Nghiên cứu đột biến mức độ biểu hiện gen egfr và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thw biểu mô tuyến ở phổi

Nghiên cứu đột biến gen EGFR và tình trạng methyl hóa gen liên quan ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến phổi, cung cấp thông tin quan trọng cho điều trị.

• Tác giả: Nguyễn Ngọc Quang
• Người hướng dẫn: PGS. Chu Hoàng Hà
• Trường học: Học viện Khoa học và Công nghệ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen EGFR và Methyl Hóa DNA Trong Ung Thư Phổi
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Ung thư phổi. Thực trạng ung thư phổi
• 0.2. Phân loại ung thư phổi
• 0.3. Các giai đoạn ung thư phổi
• 0.4. Ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 0.4.1. Đặc điểm ung thư biểu mô tuyến
• 0.4.2. Các phân típ mô bệnh học trong ung thư biểu mô tuyến
• 0.5. Biến đổi gen EGFR trong ung thư phổi
• 0.5.1. Cấu trúc và chức năng gen EGFR
• 0.5.2. Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi
• 0.5.3. Biểu hiện protein EGFR trong ung thư phổi
• 0.6. Methyl hóa DNA trong ung thư phổi
• 0.7. Methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MLH1, MGMT và RASSF1A trong ung thư phổi
• 0.8. Điều trị đích trong ung thư và ung thư phổi
• 0.8.1. Điều trị đích trong ung thư
• 0.8.2. Điều trị đích trong ung thư phổi
• 0.9. Phương pháp phân tích biến đổi phân tử trong ung thư phổi
• 0.9.1. Phương pháp phân tích đột biến gen trong ung thư phổi
• 0.9.2. Phương pháp phân tích methyl hóa DNA trong ung thư phổi
• 0.10. Nghiên cứu các dấu ấn phân tử trong ung thư phổi ở Việt Nam
• 1. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 1.1. Mẫu nghiên cứu
• 1.2. Thiết bị chính
• 1.3. Phương pháp nghiên cứu
• 1.3.1. Tách chiết DNA tổng số và xác định nồng độ DNA
• 1.3.2. Xử lý bisulfite với DNA tổng số
• 1.3.3. Phương pháp PCR
• 1.3.4. Phương pháp điện di
• 1.3.5. Phương pháp xác đinh đột biến gen EGFR
• 1.3.6. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch
• 1.3.7. Phương pháp tạo trình tự DNA methyl bằng enzyme M. Xử lý kết quả bằng thống kê sinh học
• 2. CHƢƠNG III. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu
• 2.1. Đột biến và biểu hiện gen EGFR
• 2.1.1. Đột biến gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.1.2. Biểu hiện protein EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.2. Tình trạng methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 2.2.1. Methyl hóa gen EGFR và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.2.2. Methyl hóa gen BRCA1 và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.2.3. Methyl hóa gen MGMT và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.2.4. Methyl hóa gen MLH1 và sự tương quan đặc điểm bệnh nhân
• 2.2.5. Methyl hóa gen RASSF1A và sự tương quan với đặc điểm bệnh nhân
• 2.3. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa một số gen liên quan đến ung thư tuyến của phổi
• 2.3.1. Tương quan giữa đột biến, biểu hiện và methyl hóa gen EGFR
• 2.3.2. Tương quan giữa đột biến và biểu hiện gen EGFR với sự methyl hóa các gen BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A
• 2.3.3. Tương quan về tình trạng methyl giữa các gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 4. CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm phân tử gen EGFR ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 4.1.1. Đột biến vùng hoạt hóa Tyrosine Kinase gen EGFR
• 4.1.2. Biểu hiện quá mức của protein EGFR
• 4.1.3. Methyl hóa vùng promoter EGFR
• 4.1.4. Tương quan giữa các đặc điểm phân tử gen EGFR
• 4.2. Methyl hóa gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A ở bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 4.2.1. Methyl hóa vùng promoter gen BRCA1
• 4.2.2. Methyl hóa vùng promoter gen MGMT
• 4.2.3. Methyl hóa vùng promoter gen MLH1
• 4.2.4. Methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A
• 4.2.5. Tương quan giữa những đặc điểm phân tử gen EGFR với sự methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A trong ung thư biểu mô tuyến của phổi
• 4.3. Đột biến EGFR với sự methyl hóa quá mức các gen ức chế khối u
• 4.4. Biểu hiện EGFR với sự methyl hóa các gen ức chế khối u
• 4.5. Sự methyl hóa đồng thời của một số gen liên quan đến ung thư biểu mô tuyến của phổi
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Đột Biến Gen EGFR Ung Thư Phổi

Ung thư phổi là một vấn đề sức khỏe toàn cầu với tỷ lệ mắc và tử vong cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2018, có tới 1,8 triệu người tử vong do ung thư phổi. Tại Việt Nam, ung thư phổi cũng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất. Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) chiếm phần lớn các trường hợp, trong đó ung thư biểu mô tuyến là loại thường gặp nhất. Việc nghiên cứu các dấu ấn sinh học như đột biến gen EGFR và methyl hóa DNA đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán, điều trị và tiên lượng bệnh. Luận án này tập trung vào việc nghiên cứu các đặc điểm phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của methyl hóa các gen ức chế khối u lên những biến đổi này trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi.

1.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu ung thư phổi hiện nay

Nghiên cứu ung thư phổi vô cùng quan trọng do tỷ lệ mắc và tử vong cao của bệnh. Việc hiểu rõ cơ chế bệnh sinh, đặc biệt là các biến đổi gen và biểu sinh, giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn. Nghiên cứu này tập trung vào đột biến gen EGFR và methyl hóa DNA, hai yếu tố quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC). Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư trên toàn cầu, làm nổi bật sự cấp thiết của việc nghiên cứu và tìm ra các phương pháp điều trị tiên tiến.

1.2. Ung thư biểu mô tuyến phổi và các đặc điểm nổi bật

Ung thư biểu mô tuyến là loại ung thư phổi phổ biến nhất, đặc biệt ở những người không hút thuốc, phụ nữ và người trẻ tuổi. Loại ung thư này có tiên lượng xấu và đáp ứng điều trị thấp, nhưng hiệu quả có thể được cải thiện nếu phát hiện sớm và sử dụng các phác đồ điều trị hiện đại. Nghiên cứu này tập trung vào ung thư biểu mô tuyến do sự phổ biến và tính chất phức tạp của nó. Đột biến gen EGFR thường gặp ở loại ung thư này và là mục tiêu của các thuốc điều trị nhắm đích. Việc nghiên cứu các biến đổi di truyền và biểu sinh ở ung thư biểu mô tuyến có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển các chiến lược điều trị cá nhân hóa.

II. Thách Thức Điều Trị Ung Thư Phổi và Kháng Thuốc EGFR TKIs

Mặc dù các thuốc điều trị nhắm đích dựa trên đột biến gen EGFR (TKIs) đã cải thiện đáng kể kết quả điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi, tình trạng kháng thuốc EGFR vẫn là một thách thức lớn. Các cơ chế kháng thuốc TKI rất phức tạp và bao gồm cả các đột biến thứ phát và các thay đổi biểu sinh như methyl hóa DNA. Việc nghiên cứu các cơ chế này là rất quan trọng để phát triển các chiến lược điều trị mới nhằm vượt qua tình trạng kháng thuốc và cải thiện thời gian sống thêm cho bệnh nhân. Một nghiên cứu gần đây cho thấy sự kết hợp giữa thuốc TKI và chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKI.

2.1. Cơ chế kháng thuốc TKI và tầm quan trọng của nghiên cứu

Kháng thuốc là một vấn đề lớn trong điều trị ung thư phổi bằng thuốc TKI. Các cơ chế kháng thuốc rất đa dạng, bao gồm đột biến thứ phát, kích hoạt các con đường tín hiệu khác và thay đổi biểu sinh như methyl hóa DNA. Nghiên cứu cơ chế kháng thuốc là cần thiết để phát triển các chiến lược điều trị mới, như sử dụng kết hợp các loại thuốc hoặc nhắm vào các con đường tín hiệu thay thế. Theo nhiều nghiên cứu, kháng thuốc TKI thường xuất hiện sau một thời gian điều trị, làm giảm hiệu quả của thuốc và rút ngắn thời gian sống thêm của bệnh nhân. Việc nghiên cứu này giúp tìm ra những giải pháp đột phá để khắc phục tình trạng kháng thuốc.

2.2. Vai trò của methyl hóa DNA trong kháng thuốc EGFR

Methyl hóa DNA là một cơ chế biểu sinh quan trọng có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen liên quan đến kháng thuốc EGFR. Methyl hóa vùng promoter của các gen ức chế khối u có thể làm bất hoạt các gen này, góp phần vào sự phát triển của ung thư và tình trạng kháng thuốc. Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá vai trò của methyl hóa DNA trong kháng thuốc EGFR và xác định các mục tiêu điều trị mới. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng methyl hóa có thể làm giảm sự biểu hiện của các gen quan trọng trong quá trình điều trị, từ đó làm giảm hiệu quả của thuốc EGFR-TKI.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đột Biến EGFR và Methyl Hóa DNA

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân tích phân tử hiện đại để xác định đột biến gen EGFR và tình trạng methyl hóa DNA trên mẫu bệnh phẩm ung thư phổi. Các phương pháp này bao gồm giải trình tự gen (sequencing) để phát hiện đột biến EGFR, PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) để xác định tình trạng methyl hóa của các gen như EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp thông tin quan trọng về các đặc điểm phân tử của ung thư phổi và mối liên quan giữa đột biến EGFR và methyl hóa DNA. Các mẫu nghiên cứu bao gồm mẫu bệnh phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề, thu thập từ bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến.

3.1. Kỹ thuật giải trình tự gen Sequencing phát hiện đột biến EGFR

Giải trình tự gen là một kỹ thuật mạnh mẽ để xác định đột biến gen EGFR. Kỹ thuật này cho phép xác định chính xác vị trí và loại đột biến trên gen EGFR, giúp lựa chọn các thuốc TKI phù hợp cho từng bệnh nhân. Trong nghiên cứu này, giải trình tự gen được sử dụng để sàng lọc các đột biến phổ biến như đột biến exon 19 deletion và đột biến L858R. Kết quả giải trình tự gen cung cấp thông tin quan trọng cho việc đưa ra quyết định điều trị. Việc sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen giúp phân tích chính xác và toàn diện đột biến gen trên mẫu bệnh phẩm.

3.2. PCR đặc hiệu methyl MS PCR và phân tích Methyl hóa DNA

PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) là một kỹ thuật nhạy cảm và đặc hiệu để xác định tình trạng methyl hóa DNA. Kỹ thuật này dựa trên việc xử lý DNA bằng bisulfite, làm chuyển đổi cytosine thành uracil, trong khi 5-methylcytosine thì không. Sau đó, PCR được thực hiện bằng các cặp mồi đặc hiệu cho DNA đã được methyl hóa hoặc chưa được methyl hóa. Kết quả MS-PCR cho phép xác định tỷ lệ methyl hóa của các gen mục tiêu. Trong nghiên cứu này, MS-PCR được sử dụng để đánh giá tình trạng methyl hóa của các gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. Kỹ thuật này giúp đánh giá sự khác biệt về methyl hóa DNA giữa các mẫu bệnh phẩm.

3.3. Nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định biểu hiện EGFR

Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện protein EGFR trong mô ung thư phổi. Kỹ thuật này sử dụng các kháng thể đặc hiệu để nhận diện protein EGFR và đánh giá mức độ biểu hiện của nó trên tế bào ung thư. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch cung cấp thông tin về sự biểu hiện của protein EGFR, giúp đánh giá sự tương quan giữa đột biến gen, methyl hóa DNA và biểu hiện protein. Việc xác định chính xác mức độ biểu hiện protein EGFR giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp và hiệu quả nhất.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Liên Quan Giữa Đột Biến EGFR và Methyl Hóa

Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối liên quan đáng kể giữa đột biến gen EGFR và tình trạng methyl hóa DNA của một số gen liên quan đến ung thư phổi. Cụ thể, methyl hóa vùng promoter của gen EGFR có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen này và có thể liên quan đến tình trạng kháng thuốc EGFR. Ngoài ra, methyl hóa các gen ức chế khối u như BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A cũng được phát hiện trong các mẫu bệnh phẩm ung thư phổi và có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và tiến triển của bệnh. Các kết quả này nhấn mạnh vai trò quan trọng của các thay đổi biểu sinh trong ung thư phổi.

4.1. Tương quan giữa đột biến EGFR và methyl hóa gen EGFR

Nghiên cứu cho thấy có một tương quan phức tạp giữa đột biến EGFR và methyl hóa gen EGFR. Methyl hóa vùng promoter của gen EGFR có thể làm giảm sự biểu hiện của gen này, ngay cả khi có đột biến hoạt hóa. Điều này có thể ảnh hưởng đến đáp ứng điều trị với thuốc TKI. Ngược lại, đột biến EGFR có thể ảnh hưởng đến tình trạng methyl hóa của gen EGFR thông qua các cơ chế chưa được hiểu rõ. Việc hiểu rõ mối tương quan này có thể giúp phát triển các chiến lược điều trị cá nhân hóa hơn. Các nhà nghiên cứu cần tiếp tục điều tra để hiểu rõ hơn về vai trò của methyl hóa trong quá trình này.

4.2. Tác động của methyl hóa các gen ức chế khối u

Methyl hóa các gen ức chế khối u như BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A có thể làm bất hoạt các gen này, góp phần vào sự phát triển của ung thư phổi. Methyl hóa các gen này có thể ảnh hưởng đến quá trình sửa chữa DNA, kiểm soát chu kỳ tế bào và apoptosis, dẫn đến sự tích tụ các đột biến và sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào ung thư. Nghiên cứu này cho thấy tình trạng methyl hóa của các gen này có thể là một dấu ấn sinh học quan trọng trong ung thư phổi. Việc phát hiện tình trạng methyl hóa của các gen này có thể giúp cải thiện việc tiên lượng ung thư phổi.

V. Ứng Dụng Điều Trị Đột Biến EGFR và Methyl Hóa Ung Thư Phổi

Kết quả nghiên cứu có thể có những ứng dụng quan trọng trong việc cải thiện điều trị ung thư phổi. Việc xác định đột biến gen EGFR giúp lựa chọn các thuốc TKI phù hợp cho bệnh nhân. Đánh giá tình trạng methyl hóa DNA có thể giúp dự đoán đáp ứng điều trị với thuốc TKI và xác định các bệnh nhân có thể hưởng lợi từ các phương pháp điều trị biểu sinh. Ngoài ra, việc phát triển các thuốc nhắm mục tiêu vào các enzyme methyl hóa DNA (DNMTs) có thể là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư phổi. Kết quả này cũng cung cấp thông tin hữu ích cho việc phát triển các chiến lược điều trị kết hợp.

5.1. Hướng dẫn lựa chọn thuốc TKI dựa trên đột biến EGFR

Việc xác định chính xác đột biến gen EGFR là rất quan trọng để lựa chọn các thuốc TKI phù hợp. Các đột biến phổ biến như đột biến exon 19 deletion và đột biến L858R thường đáp ứng tốt với các thuốc TKI thế hệ thứ nhất và thứ hai. Tuy nhiên, các đột biến hiếm gặp hơn có thể cần các thuốc TKI đặc hiệu hơn hoặc các phương pháp điều trị khác. Nghiên cứu này cung cấp thông tin chi tiết về các đột biến EGFR được phát hiện và sự tương quan của chúng với đáp ứng điều trị. Từ đó, việc điều trị bệnh nhân sẽ được cá nhân hóa hơn và đem lại kết quả tốt hơn.

5.2. Điều trị biểu sinh và nhắm mục tiêu enzyme methyl hóa DNA

Các thuốc nhắm mục tiêu vào các enzyme methyl hóa DNA (DNMTs) có thể đảo ngược tình trạng methyl hóa của các gen ức chế khối u và phục hồi chức năng của chúng. Các thuốc này có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các thuốc TKI để cải thiện đáp ứng điều trị. Hiện nay, một số thuốc ức chế DNMT đã được phê duyệt để điều trị các bệnh ung thư khác và đang được nghiên cứu trong ung thư phổi. Phương pháp điều trị biểu sinh có thể là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư phổi. Những nghiên cứu lâm sàng đang được tiến hành để đánh giá hiệu quả của việc sử dụng các thuốc ức chế DNMT trong điều trị ung thư phổi.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tương Lai Về Ung Thư Phổi

Nghiên cứu này đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc hơn về vai trò của đột biến gen EGFR và methyl hóa DNA trong ung thư phổi. Kết quả nghiên cứu nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân tích phân tử toàn diện để lựa chọn các phương pháp điều trị phù hợp và dự đoán đáp ứng điều trị. Các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc khám phá các cơ chế kháng thuốc EGFR và phát triển các chiến lược điều trị mới nhằm vượt qua tình trạng này. Việc nghiên cứu sâu hơn về các thay đổi biểu sinh và tương tác của chúng với các biến đổi di truyền cũng là rất quan trọng để cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi. Cần thiết có thêm các nghiên cứu lâm sàng quy mô lớn để xác nhận các kết quả này.

6.1. Hướng nghiên cứu về cơ chế kháng thuốc EGFR

Các nghiên cứu tương lai nên tập trung vào việc khám phá các cơ chế kháng thuốc EGFR và phát triển các chiến lược điều trị mới nhằm vượt qua tình trạng này. Điều này bao gồm việc xác định các đột biến thứ phát, kích hoạt các con đường tín hiệu thay thế và thay đổi biểu sinh có liên quan đến kháng thuốc. Việc phát triển các mô hình tế bào và mô hình động vật ung thư phổi kháng thuốc EGFR cũng là rất quan trọng để thử nghiệm các phương pháp điều trị mới. Các nghiên cứu này sẽ giúp tìm ra các giải pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân ung thư phổi.

6.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu biểu sinh và di truyền

Việc nghiên cứu sâu hơn về các thay đổi biểu sinh và tương tác của chúng với các biến đổi di truyền là rất quan trọng để cải thiện kết quả điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi. Điều này bao gồm việc xác định các dấu ấn biểu sinh có thể dự đoán đáp ứng điều trị, phát triển các thuốc nhắm mục tiêu vào các enzyme điều chỉnh biểu sinh và thiết kế các chiến lược điều trị kết hợp nhắm vào cả biến đổi di truyền và biểu sinh. Sự kết hợp của cả hai lĩnh vực nghiên cứu này có thể mang lại những đột phá lớn trong việc điều trị ung thư phổi. Nghiên cứu về biểu sinh có thể giúp chúng ta hiểu rõ hơn về các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư phổi.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư phổi là bệnh lý ác tính có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018), toàn cầu ghi nhận khoảng 2,1 triệu ca mắc mới và 1,8 triệu ca tử vong do ung thư phổi. Tại Việt Nam, thống kê cùng năm ghi nhận 160.000 trường hợp mắc mới và 115.000 ca tử vong do các bệnh ung thư nói chung, trong đó ung thư phổi đứng hàng thứ hai về tỷ lệ mắc ở nam giới và thứ ba ở nữ giới, đồng thời có tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ hai ở cả hai giới (sau ung thư gan).

Về mặt giải phẫu bệnh, ung thư phổi được chia thành hai nhóm chính: ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC, chiếm 10–15%) và ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC, chiếm 85–90%). Trong nhóm NSCLC, ung thư biểu mô tuyến (Adenocarcinoma) là phân típ mô bệnh học phổ biến nhất (chiếm khoảng 40%), xuất hiện không chỉ ở người hút thuốc mà còn chiếm tỷ lệ đáng kể ở người không hút thuốc, nữ giới và người trẻ tuổi. Tiên lượng của ung thư biểu mô tuyến nhìn chung còn thấp, với tỷ lệ sống thêm sau 5 năm chỉ đạt khoảng 10–15%.

Sự phát triển của liệu pháp điều trị nhắm trúng đích sử dụng các chất ức chế Tyrosine Kinase (TKIs) dựa trên tình trạng đột biến gen thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) đã đem lại cải thiện rõ rệt cho bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến. Bên cạnh đột biến soma, mức độ biểu hiện protein EGFR trên màng tế bào và sự biến đổi di truyền ngoại gen (epigenetics) — cụ thể là hiện tượng methyl hóa DNA tại vùng promoter của gen EGFR cùng các gen ức chế khối u quan trọng khác (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A) — đóng vai trò điều hòa biểu hiện gen, thúc đẩy tiến triển khối u và tác động đến đáp ứng điều trị.

Khoảng trống nghiên cứu thực tế tại Việt Nam cho thấy các khảo sát trước đây chủ yếu tập trung vào việc xác định đơn lẻ các đột biến gen EGFR để phục vụ chỉ định thuốc TKIs, chưa có công trình nào đánh giá một cách toàn diện đồng thời cả ba mức độ biến đổi phân tử của gen EGFR (đột biến, mức độ biểu hiện protein và tình trạng methyl hóa promoter), cũng như khảo sát mối liên hệ giữa các biến đổi này với sự methyl hóa các gen ức chế khối u liên quan trên cùng một nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án được xác định gồm hai nội dung chính:

1. Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
2. Đánh giá tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột biến và biểu hiện protein EGFR.

