ổn định để chức năng hóa với các nhóm amin, giúp tăng hiệu quả gắn kháng thể và duy trì tính chất từ.

3. Phương pháp gắn kháng thể lên hạt nano như thế nào?
   Sử dụng APTES để tạo nhóm amin trên bề mặt hạt nano, sau đó hoạt hóa bằng glutaraldehyde để tạo liên kết đồng trị với nhóm amin trên kháng thể, đảm bảo độ bền và hoạt tính.

4. Kỹ thuật ELISA có sử dụng hạt nano từ tính có ưu điểm gì?
   Tăng độ nhạy và độ đặc hiệu nhờ khả năng tập trung và cô đặc kháng nguyên bằng từ trường, giúp phát hiện sớm bệnh với chi phí và thời gian giảm đáng kể.

5. Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS) được ứng dụng ra sao?
   IMS sử dụng hạt nano từ tính gắn kháng thể đặc hiệu để bắt giữ và tách các vi sinh vật hoặc tế bào mục tiêu từ mẫu phức tạp, giúp tăng độ chính xác và hiệu quả phân tích.

Kết luận

• Đã tổng hợp thành công hạt nano oxit sắt Fe3O4 có tính siêu thuận từ với kích thước dưới 10 nm và độ từ hóa bão hòa khoảng 62 emu/g.
• Lớp phủ silica mỏng được điều chỉnh bằng lượng TEOS giúp duy trì tính siêu thuận từ và tăng tính ổn định bề mặt.
• Chức năng hóa bề mặt bằng APTES và glutaraldehyde nâng cao hiệu suất gắn kháng thể lên đến 80-90%.
• Ứng dụng phức hợp hạt nano từ – kháng thể trong kỹ thuật ELISA cho kết quả chẩn đoán bệnh truyền nhiễm chính xác, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí.
• Đề xuất tiếp tục tối ưu hóa lớp phủ và phát triển bộ kit chẩn đoán, mở rộng ứng dụng trong y sinh học và đào tạo chuyển giao công nghệ.

Hành động tiếp theo: Khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển sản phẩm chẩn đoán dựa trên công nghệ nano từ tính để nâng cao hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễm.