MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Ý nghĩa khoa học.
Ý nghĩa thực tiễn. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu.
Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae.
Hệ thống miễn dịch của thực vật chống lại tác nhân gây bệnh. Tính kháng di truyền của lúa đối với nấm gây bệnh đạo ôn, M. Vai trò của các phân tử RNAs nhỏ liên quan đến tính kháng bệnh đạo ôn trên lúa. Quá trình sinh tổng hợp microRNA ở thực vật.
Vai trò và chức năng của các miRNAs làm tăng khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. Vai trò và chức năng của các miRNAs làm giảm khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa, Magnaporthe oryzae. Vai trò và chức năng của gen OsNramp6. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
Nội dung nghiên cứu. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu.
Phương pháp xác định và đánh giá khả năng chống chịu với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm. Phương pháp chiết xuất RNA. Phương pháp xác định sự hiện diện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thí nghiệm.
Phương pháp xác định sự biển hiện của phân tử osa-miR7695, osa- miR169a, osa-miR160a và OsNramp6 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm. Phương pháp xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6. Phương pháp xác định microRNA tiềm năng. Phương pháp phân tích thống kê.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. oryzae trên các giống lúa bằng phương pháp PCR. Đánh giá khả năng chống chịu/mẫn cảm với nấm M. oryzae trên các giống lúa thí nghiệm.
Xác định sự hiện diện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thí nghiệm. Đánh giá mức độ biểu hiện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. Phân tích giá trị biểu hiện của phân tử osa-miR7695 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. Đánh giá biểu hiện của phân tử osa-miR160a trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae.
Đánh giá biểu hiện của phân tử osa-miR169a trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, Magnaporthe oryzae. Đánh giá mức độ biểu hiện của OsNramp6 trên các giống lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. Phân tích mức độ và giá trị biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M. Nhận diện các microRNAs tiềm năng trong việc điều hòa OsNramp6.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .102 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐÃ CÔNG BỐ. 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 104 i x DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA: abscisic acid ACO: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxydase ARF: auxin responsive factor CDS: Cu/Fe dismustase CIPK10: CBL-interacting serine/threonine-protein kinase 10 DCL1: Dicer-like protein 1 Effector: phân tử tác động EIN: ethylene-insensitive Elicitor: phân tử kích thích. ET: ethylen ETI: effector-triggered immunity GA: gibberellic acid GRF: growth regulating factor Hpi: Hours post innoculation JA: Jasmonate acid Mature miRNA: miRNA trưởng thành MiRNA isoform: miRNA đồng dạng.
MITEs: Miniature Inverted-Repeat Transposable Elements NBS-LRR: nucleotide binding site – leucine rich repeats i xi NF-YA: nuclear transcription factor Y Nramp6: Natural resistance-associated macrophage protein 6 ORF: open reading frame PAMP: pathogen-associated molecular patterns pre-miRNA: precursor microRNA pri-miRNA: primary microRNA transcript PRRs: pattern regconition receptors PTI: pattern-triggered immunity RDR: RNA Dependent RNA Polymerase Receptor: phân tử thụ quan RISC: RNA induced gene silencing complex RNAi: RNA interference ROS: reactive oxygen species Rpm: rounds per minute SA: Salicylic acid SOD: superoxide dismutase SPL: SQUAMOSA promoter-binding protein-like transcription factor TE: transposable element Transcript variant: biến thể phiên mã UTR: untranslated region. i xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2. Danh sách giống lúa sử dụng trong thí nghiệm. Trình tự đoạn primer sử dụng trong phương pháp Nested RT-PCR.
Trình tự đoạn primer sử dụng trong phản ứng Real-time PCR (osa- miR7695). Danh sách trình tự các đoạn primer cho phản ứng Real time PCR để xác định sự biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6. Tỷ lệ phần trăm của vùng nhiễm trên lá lúa gây ra bởi M. oryzae ở 19 giống lúa, sử dụng phần mềm Assess v.
Kết quả đo tỷ lệ A(260/280) của các giống lúa thí nghiệm. Kết quả ly trích RNA tổng số và xử lý DNase I trên các giống lúa. Phân tích biểu đồ hộp giá trị biểu hiện của osa-miR7695 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm ở các thời điểm khác nhau (24 hpi, 48 hpi, 72 hpi). Kết quả phân tích đường cong ROC osa-miR7695 của nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm.
Kết quả phân tích biểu đồ hộp (box plot) mức độ biểu hiện của osa- miR160a giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với M. oryzae ở 24 hpi (hpi: hour post innoculation. Phân tích biểu đồ hộp (box plot) mức độ biểu hiện của osa-miR169a giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với M. Giá trị 2-ΔCt trong biểu đồ hộp (Box plot) thể hiện mức độ biểu hiện của OsNramp6.4 ở nhóm lúa chống chịu và nhóm lúa mẫn cảm với nấm M.
oryzae, thời điểm 24 hpi. Kết quả phân tích thống kê đường cong ROC của OsNramp6. Các miRNAs tiềm năng trong việc điều hòa biến thể phiên mã OsNramp6.98 i xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 1. Vòng đời gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn Magnaporthe spp.
bao gồm giai đoạn sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính và giai đoạn lây nhiễm (Dean và ctv. Quá trình gây bệnh của nấm gây bệnh đạo ôn (Were, 2018). Hệ thống phòng thủ PTI và ETI trên thực vật (Han và Jung, 2013). Quá trình sinh tổng hợp microRNA (Lee và ctv.
Trình tự và vị trí bắt cặp của 2 cặp primer (P1,P2) và (P3,P4) trong phản ứng Nested RT-PCR. Hình thái bào tử của hai mẫu nấm phân lập từ lá và cổ bông biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn. Sự hình thành các cấu trúc xâm nhiễm của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập được sau các thời gian quan sát khác nhau. Tính chuyên biệt của cặp primer Pot2 tranposon trong việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn và trong chẩn đoán bệnh đạo ôn trên đồng ruộng.
Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh tại Đồng Nai (LĐN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI. Kết quả BLAST trình tự DNA sản phẩm PCR bằng cặp primer Pot2 transposon của mẫu nấm gây bệnh đạo ôn phân lập từ lá lúa nhiễm bệnh đạo ôn (LN) và lá lúa biểu hiện triệu chứng bệnh đạo ôn trên cơ sở dữ liệu DNA của NCBI. Kết quả chủng bệnh nấm M. oryzae LBT2 trên lá của 10 giống lúa.
Trạng thái của cây lúa trước khi chủng bệnh ở hai giống thử nghiệm. Sự sinh trưởng của cây lúa ở 20 giống nghiên cứu sau 14 ngày trồng. Kết quả chủng bệnh nấm M. oryzae LBT2 trên lá của giống IR50404.
Kết quả điện di thử nghiệm trên giống lúa J-short (giống japonica). Kết quả điện di của gen đối chứng nội OsUbi1 trên các giống lúa. Kết quả điện di phản ứng PCR1 sử dụng cặp đoạn primer (P1,P2). Kết quả điện di phản ứng PCR2 sử dụng cặp primer (P3,P4).
Kết quả điện di xác định sự hiện diện của osa-miR7695 trên 19 giống lúa. Kết quả giải trình tự của LpJET1.2 chứa trình tự của phân tử precursor osa-miR7695. Kết quả cloning và giải trình tự của phân tử precursor osa-miR7695 (487bp). Kết quả phân tích BLAST (osa-miR7695) với dữ liệu miRBase.
Mức độ biểu hiện của osa-miR7695 trên một số giống lúa đại diện cho hai nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. Mức độ biểu hiện của microRNA osa-miR7695 ở 19 giống lúa trồng ở Việt Nam. Mức độ khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chống chịu và mẫn cảm (** tương đương P ≤ 0,01; hpi: giờ sau lây nhiễm). Biểu đồ hộp mô tả biểu hiện của osa-miR7695 ở 19 giống lúa chống chịu và mẫn cảm.
Mức độ khác biệt có ý nghĩa thống kê (**: P< 0,01; hpi: giờ sau lây nhiễm). Đường cong ROC (Receiver operator characteristic) thể hiện độ nhạy và độ đặc hiệu của giá trị 2-ΔCt (osa-miR7695) trong việc phân biệt nhóm giống lúa chống chịu và mẫn cảm.Diện tích bên dưới đường cong (AUC) là 0,899. Kết quả mức độ biểu hiện của osa-miR160a trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. Biểu đồ hộp (box plot) các giá trị biểu hiện của osa-miR160a trên 10 giống lúa thuộc hai nhóm chống chịu và mẫn cảm với M.
oryzae ở các thời điểm sau lây nhiễm khác nhau (24, 48 và 72 hpi). Dấu * chỉ mức độ khác biệt có ý ghĩa về mặt thống kê giữa 2 nhóm lúa (P < 0,05). Mức độ biểu hiện của osa-miR169a trên các giống lúa thuộc nhóm chống chịu và mẫn cảm với nấm gây bệnh đạo ôn, M. Biểu đồ hộp (box plot) các giá trị biểu hiện của osa-miR169a trên 12 giống lúa thuộc hai nhóm chống chịu và mẫn cảm với M.
oryzae ở các thời điểm sau nhiễm khác nhau (0, 24, 48 và 72 hpi). Dấu ** chỉ mức độ khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa 2 nhóm lúa (P ≤ 0,01). Biểu hiện của gen OsNramp6 ở 06 giống lúa tiêu biểu (03 giống lúa chống chịu, 03 giống lúa mẫn cảm). Cấu trúc gen của các biến thể phiên mã OsNramp6 và vị trí thiết kế primer realtime-PCR.
Mức độ biểu hiện của các biến thể phiên mã OsNramp6 giữa nhóm lúa chống chịu và mẫn cảm với nấm M. oryzae trồng ở Việt Nam, ở các thời điểm nhiễm nấm M.orzyae khác nhau. Mức độ ý nghĩa thống kê, P ≤ 0,01 (**), P ≤ 0,05 (*); hpi: giờ sau nhiễm. Biểu đồ hộp (Box plot) thể hiện mức độ biểu hiện của biến thể phiên mã OsNramp6.4 của 08 giống lúa trồng ở Việt Nam, thời điểm 24 hpi.
Đường cong ROC của OsNramp6. Diện tích dưới đường cong (AUC) của OsNramp6.4 tương ứng là 1 và 0,937 (P ≤ 0,05). Sơ đồ vị trí bắt cặp của 06 microRNA tiềm năng trên 03 biến thể phiên mã OsNramp6. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh đạo ôn là bệnh do nấm Magnaporthe oryzae gây ra, phân bố rộng khắp các vùng trồng lúa, đặc biệt là những nơi có khí hậu ôn hòa, độ ẩm cao, gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất lúa (Sharma và ctv.
Các nghiên cứu về tính kháng với nấm M.