Nội dung nghiên cứu triển khai:

1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh; thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi và mẫu mô phổi liền kề.
2. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR; phân tích sự liên quan giữa các đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học của bệnh nhân với đột biến và biểu hiện gen EGFR.
3. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A; khảo sát sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm bệnh nhân.
4. Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện protein EGFR với tình trạng methyl hóa các gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng: Bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
• Mẫu nghiên cứu: Khối mô cố định trong formalin và đúc khối paraffin (FFPE) gồm mô khối u và mô phổi lành liền kề.
• Địa điểm thực hiện: Bệnh viện K (Trung tâm Giải phẫu bệnh & Sinh học phân tử) và Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học; Học viện Khoa học và Công nghệ).

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến ung thư biểu mô tuyến ở phổi, các biến đổi phân tử của gen EGFR và cơ chế di truyền ngoại gen:

1. Dịch tễ học, phân loại và giai đoạn ung thư phổi:

   • Dẫn liệu dịch tễ từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018) và Hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ (ACS, 2015, 2017) [35, 102] về gánh nặng bệnh tật toàn cầu và tỷ lệ sống thêm theo phân loại mô bệnh học.
   • Hệ thống phân loại TNM và giai đoạn bệnh theo Travis và cs. (2015), Goldstraw và cs. (2016) [3, 84], nêu rõ đặc điểm vi thể các phân típ: tổn thương lepidic, nhú (papillary), vi nhú (micropapillary), chùm nang (acinar), dạng đặc (solid), nhầy xâm nhập (invasive mucinous), thể keo (colloid) và bào thai (fetal adenocarcinoma).
   • Quá trình phát sinh từ tăng sản dạng tuyến không điển hình (AAH), ung thư biểu mô tuyến tại chỗ (AIS/BAC), ung thư xâm lấn tối thiểu (MIA) đến ung thư xâm nhập theo Yatabe và cs. (2011) [59].

2. Đặc điểm phân tử gen EGFR và điều trị nhắm trúng đích:

   • Cấu trúc thụ thể Tyrosine Kinase màng tế bào kích thước 170 kDa, gen gồm 28 exon định vị tại 7p12, điều hòa hai trục tín hiệu PI3K/AKT/mTOR và RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 [12, 22, 96].
   • Các dạng đột biến nhạy cảm thuốc TKIs tại vùng hoạt hóa tyrosine kinase (exon 18–21): đột biến mất đoạn trên exon 19 (Del E746–A750, Del L747–T751inS, Del L747–T753inS) và đột biến điểm thay thế L858R trên exon 21 chiếm khoảng 90% tổng số đột biến kích hoạt [85, 88, 127].
   • Tần suất đột biến khác biệt theo chủng tộc: người phương Tây chỉ đạt 10–15% [8], trong khi ở quần thể người châu Á đạt 30–60%, đặc biệt phổ biến ở nữ giới và người không hút thuốc [70, 105].
   • Hiệu quả lâm sàng của các thuốc TKIs thế hệ một (Gefitinib, Erlotinib), thế hệ hai và cơ chế kháng thuốc thứ cấp do đột biến T790M trên exon 20 dẫn đến sự phát triển của các thuốc thế hệ ba (Osimertinib, Rociletinib) [55, 68, 94, 131, 158].
   • Đánh giá mức độ biểu hiện protein EGFR qua nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) và mối liên quan với giai đoạn bệnh cũng như tiên lượng khối u [80, 122, 150].

3. Hiện tượng methyl hóa DNA và các gen ức chế khối u:

   • Hoạt động của hệ enzyme DNA methyltransferase gồm DNMT1 duy trì methyl hóa sợi bổ sung, DNMT3a và DNMT3b thực hiện methyl hóa vị trí mới (de novo) tại các đảo CpG vùng promoter [43, 53, 115, 117].
   • Methyl hóa promoter gen EGFR (đoạn –300 đến –100 tại đầu 5' không dịch mã) làm kìm hãm phiên mã, có sự dao động tần suất từ 11% ở người Mỹ [95] lên tới 30–40% ở bệnh nhân Trung Quốc [77, 106, 120].
   • Gen BRCA1 (17q21, 24 exon, ~100 kb): tham gia sửa chữa đứt gãy sợi đôi DNA và kiểm soát chu kỳ tế bào qua tương tác với p53, GADD45, phức hợp SWI/SNF; methyl hóa đảo CpG (vị trí –567 đến +44) dao động từ 4% ở phương Tây [89] đến 27–30% ở châu Á [40, 73, 116].
   • Gen MLH1 (3p22.2, 19 exon, ~57 kb): thuộc phức hợp sửa chữa bắt cặp sai (MMR) cùng MSH2, PMS2, MSH3, MSH6; methyl hóa promoter được ghi nhận từ 0% ở châu Âu [137] đến 35–56% ở Trung Quốc [23, 78, 123, 148].
   • Gen MGMT (10q26, 5 exon, 4 intron, >300 kb, protein 207 axit amin): sửa chữa sai hỏng DNA bằng cách loại bỏ nhóm alkyl tại vị trí O6-guanine; methyl hóa promoter dao động từ 8–50% tùy quần thể và liên quan đến tiên lượng bệnh [14, 28, 69, 83, 113, 151].
   • Gen RASSF1A (3p21.3, ~11 kb, 8 exon, đồng phân polypeptide 340 axit amin): điều hòa điểm kiểm soát G1/S qua tương tác với Rb, MST1 và ức chế YAP; methyl hóa đảo CpG–A (48 vị trí CpG) chiếm tỷ lệ 20–80% trong ung thư phổi và có liên quan chặt chẽ với tiền sử hút thuốc lá [2, 21, 26, 74, 87, 146, 153].

Vị trí của luận án: Luận án là công trình nghiên cứu chuyên sâu, kết hợp phân tích đồng thời đột biến gen, biểu hiện protein và tình trạng methyl hóa promoter của EGFR, đồng thời mở rộng khảo sát 4 gen ức chế khối u then chốt (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A) trên cùng một tập mẫu bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tại Việt Nam.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

Quá trình sinh ung thư biểu mô tuyến ở phổi là sự tích lũy song song các biến đổi di truyền (đột biến soma vùng kinase của EGFR) và các biến đổi di truyền ngoại gen (sự methyl hóa quá mức tại đảo CpG vùng promoter của các gen ức chế khối u).

• Sự gắn nhóm methyl (-CH3) vào vị trí C5 của cytosine trong phức hợp dinucleotide CpG vùng promoter làm thay đổi cấu trúc chất nhiễm sắc từ dạng mở (euchromatin) sang dạng đóng (heterochromatin), ngăn cản sự tiếp cận của các yếu tố phiên mã, dẫn đến bất hoạt gen.
• Tình trạng methyl hóa promoter gen EGFR điều hòa âm tính mức độ phiên mã và tổng hợp protein EGFR trên màng tế bào.
• Sự bất hoạt do methyl hóa promoter của các gen BRCA1, MLH1, MGMT làm suy giảm khả năng sửa chữa sai hỏng DNA, trong khi methyl hóa RASSF1A làm mất kiểm soát điểm chuyển tiếp chu kỳ tế bào G1/S và tăng cường khả năng di căn.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

                             [Mẫu bệnh phẩm FFPE]
      [Tách chiết DNA]                             [Cắt lát mô bệnh học]
[ARMS-PCR]    [Xử lý Bisulfite]
               [Kỹ thuật MS-PCR]
         (Cặp mồi M & U cho 5 gen:
      EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A)

1. Xử lý mẫu và tách chiết DNA:

   • Sử dụng mô đúc khối paraffin (FFPE) từ bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến. Mẫu được giải phẫu bệnh học kiểm tra đảm bảo tỷ lệ tế bào u.
   • Tách chiết DNA tổng số, định lượng nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ số hấp thụ quang phổ A260/A280.

