Luận án tiến sĩ nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen k13 và đáp ứng của plasmodium falciparum với dihydroartemisinin piperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lưu hành

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen k13 và đáp ứng của plasmodium falciparum với, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp

• Tác giả: Đỗ Mạnh Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Bùi Quang Phúc
• Trường học: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ương
• Chuyên ngành: Dịch tễ học
• Đề tài: Nghiên cứu dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisinin piperaquin phosphat
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam
• 1.2. Sốt rét và một số yếu tố liên quan dịch tễ bệnh sốt rét
• 1.3. Các thuật ngữ và định nghĩa liên quan tới kháng thuốc
• 1.3.1. Đột biến gen K13
• 1.3.2. Tình hình ký sinh trùng Plasmodium falciparum kháng thuốc sốt rét
• 1.3.2.1. Trên thế giới
• 1.3.2.2. Tại Việt Nam
• 1.3.3. Hiệu lực điều trị, tính dung nạp và độ an toàn của DHA-PPQ
• 1.3.3.1. Tính dung nạp của phối hợp thuốc DHA-PPQ
• 1.3.3.2. Hiệu lực điều trị và độ an toàn của phối hợp DHA-PPQ
• 1.3.4. Các kỹ thuật đánh giá kháng thuốc do quần thể P.
• 1.3.4.1. Kỹ thuật in vivo đánh giá nhạy - kháng thuốc trên lâm sàng
• 1.3.4.2. Kỹ thuật in vitro đánh giá ký sinh trùng P. falciparum kháng thuốc
• 1.3.4.3. Các kỹ thuật sinh học phân tử
• 1.3.5. Một số yếu tố thuận lợi cho KSTSR phát triển và hình thành kháng
• 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13
• 2.2. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum
• 2.4.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum
• 2.5.1. Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
• 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Mô tả đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13
• 3.2. Đặc điểm chung của bệnh nhân nhiễm Plasmodium falciparum
• 3.3. Phân tích đặc điểm các vị trí đột biến trên gen K13 của P.
• 3.4. Đặc điểm về đột biến gen K13 của quần thể P.
• 3.5. Tỷ lệ đột biến gen K13 của 5 tỉnh thực hiện nghiên cứu
• 3.6. So sánh tỷ lệ đột biến gen K13 của các quần thể P.
• 3.7. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với
• 3.7.1. Đặc điểm chung về dân số của nhóm nghiên cứu
• 3.7.2. Tỷ lệ, đặc điểm đột biến gen K13 của nhóm nghiên cứu in vivo
• 3.7.3. Thời gian làm sạch ký sinh trùng và cắt sốt sau điều trị DHA-PPQ
• 3.7.4. Hiệu lực phác đồ DHA-PPQ trong điều trị sốt rét do P.
• 3.8. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét trên in vitro
• 3.8.1. Đặc điểm đột biến gen K13 của ký sinh trùng P.
• 3.8.2. Đánh giá nhạy cảm của P. falciparum với thuốc sốt rét
• 3.8.3. Mối liên quan giữa đột biến gen k13 của ký sinh trùng P.
• 3.8.4. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K 13 của Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh có sốt rét lưu hành nặng
• 3.9. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu
• 3.10. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng P. falciparum với một số thuốc sốt rét trên thử nghiệm in vitro tại Gia Lai
• TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI
• MỘT SỐ ĐIỂM HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13

Nghiên cứu về dịch tễ học phân tử gen K13 của Plasmodium falciparum đã chỉ ra rằng gen này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định khả năng kháng thuốc của ký sinh trùng. Các đột biến trong gen K13 đã được ghi nhận là chỉ điểm phân tử liên quan đến kháng thuốc artemisinin. Tại Việt Nam, tỷ lệ đột biến gen K13 ở các tỉnh như Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Quảng Trị cho thấy sự gia tăng đáng kể trong những năm gần đây. Việc phân tích các đột biến này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế kháng thuốc mà còn cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị và phòng ngừa sốt rét. Theo nghiên cứu, tỷ lệ đột biến gen K13 ở các tỉnh nghiên cứu dao động từ 10% đến 30%, cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các khu vực. Điều này có thể liên quan đến các yếu tố như môi trường, điều kiện sống và thói quen sử dụng thuốc của người dân.

1.1. Phân tích đặc điểm các vị trí đột biến trên gen K13

Các vị trí đột biến trên gen K13 của Plasmodium falciparum đã được phân tích kỹ lưỡng. Những đột biến phổ biến như C580Y, P553L và C469F đã được xác định là có liên quan chặt chẽ đến khả năng kháng thuốc. Nghiên cứu cho thấy rằng các đột biến này không chỉ ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị mà còn có thể làm tăng nguy cơ tái phát bệnh. Việc theo dõi các đột biến này là cần thiết để đánh giá tình hình kháng thuốc trong cộng đồng. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR đã được áp dụng để xác định các đột biến này một cách chính xác. Kết quả cho thấy rằng việc phát hiện sớm các đột biến gen K13 có thể giúp cải thiện chiến lược điều trị và giảm thiểu tỷ lệ thất bại trong điều trị sốt rét.

II. Đánh giá đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisinin piperaquin phosphat

Đánh giá đáp ứng của Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin-piperaquin phosphat (DHA-PPQ) cho thấy hiệu quả điều trị giảm dần theo thời gian. Nghiên cứu cho thấy rằng tỷ lệ đáp ứng lâm sàng đầy đủ (ACPR) đã giảm từ 97,8% xuống còn 80% trong vòng vài năm qua. Điều này cho thấy sự xuất hiện của kháng thuốc và cần có các biện pháp can thiệp kịp thời. Thời gian làm sạch ký sinh trùng cũng kéo dài, với thời gian cắt sốt ngày D3 tăng lên đáng kể. Việc theo dõi hiệu quả điều trị của DHA-PPQ là rất quan trọng để đảm bảo rằng các phác đồ điều trị vẫn còn hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh sốt rét. Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy rằng việc kết hợp giữa DHA và piperaquin có thể cải thiện hiệu quả điều trị, tuy nhiên, cần tiếp tục theo dõi để đánh giá tính bền vững của hiệu quả này.

2.1. Tính nhạy cảm của ký sinh trùng với thuốc

Nghiên cứu về tính nhạy cảm của Plasmodium falciparum với DHA-PPQ cho thấy rằng các mẫu ký sinh trùng thu thập từ các tỉnh nghiên cứu có sự khác biệt rõ rệt về độ nhạy cảm. Kỹ thuật in vitro đã được sử dụng để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của ký sinh trùng dưới tác động của DHA và piperaquin. Kết quả cho thấy rằng một số mẫu ký sinh trùng đã thể hiện khả năng kháng thuốc, với IC50 tăng lên so với các mẫu trước đó. Điều này cho thấy rằng việc giám sát thường xuyên tình trạng kháng thuốc là cần thiết để điều chỉnh các phác đồ điều trị phù hợp. Việc phát hiện sớm các dấu hiệu kháng thuốc sẽ giúp cải thiện hiệu quả điều trị và giảm thiểu nguy cơ tái phát bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Bệnh sốt rét là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng Plasmodium spp. gây ra, lây truyền qua muỗi Anopheles đốt người. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2021), toàn cầu năm 2020 ghi nhận khoảng 241 triệu ca mắc và 627.000 trường hợp tử vong. Tại Việt Nam, bệnh phân bố tập trung chủ yếu ở khu vực ven biển miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ.

Một trong những thách thức lớn nhất trong lộ trình phòng chống và loại trừ sốt rét là ký sinh trùng sốt rét (KSTSR), đặc biệt là loài Plasmodium falciparum, đã phát triển tính kháng với hầu hết các loại thuốc sốt rét đơn trị liệu truyền thống. Thuốc phối hợp có dẫn chất artemisinin (Artemisinin-based Combination Therapies - ACTs), cụ thể là dihydroartemisinin - piperaquin phosphat (DHA-PPQ), từng là phác đồ ưu tiên hàng đầu tại Việt Nam với tỷ lệ đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR) đạt 97,8% đến 100% trong giai đoạn 2005–2010. Tuy nhiên, các ghi nhận dịch tễ lâm sàng sau đó cho thấy thời gian làm sạch ký sinh trùng bị kéo dài đáng kể; tỷ lệ bệnh nhân còn tồn tại ký sinh trùng thể vô tính ở ngày D3 tăng cao tại Bình Phước (30,6% năm 2012; 36% năm 2014), Gia Lai (24,1% năm 2015), Khánh Hòa (17,4% năm 2014) và xuất hiện các ca thất bại điều trị sớm cũng như thất bại điều trị muộn.

Các nghiên cứu sinh học phân tử xác định vùng cánh quạt (propeller domain) của gen K13 trên nhiễm sắc thể số 13 của P. falciparum (PF3D7_1343700) là chỉ điểm di truyền then chốt liên quan đến kiểu hình kháng artemisinin. Nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học toàn diện, chính xác phục vụ công tác giám sát dịch tễ và điều chỉnh chính sách thuốc điều trị quốc gia, việc kết hợp đồng thời ba phương pháp: phân tích dịch tễ học phân tử đột biến gen K13, theo dõi hiệu lực đáp ứng điều trị in vivo của phác đồ DHA-PPQ và đánh giá độ nhạy cảm in vitro của các chủng P. falciparum thực địa là vấn đề mang tính cấp thiết cao.

Mục tiêu nghiên cứu

Luận án được thực hiện nhằm giải quyết ba mục tiêu cụ thể:

1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị năm 2016 – 2018.
2. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu.
3. Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân mắc sốt rét do nhiễm đơn thuần ký sinh trùng Plasmodium falciparum chưa có biến chứng, tự nguyện tham gia nghiên cứu (không phân biệt tuổi, giới tính, dân tộc; loại trừ các trường hợp nhiễm phối hợp với các loài Plasmodium khác); các mẫu máu thấm trên giấy Whatman 3MM và các chủng ký sinh trùng P. falciparum phân lập từ máu tĩnh mạch bệnh nhân.
• Phạm vi không gian: Thực hiện tại 5 tỉnh trọng điểm có tình hình sốt rét lưu hành nặng thuộc các vùng sinh thái dịch tễ khác nhau của Việt Nam:
  • Tỉnh Bình Phước (khu vực Đông Nam Bộ): Xã Bù Gia Mập và xã Đắk Ơ thuộc huyện Bù Gia Mập.
  • Tỉnh Gia Lai (khu vực Tây Nguyên): Xã Chư Rcăm thuộc huyện Krông Pa.
  • Tỉnh Khánh Hòa (khu vực Duyên hải cực Nam Trung Bộ): Xã Sơn Thái thuộc huyện Khánh Vĩnh.
  • Tỉnh Ninh Thuận (khu vực Duyên hải Nam Trung Bộ): Xã Phước Thắng thuộc huyện Bác Ái và xã Ma Nới thuộc huyện Ninh Sơn.
  • Tỉnh Quảng Trị (khu vực Bắc Trung Bộ): Xã Xy và xã Thanh thuộc huyện Hướng Hóa.
• Phạm vi thời gian: Thu thập số liệu, mẫu bệnh phẩm và theo dõi thực địa từ năm 2016 đến năm 2018.
• Địa điểm xét nghiệm la-bô: Khoa Nghiên cứu lâm sàng và Thực nghiệm, Khoa Sinh học phân tử thuộc Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Các hướng nghiên cứu trước đây

Luận án đã tổng quan hệ thống các công trình nghiên cứu trên phạm vi quốc tế và tại Việt Nam liên quan đến tình hình dịch tễ sốt rét, cơ chế kháng thuốc và các phương pháp giám sát:

• Tình hình kháng artemisinin tại Tiểu vùng sông Mê Kông (GMS): Báo cáo của WHO và các nghiên cứu của Ariey và cs. (2014), Ashley và cs. (2014) chỉ ra hiện tượng kháng artemisinin xuất hiện ban đầu tại tỉnh Pailin (Campuchia) từ giai đoạn 2006–2008, sau đó lan rộng sang Thái Lan, Myanmar, Lào và Việt Nam. Nghiên cứu của Pharath Lim và cs. (2013) tại Campuchia xác định 17 vị trí đột biến trên gen K13, trong đó các đột biến C580Y, R539T và Y493H có tần suất trên 5%, đồng thời phát hiện sự gia tăng số lượng bản sao vùng X5r trên nhiễm sắc thể số 5 liên quan đến giảm nhạy cảm với piperaquin (PPQ). Tại Myanmar, nghiên cứu của Myat Phone Kyaw (2009, 2010) tại Kawthaung ghi nhận tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ngày D3 dao động từ 18,7% đến 20,5% sau điều trị bằng DHA + PPQ.
• Nghiên cứu hiệu lực và độ an toàn của DHA-PPQ: Các thử nghiệm lâm sàng pha 3 đa trung tâm của WHO tại châu Á và châu Phi (trên 769 bệnh nhân châu Á so sánh với artesunat-mefloquin và 1.039 trẻ em châu Phi so sánh với artemether-lumefantrine) khẳng định DHA-PPQ có tỷ lệ ACPR sau hiệu chỉnh PCR đạt trên 92–98%, dung nạp tốt, tuy có ghi nhận hiện tượng kéo dài khoảng QTc trên điện tâm đồ thoáng qua vào ngày D2 nhưng hồi phục hoàn toàn vào ngày D7.
• Nghiên cứu kháng thuốc tại Việt Nam: Các dẫn chất artemisinin được đưa vào sử dụng từ năm 1989. Các công trình của Đoàn Hạnh Nhân và cs. (2000), Lý Bá Lộc và cs. (2006), Tạ Thị Tĩnh và cs. (2011), Bùi Quang Phúc và cs. (2013, 2015), Huỳnh Hồng Quang và cs. (2014, 2017), Trần Tịnh Hiền và cs. (2014), Kamala Thriemer và cs. (2015) ghi nhận ca thất bại điều trị sớm đầu tiên với Arterakin tại Bù Đăng (Bình Phước) năm 2009 và Phú Thiện (Gia Lai) năm 2010. Tỷ lệ tồn tại thể vô tính ngày D3 tăng cao tại Đắk Nông, Quảng Nam (Nam Trà My đạt 29,2%–30%), Bình Phước (lên đến 36%–50% vào năm 2013–2015) và Ninh Thuận (nghiên cứu của Nguyễn Thanh Thùy Nhiên và cs. ghi nhận đột biến C580Y trên người Raglay).

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các nghiên cứu đơn lẻ đã cảnh báo hiện tượng chậm làm sạch ký sinh trùng, nhưng chưa có công trình nào tiến hành khảo sát dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 trên quy mô đa vùng đồng thời tại 5 tỉnh trọng điểm sốt rét lưu hành nặng (đại diện cho Đông Nam Bộ, Tây Nguyên, Duyên hải Nam Trung Bộ và Bắc Trung Bộ), kết hợp đối chiếu trực tiếp giữa kiểu gen đột biến K13 với hiệu lực điều trị lâm sàng in vivo (phác đồ Arterakin cập nhật) và chỉ số nhạy cảm in vitro (nồng độ IC50 của artesunat, dihydroartemisinin, piperaquin, chloroquin) trên các chủng phân lập tại chỗ.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và khung phân tích

• Cấu trúc và cơ chế sinh học phân tử của gen K13: Gen PF3D7_1343700 gồm một đoạn exon mã hóa protein Kelch 13 dài 726 axit amin. Protein K13 hoạt động như một bộ phận điều khiển kiểm soát mức độ sản sinh enzym phosphatidylinositol-3-kinase (PfPI3K) trong phức hợp với enzym gắn ubiquitin ligase E3. Ở các chủng nhạy cảm, protein K13 liên kết với enzym thủy phân PfPI3K làm giảm hoạt tính của nó; ở các chủng mang đột biến vùng K13 propeller, sự liên kết này bị mất đi, dẫn đến tăng nồng độ PfPI3K và gia tăng sản sinh lipid phosphatidylinositol-3-phosphate (PfPI3P), giúp ký sinh trùng sống sót trước tác động oxy hóa của dẫn chất artemisinin.
• Hệ thống phân loại đột biến K13 theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2018):
  • 9 vị trí đột biến xác định kháng artemisinin: F446I, N458Y, M476I, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, C580Y.
  • 11 vị trí đột biến ứng viên / liên quan đến kháng artemisinin: P441L, G449A, C469F, A481V, P527H, N537I, G538V, V568G, P574L, F673I, A675V.
• Tiêu chuẩn đánh giá hiệu lực điều trị in vivo (WHO, 2009):
  • Thất bại điều trị sớm (Early Treatment Failure - ETF): Xuất hiện dấu hiệu nguy hiểm/sốt rét ác tính (SRAT) ngày D1–D3 có ký sinh trùng; mật độ KST ngày D2 cao hơn D0; có KST ngày D3 kèm thân nhiệt ≥ 37,5°C; mật độ KST ngày D3 ≥ 25% so với D0.
  • Thất bại lâm sàng muộn (Late Clinical Failure - LCF): Xuất hiện dấu hiệu nguy hiểm/SRAT hoặc sốt ≥ 37,5°C kèm KST trong máu từ ngày D4 đến D28/D42 mà không thỏa mãn tiêu chuẩn ETF trước đó.
  • Thất bại ký sinh trùng muộn (Late Parasitological Failure - LPF): Có ký sinh trùng trong máu từ ngày D7 đến D28/D42 với thân nhiệt < 37,5°C mà không thỏa mãn ETF hoặc LCF.
  • Đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (Adequate Clinical and Parasitological Response - ACPR): Sạch ký sinh trùng trong máu đến ngày D28/D42, không thuộc các nhóm thất bại điều trị trên.