2. Kỹ thuật xác định đột biến gen EGFR:

   • Sử dụng phương pháp Real-time PCR kết hợp mồi Scorpion và hệ thống ARMS (Amplification Refractory Mutation System) để phát hiện các đột biến điểm và mất đoạn trên các exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR.

3. Phương pháp xử lý Bisulfite và MS-PCR:

   • Xử lý DNA tổng số bằng sodium bisulfite để chuyển hóa chọn lọc các gốc cytosine không bị methyl hóa thành uracil, trong khi các gốc 5-methylcytosine được giữ nguyên.
   • Chuẩn bị mẫu chứng dương methyl hóa in vitro bằng cách xử lý DNA với enzyme M.SssI CpG methyltransferase.
   • Thiết kế và tối ưu hóa các cặp mồi đặc hiệu cho trạng thái methyl hóa (M - Methylated) và không methyl hóa (U - Unmethylated) cho 5 gen (EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A).
   • Tiến hành phản ứng PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) và phân tích sản phẩm khuếch đại bằng kỹ thuật điện di trên gel.

4. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC):

   • Cắt lát mô paraffin, khử sáp, phục hồi kháng nguyên và ủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng EGFR.
   • Phát hiện tín hiệu bằng phức hợp kháng thể thứ cấp gắn Horseradish Peroxidase (HRP) và cơ chất 3,3'-diaminobenzidine (DAB), nhuộm đối màu nhân bằng Hematoxylin.
   • Đánh giá mức độ biểu hiện protein EGFR theo 4 mức: mức 0 (âm tính), 1+ (dương tính yếu), 2+ (dương tính vừa), 3+ (dương tính mạnh/biểu hiện quá mức).

5. Xử lý số liệu thống kê sinh học:

   • Phân tích tương quan giữa các biến số phân tử (đột biến, mức độ biểu hiện protein, trạng thái methyl hóa của từng gen và tổ hợp các gen) với các đặc điểm lâm sàng, giải phẫu bệnh bằng các kiểm định thống kê (Chi-square test, Fisher's exact test).

Gen nghiên cứu	Vị trí nhiễm sắc thể	Kích thước / Cấu trúc	Chức năng sinh học chính	Vị trí khảo sát methyl hóa
EGFR	7p12	28 exon, mã hóa protein 170 kDa	Thụ thể điều hòa tăng sinh tế bào (trục PI3K/AKT, MAPK)	Vùng promoter (–300 đến –100)
BRCA1	17q21	24 exon, ~100 kb	Sửa chữa đứt gãy DNA sợi đôi, tương tác p53, GADD45	Đảo CpG vùng promoter (–567 đến +44)
MGMT	10q26	5 exon, >300 kb, protein 207 aa	Sửa chữa alkyl hóa DNA (loại bỏ nhóm alkyl tại O6-guanine)	Đảo CpG vùng promoter
MLH1	3p22.2	19 exon, ~57 kb, protein 756 aa	Sửa chữa ghép đôi sai DNA (hệ thống mismatch repair - MMR)	Đảo CpG vùng promoter
RASSF1A	3p21.3	8 exon, mã hóa polypeptide 340 aa	Ức chế khối u, kiểm soát G1/S qua Rb, điều hòa apoptosis qua MST1	Đảo CpG–A (48 vị trí CpG ở promoter và exon 1)

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Trình bày tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ thực trạng bệnh ung thư phổi, đặc biệt là ung thư biểu mô tuyến tại Việt Nam. Nêu rõ mục tiêu xác định toàn diện các biến đổi phân tử của gen EGFR và tình trạng methyl hóa các gen ức chế khối u liên quan (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A), đặt nền tảng cho việc tối ưu hóa chẩn đoán và điều trị trúng đích.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 tổng thuật chi tiết toàn bộ các cơ sở lý thuyết và thực tiễn:

• Dịch tễ học ung thư phổi toàn cầu và Việt Nam, mô tả chi tiết các phân loại mô bệnh học của ung thư phổi không tế bào nhỏ theo WHO và hệ thống phân loại giai đoạn TNM.
• Cơ chế phân tử của gen EGFR, cấu trúc protein thụ thể tyrosine kinase, các con đường truyền tín hiệu nội bào qua PI3K/AKT/mTOR và RAS/RAF/MEK/ERK.
• Phổ đột biến soma của EGFR trên các exon 18–21, độ nhạy cảm của các đột biến exon 19 del và L858R đối với thuốc ức chế TKIs, hiện tượng biểu hiện quá mức protein EGFR trên màng tế bào.
• Cơ chế methyl hóa DNA trong tế bào bình thường và tế bào ung thư, vai trò của các enzyme DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, DNMT3L.
• Đặc điểm cấu trúc, chức năng sinh học và tình trạng methyl hóa promoter của từng gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A trong các khối u ác tính.
• Tổng quan về các liệu pháp điều trị đích trong ung thư phổi (kháng thể đơn dòng, thuốc ức chế phân tử nhỏ TKIs thế hệ một, hai, ba) và các nguyên lý kỹ thuật phân tích phân tử (Sanger sequencing, ARMS-PCR, Real-time PCR, lai tại chỗ huỳnh quang FISH, giải trình tự bisulfite và kỹ thuật MS-PCR).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình thực nghiệm và vật liệu nghiên cứu:

• Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân và thu thập mẫu mô ung thư biểu mô tuyến cố định paraffin (FFPE) cùng mẫu mô phổi lành liền kề.
• Danh mục hóa chất, sinh phẩm, kit tách chiết và hệ thống thiết bị phân tích sinh học phân tử.
• Bảng trình tự các cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong phản ứng MS-PCR cho từng gen (trạng thái methyl hóa M và không methyl hóa U).
• Quy trình xử lý biến đổi bisulfite trên DNA tổng số, quy trình tạo mẫu chứng dương methyl hóa in vitro bằng enzyme methyltransferase M.SssI.
• Thiết lập chu trình nhiệt và thành phần phản ứng cho kỹ thuật ARMS Real-time PCR phát hiện đột biến EGFR và MS-PCR xác định methyl hóa.
• Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch xác định mức độ biểu hiện protein EGFR trên lát cắt mô học và thang điểm đánh giá (0 đến 3+).
• Phương pháp quản lý dữ liệu và các thuật toán thống kê sinh học đánh giá mối tương quan giữa các biến số nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các số liệu thực nghiệm thu được từ tập mẫu nghiên cứu:

• Đặc điểm nhóm bệnh nhân: Phân bố về tuổi, giới tính, tiền sử hút thuốc, giai đoạn bệnh và các phân típ mô bệnh học theo phân loại quốc tế.
• Đặc điểm đột biến gen EGFR: Tỷ lệ các dạng đột biến phát hiện trên các exon 18, 19, 20, 21; xác định các đột biến phổ biến nhất (mất đoạn exon 19 và đột biến điểm L858R exon 21); phân tích mối tương quan giữa đột biến EGFR với giới tính, tiền sử hút thuốc lá và đặc điểm mô bệnh học.
• Mức độ biểu hiện protein EGFR qua IHC: Tỷ lệ các mức độ biểu hiện từ 0, 1+, 2+ đến 3+ (biểu hiện quá mức) và mối liên quan với giai đoạn lâm sàng.
• Tình trạng methyl hóa từng gen:
  • Tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen EGFR trên mô ung thư và so sánh với mô phổi lành liền kề.
  • Tỷ lệ methyl hóa các gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A và sự phân bố theo đặc điểm bệnh nhân (tuổi, giới, tình trạng hút thuốc, giai đoạn tiến triển khối u).
• Tương quan giữa các biến đổi phân tử:
  • Tương quan giữa đột biến gen EGFR, mức độ methyl hóa promoter EGFR và mức độ biểu hiện protein EGFR trên màng tế bào.
  • Tương quan giữa đột biến và biểu hiện protein EGFR với tình trạng methyl hóa của 4 gen ức chế khối u (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A).
  • Khảo sát hiện tượng methyl hóa đồng thời (co-methylation) giữa các gen ức chế khối u trong ung thư biểu mô tuyến.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện luận và đối chiếu các kết quả thu được với các công bố khoa học quốc tế và trong nước:

• Phân tích ý nghĩa của tỷ lệ đột biến vùng kinase EGFR ở bệnh nhân Việt Nam, so sánh với tần suất ở các quần thể Đông Á và phương Tây; lý giải tính ưu thế của đột biến ở phụ nữ và người không hút thuốc.
• Biện luận về cơ chế điều hòa biểu hiện protein EGFR: mối liên hệ giữa hiện tượng methyl hóa promoter EGFR với sự suy giảm biểu hiện protein bề mặt tế bào.
• Bàn luận sâu về vai trò của methyl hóa promoter các gen ức chế khối u:
  • BRCA1: Tác động của việc bất hoạt con đường sửa chữa tái tổ hợp tương đồng đến tính không ổn định di truyền của khối u biểu mô tuyến.
  • MGMT: Ý nghĩa của sự thiếu hụt enzyme sửa chữa alkyl hóa trong tích lũy đột biến gen và giá trị tiên lượng.
  • MLH1: Mối liên quan giữa methyl hóa promoter và hiện tượng mất ổn định vi vệ tinh trong ung thư biểu mô tuyến.
  • RASSF1A: Mối liên hệ chặt chẽ giữa methyl hóa promoter với tiền sử hút thuốc lá, vai trò ức chế chu kỳ tế bào và con đường apoptotic qua MST1/YAP.
• Bàn luận về mối quan hệ giữa các biến đổi di truyền (đột biến EGFR) và di truyền ngoại gen (methyl hóa BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A), làm rõ sự methyl hóa đồng thời nhiều gen và xu hướng tiến triển ác tính của khối u.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Mô tả toàn diện các đặc điểm phân tử của gen EGFR: Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam xác định đồng thời cả ba đặc điểm phân tử then chốt của gen EGFR bao gồm: tỷ lệ đột biến soma vùng tyrosine kinase, mức độ methyl hóa vùng promoter và mức độ biểu hiện protein EGFR trên cùng một nhóm bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi.
2. Đánh giá tình trạng di truyền ngoại gen của các gen ức chế khối u: Xác định được tỷ lệ methyl hóa vùng promoter của 4 gen ức chế khối u quan trọng (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A) trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến tại Việt Nam, cung cấp bức tranh hoàn chỉnh về biến đổi ngoại gen trong loại mô bệnh học này.
3. Phát hiện các mối liên quan phân tử có ý nghĩa:
   • Chỉ ra được mối liên quan giữa hiện tượng methyl hóa gen RASSF1A với sự methyl hóa các gen BRCA1 và MLH1.
   • Làm rõ sự khác nhau giữa tình trạng methyl hóa vùng promoter gen EGFR và BRCA1 với mức độ biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến ở phổi.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Đề xuất áp dụng quy trình kết hợp xét nghiệm đột biến gen EGFR cùng với đánh giá biểu hiện protein qua IHC và khảo sát các dấu ấn methyl hóa promoter nhằm nâng cao độ chính xác trong tiên lượng và cá thể hóa điều trị.
• Nghiên cứu hướng tới việc ứng dụng kết hợp các thuốc ức chế Tyrosine Kinase (TKIs) với các thuốc khử methyl hóa DNA (chất ức chế DNMT) nhằm phục hồi biểu hiện các gen ức chế khối u và cải thiện hiệu quả điều trị trên các dòng tế bào ung thư phổi.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế kỹ thuật: Phương pháp PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) cho phép xác định định tính trạng thái methyl hóa tại các vị trí bắt cặp của mồi, nhưng không cung cấp mức độ methyl hóa định lượng chi tiết cho từng nucleotide CpG nằm xen kẽ giữa các cặp mồi như phương pháp giải trình tự bisulfite.
• Hạn chế về dữ liệu lâm sàng: Nghiên cứu tập trung trên mẫu mô sinh thiết/phẫu thuật cố định paraffin (FFPE); cần mở rộng đánh giá dấu ấn methyl hóa DNA tự do trong máu (cell-free DNA/ctDNA) để phát triển kỹ thuật sinh thiết lỏng không xâm lấn.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Mở rộng theo dõi dọc đáp ứng lâm sàng, thời gian sống thêm không tiến triển (PFS) và thời gian sống thêm toàn bộ (OS) của bệnh nhân điều trị TKIs có phối hợp hoặc không phối hợp với các liệu pháp can thiệp di truyền ngoại gen.

---

Giá trị tham khảo

• Đối với nghiên cứu sinh, học viên và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Sinh học phân tử: Luận án cung cấp khung phương pháp luận chi tiết và chuẩn hóa về kỹ thuật xử lý bisulfite, thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng MS-PCR, quy trình phát hiện đột biến gen và phân tích hóa mô miễn dịch.
• Đối với các bác sĩ chuyên khoa Ung bướu và Giải phẫu bệnh: Cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử về tần suất đột biến EGFR và tình trạng bất hoạt các gen ức chế khối u do methyl hóa ở bệnh nhân Việt Nam, hỗ trợ lựa chọn phác đồ điều trị nhắm trúng đích và tiên lượng diễn tiến bệnh.
• Đối với các nhà hoạch định chính sách y tế và nghiên cứu dược phẩm: Đóng góp dữ liệu dịch tễ học phân tử phục vụ đánh giá hiệu quả chi phí trong việc đưa các xét nghiệm sinh học phân tử và thuốc điều trị đích vào danh mục bảo hiểm y tế.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Những dạng đột biến gen EGFR nào chiếm tỷ lệ cao nhất trong ung thư biểu mô tuyến của phổi?
Khoảng 90% các đột biến hoạt hóa gen EGFR tập trung ở hai dạng chính: đột biến mất đoạn trên exon 19 (điển hình là Del E746–A750, Del L747–T751inS, Del L747–T753inS) và đột biến điểm thay thế nucleotide dẫn đến đổi axit amin L858R trên exon 21. Các đột biến này làm thụ thể tự động hoạt hóa mà không cần phối tử, nhạy cảm với các thuốc ức chế Tyrosine Kinase (TKIs).

2. Nguyên lý của kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl (MS-PCR) được sử dụng trong luận án là gì?
Kỹ thuật MS-PCR dựa trên việc xử lý DNA bằng sodium bisulfite để biến đổi các gốc cytosine không bị methyl hóa thành uracil, trong khi các gốc cytosine bị methyl hóa (5-methylcytosine) được giữ nguyên. Sau đó, hai cặp mồi riêng biệt được thiết kế: cặp mồi M đặc hiệu cho trình tự mang cytosine methyl hóa và cặp mồi U đặc hiệu cho trình tự đã bị biến đổi thành uracil. Sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại trên điện di xác định trạng thái methyl hóa của vùng promoter.

3. Bốn gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A có chức năng sinh học chính là gì?

• BRCA1: Tham gia sửa chữa đứt gãy DNA sợi đôi và điều hòa phiên mã/apoptosis.
• MGMT: Sửa chữa trực tiếp các sai hỏng DNA do tác nhân alkyl hóa gây ra tại vị trí O6-guanine.
• MLH1: Thành phần cốt lõi của phức hợp sửa chữa bắt cặp sai nucleotide (MMR) trên phân tử DNA.
• RASSF1A: Kiểm soát điểm chuyển tiếp chu kỳ tế bào G1/S qua con đường Rb, điều hòa apoptosis thông qua tương tác với kinase MST1 và ức chế protein YAP.

4. Hiện tượng methyl hóa promoter ảnh hưởng như thế nào đến mức độ biểu hiện protein EGFR?
Methyl hóa các đảo CpG tại vùng promoter (đoạn –300 đến –100 tại đầu 5' UTR) làm thay đổi cấu trúc chất nhiễm sắc thành dạng dị nhiễm sắc, ức chế quá trình gắn của các yếu tố phiên mã, dẫn đến suy giảm hoặc làm mất khả năng phiên mã của gen EGFR, từ đó làm giảm mức độ biểu hiện của protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư.

5. Dạng đột biến nào là nguyên nhân phổ biến nhất gây kháng thuốc TKIs thế hệ thứ nhất ở bệnh nhân có đột biến EGFR?
Đột biến thay thế T790M trên exon 20 của gen EGFR là cơ chế kháng thuốc thứ cấp phổ biến nhất sau một thời gian điều trị bằng các thuốc TKIs thế hệ một (Gefitinib, Erlotinib), thúc đẩy nhu cầu sử dụng các thuốc ức chế TKIs thế hệ thứ ba có hoạt tính nhắm trúng đột biến T790M như Osimertinib.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Ngọc Quang đã thực hiện thành công việc phân tích hệ thống và đồng bộ các biến đổi phân tử của gen EGFR (đột biến soma, mức độ biểu hiện protein và tình trạng methyl hóa promoter) cùng trạng thái methyl hóa 4 gen ức chế khối u (BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A) trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyến ở phổi tại Việt Nam. Công trình đã làm rõ mối tương quan giữa hiện tượng methyl hóa gen RASSF1A với BRCA1 và MLH1, cũng như tác động của methyl hóa promoter đến mức độ biểu hiện protein EGFR. Các kết quả đạt được cung cấp dữ liệu khoa học có giá trị lý luận và thực tiễn, phục vụ đắc lực cho công tác chẩn đoán phân tử, tiên lượng bệnh và định hướng ứng dụng các phác đồ điều trị nhắm đích kết hợp liệu pháp ngoại gen trong thực hành lâm sàng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Ung thư phổi là loại ung thư có tỷ lệ mắc và tử vong cao nhất trên thế giới hiện nay. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, năm 2018 có đến 2,1 triệu trường hợp mắc mới và 1,8 triệu người chết do ung thu phổi. Trong khi đó, số ca mắc mới và tử vong ở Việt Nam là 160 000 và 115 000 người. Ung thư phổi được chia làm hai nhóm chính là ung thư phổi tế bào nhỏ chiếm 10 – 15 % và ung thư phổi không tế bào nhỏ chiếm 85 – 90 %.

Trong đó, ung thư biểu mô tuyến của phổi là dạng phổ biến nhất, không chỉ gặp ở những người hút thuốc lá mà còn khá phổ biến ở những người không hút thuốc, phụ nữ và những người trẻ tuổi. Ung thư phổi nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng có tiên lượng và mức độ đáp ứng điều trị rất thấp, chỉ 10 – 15 % bệnh nhân ung thư phổi có thể sống sót qua 5 năm. Tuy vậy hiệu quả điều trị sẽ được cải thiện rõ rệt nếu như bệnh nhân được phát hiện ung thư sớm và sử dụng những phác đồ điều trị hiện đại. Một trong những phương pháp điều trị mới đang được áp dụng phổ biến hiện nay là những thuốc điều trị nhắm đích dựa trên những hiểu biết về những biến đổi di truyền của tế bào ung thư.

Ở ung thư phổi không tế bào nhỏ nói chung và ung thư biểu mô tuyến của phổi nói riêng, phác đồ điều trị bằng thuốc nhắm đích TKIs (Tyrosine Kinase Inhibitors) dựa trên những đột biến về gen EGFR (Epidermal growth factor receptor) đang được sử dụng rộng rãi và mang lại những hiệu quả rõ rệt trong việc kéo dài thời gian sống thêm và cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân ung thư phổi. Bên cạnh đó việc đánh giá sự biểu hiện của gen EGFR cũng góp phần quan trọng trong việc đưa ra những tiên lượng tiến triển của bệnh cũng như định hướng liều lượng thuốc cho bệnh nhân. Mặt khác, biểu hiện gen EGFR lại được điều khiển bởi mức độ methyl hóa vùng promoter của gen này. Cùng với EGFR, methyl hóa các gen ức chế khối u cũng được xem là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành và phát triển của ung thư.

Methyl hóa các gen ức chế khối u như: BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A…. đã được phát hiện trong nhiều loại ung thư trong đó có ung thư phổi. Thêm vào đó, tình trạng methyl hóa một số gen ức chế khối u dẫn đến tiên lượng xấu cho bệnh nhân và được xem là marker điển hình trong ung thư phổi. Đồng thời, 1 sự kết hợp thuốc điều trị nhắm đích TKIs với chất loại bỏ nhóm methyl đã mang lại hiệu quả ban đầu cao hơn so với việc chỉ sử dụng TKIs trên những dòng tế bào ung thư phổi điển hình.

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi. Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu tổng thể về những biến đổi phân tử của gen EGFR và sự ảnh hưởng của hiện tượng methyl hóa các gen ức chế khối u BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A lên những biến đổi này. Ở Việt Nam hiện nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức độ xác định đột biến gen EGFR để đưa ra phác đồ điều trị bằng TKIs. Vì vậy chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu đột biến, mức độ biểu hiện gen EGFR và tình trạng methyl hóa một số gen liên quan trên bệnh nhân ung thƣ biểu mô tuyến ở phổi” với mục tiêu: 1.

Phân tích tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR trên bệnh nhân ung thư biểu mô tuyển ở phổi. Đánh giá được tình trạng methyl hóa một số gen bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1, RASSF1A và sự tương quan về methyl hóa giữa các gen này với đột biến và biểu hiện protein EGFR. Nội dung nghiên cứu 1. Sàng lọc bệnh nhân, thiết lập hồ sơ bệnh án hoàn chỉnh.

Thu thập mẫu bệnh phẩm ung thư phổi và mẫu phổi liền kề. Xác định tỷ lệ đột biến và mức độ biểu hiện của gen EGFR. Phân tích sự liên quan của các đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu với đột biến và biểu hiện gen EGFR. Thiết lập và xây dựng điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR đặc hiệu methyl nhằm xác định tình trạng methyl hóa vùng promoter các gen EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A và sự tương quan của hiện tượng này với các đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu.

Phân tích tương quan giữa đột biến và biểu hiện EGFR với tình trạng methyl hóa các gen liên quan bao gồm: EGFR, BRCA1, MGMT, MLH1 và RASSF1A. 2 Đóng góp mới của luận án Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam xác định toàn diện các đặc điểm phân tử của EGFR là đột biến, methyl hóa và biểu hiện protein. Đồng thời, đánh giá được tình trạng methyl hóa 4 gen ức chế khối u quan trọng trong ung thư biểu mô tuyến của phổi. Nghiên cứu có một số đóng góp mới và ý nghĩ thực tiễn như sau: 1.

Mô tả tỷ lệ đột biến, mức độ biểu hiện của protein EGFR và sự methyl hóa của một số gen liên quan đến sự phát sinh ung thư, tiến triển bệnh và đáp ứng điều trị ung thư biểu mô tuyến ở phổi. Chỉ ra được mối liên quan giữa methyl hóa gen RASSF1A với methyl hóa các gen BRCA1 và MLH1. Sự khác nhau của methyl hóa vùng promoter gen EGFR và BRCA1 với sự biểu hiện protein EGFR trên bề mặt tế bào ung thư biểu mô tuyến ở phổi. Ung thƣ phổi 1.

Thực trạng ung thư phổi Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2018 có đến 1,8 triệu người chết do ung thư phổi trong tổng số 9,6 triệu người chết do ung thư (Hình 1. Đây vẫn ung thư phổ biến nhất ở nam giới trên toàn cầu (chiếm 14,5% tổng số). Tỷ lệ mắc cao nhất là ở Trung Âu và Đông Âu (53,3/100 000 người) và Đông Á (50,4/100 000 người).

Tỷ lệ mắc thấp nhất là ở Trung Phi và Tây Phi (2,0 và 1,7/100 000 người). Ở phụ nữ, ung thư phổi đứng thứ ba sau ung thư vú và ung thư đại trực tràng (chiếm 8,4% tổng số). Tỷ lệ mắc ung thư phổi ở phụ nữ thấp hơn ở nam giới và có sự khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau, chủ yếu phản ánh lịch sử tiếp xúc khác nhau với thuốc lá. Do đó, tỷ lệ mắc cao nhất là ở Bắc Mỹ (33,8/100 000 người) và Bắc Âu (23,7/100 000 người), tỷ lệ mắc tương đối cao ở khu vực Đông Á (19,2/100 000 người) và thấp nhất ở Tây Phi và Trung Phi (1,1 và 0,8/100 000 người) [35].

Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ (American Cancer Society) ước tính trong năm 2017, đã có thêm 225 500 trường hợp mới mắc ung thư phổi chiếm 13% tổng số ca ung thư được phát hiện. Chỉ có 19% trường hợp bị phát hiện ung thư phổi có thể sống thêm quá 5 năm. Cũng theo thống kê của Hiệp hội ung thư của Hoa Kỳ, năm 2015 có đến 155 800 người chết do căn bệnh này, chiếm 25% số trường hợp tử vong do ung thư [102]. Số trường hợp tử vong do ung thư phổi lớn hơn tổng số trường hợp tử vong do ba loại ung thư phổ biến khác ở Hoa Kỳ bao gồm ung thư tuyến tiền liệt, ung thư vú và ung thư đại tràng cộng lại [102].

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới 2018, ở Việt Nam, mỗi năm có khoảng 160 000 trường hợp mắc mới và có tới 115 000 người tử vong do ung thư. Việt Nam đứng ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100 000 người (Hình 1. Ung thư phổi có tỉ lệ mắc đứng hàng thứ 2 ở nam giới và đứng hàng thứ 3 ở nữ giới nhưng lại có tỷ lệ tử vong cao thứ hai ở cả nam và nữ (sau ung thư gan). Số ca mắc mới ung thư phổi ở nam giới năm 2000 chỉ là 6 905 ca với tỉ lệ 29,3/100 000 dân, đến năm 2018 số ca mắc đã là 23 667 trường hợp 4 (14,4% tổng số ca ung thư) và tăng tỉ lệ lên 35,1/100 000 dân.

Dự báo, đến năm 2020, số trường hợp mắc mới có thể lên tới 23 000 ở nam giới và hơn 34 000 ở cả hai giới [35]. Cũng theo WHO, Việt Nam nằm ở nhóm nước có tần suất mắc ung thư phổi cao thuộc hàng thứ hai trên thế giới, với tỉ lệ mắc ở nam giới là 25,5 – 41,5/100 000 dân và ở nữ giới là 7,3 – 13,6/100 000 dân [35]. Tỷ lệ mắc và tử vong của một số loại ung thư phổ biến trên thế giới [35]. Số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam năm 2018 [35].

Phân loại ung thư phổi Ung thư phổi được phân loại dựa trên kết quả xét nghiệm mô bệnh học [84]. Sự phân loại này có ý nghĩa quan trọng cho việc theo dõi, điều trị và tiên lượng bệnh. Ung thư phổi được hình thành từ khối u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô, gọi là ung thư biểu mô. Ung thư biểu mô phổi được phân loại theo kích thước và hình thái của các tế bào ác tính quan sát dưới kính hiển vi.

Để phục vụ cho mục đích điều trị, ung thư phổi được chia ra hai loại lớn: Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC – Non-Small Cell Lung Cancer) và ung thư phổi tế bào nhỏ (SCLC – Small Cell Lung Cancer) (Hình 1. Ung thư phổi không tế bào nhỏ Ung thư phổi không tế bào nhỏ được chia thành các nhóm nhỏ hơn, trong đó ba phân nhóm chính là ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô tế bào vảy và ung thư biểu mô tế bào lớn [57]. Ung thư biểu mô tuyến (AD - Adenocarcinoma) chiếm khoảng 40% trường hợp mắc ung thư phổi và thường bắt nguồn từ mô phổi ngoại vi [57]. Ung thư biểu mô tuyến xảy ra phổ biến ở nữ giới và những người không hút thuốc [135].

Đây cũng là loại ung thư phổi có thời gian sống kéo dài hơn những nhóm khác [112]. Ung thư biểu mô tế bào vảy (SCC – Squamous Cell Cancer) chiếm khoảng 25 – 30% số trường hợp ung thư phổi. Chúng thường bắt đầu xuất hiện ở tế bào vẩy, là những tế bào phẳng nằm bên trong đường hô hấp của phổi.