Nhóm chỉ điểm phân tử gen K13	Danh sách các vị trí đột biến axit amin
Xác định kháng artemisinin	F446I, N458Y, M476I, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, C580Y
Ứng viên / Có liên quan đến kháng	P441L, G449A, C469F, A481V, P527H, N537I, G538V, V568G, P574L, F673I, A675V

Phương pháp nghiên cứu thực tế

1. Phương pháp dịch tễ học phân tử gen K13

• Thu thập mẫu: Máu mao mạch hoặc máu tĩnh mạch của bệnh nhân được thấm lên giấy thấm chuyên dụng Whatman 3MM tại các trạm y tế xã thuộc 5 tỉnh nghiên cứu, bảo quản khô kèm gói hút ẩm.
• Tách chiết DNA: Sử dụng bộ kít thương mại QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen) theo quy trình chuẩn của nhà sản xuất.
• Kỹ thuật Nested-PCR nhân bản gen K13: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế bởi Ariey và cs. (2014) để khuếch đại vùng cánh quạt K13-propeller.
• Tinh sạch và đo nồng độ: Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kit Norgen; kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ Nanophotometer.
• Giải trình tự Sanger: Thực hiện phản ứng PCR Sequencing chuỗi nucleotide và đọc trình tự trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI 3500.
• Phân tích tin sinh học: Sử dụng phần mềm BioEdit V.3 để gióng hàng (alignment), so sánh trình tự DNA và trình tự suy diễn axit amin của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn của chủng P. falciparum 3D7 trên ngân hàng gen NCBI (mã số tham chiếu: >XM_001350122).

2. Kỹ thuật PCR phân biệt tái phát và tái nhiễm

Để xác định chính xác hiệu lực điều trị của phác đồ DHA-PPQ ở các trường hợp xuất hiện lại ký sinh trùng trong vòng 42 ngày theo dõi, kỹ thuật Nested-PCR đa hình chiều dài phân đoạn được thực hiện trên 3 locus gen đa hình cao: PfMSP1 (Merozoite Surface Protein 1), PfMSP2 (Merozoite Surface Protein 2) và PfGLURP (Glutamate-Rich Protein).

Gen đích	Ký hiệu mồi	Trình tự mồi (Primers: 5' - 3')	Mục đích ứng dụng
MSP1	M1-OF / M1-OR M1-2KF / M1-2KR M1-2MF / M1-2MR M1-2RF / M1-2RR	5'-CTAGAAGCTTTAGAAGATGCAGTATTG-3' / 5'-CTTAAATAGTATTCTAATTCAAGTGGATCA-3' 5'-AAATGAAGAAGAAATTACTACAAAAGGTGC-3' / 5'-GCTTGCATCAGCTGGAGGGCTTGCACCAGA-3' 5'-AAATGAAGGAACAAGTGGAACAGCTGTTAC-3' / 5'-ATCTGAAGGATTTGTACGTCTTGAATTACC-3' 5'-TAAAGGATGGAGCAAATACTCAAGTTGTTG-3' / 5'-CATCTGAAGGATTTGCAGCACCTGGAGATC-3'	Phân biệt kiểu gen các alen block 2 (K1, MAD20, RO33) giữa ngày D0 và ngày xuất hiện lại KST
MSP2	M2-0F / M2-0R M2-ICF / M2-ICR M2-FCF / M2-FCR	5'-ATGAAGGTAATTAAAACATTGTCTATTATA-3' / 5'-CTTTGTTACCATCGGTACATTCTT-3' 5'-AGAAGTATGGCAGAAAGTAAkCCTYCTACT-3' / 5'-GATTGTAATTCGGGGGATTCAGTTTGTTCG-3' 5'-AATACTAAGAGTGTAGGTGCARATGCTCCA-3' / 5'-TTTTATTTGGTGCATTGCCAGAACTTGAAC-3'	Phân tích các họ alen FC27 và IC/3D7
GLURP	G-OF / G-OR G-FN	5'-TGAATTTGAAGATGTTCACACTGAAC-3' / 5'-GTGGAATTGCTTTTTCTTCAACACTAA-3' 5'-GTGTCACACTGAACAATTAGATTTAGATCA-3'	Phân tích vùng lặp lại R2 của gen GLURP

Tiêu chuẩn phân định:

• Tái phát (Recrudescence): Kiểu gen và kích thước các đoạn alen ở ngày KST xuất hiện lại hoàn toàn trùng khớp với mẫu ngày D0.
• Tái nhiễm (Re-infection): Kiểu gen và kích thước các đoạn alen ở ngày KST xuất hiện lại khác hoàn toàn so với ngày D0.
• Dạng phối hợp: Vừa xuất hiện các alen giống ngày D0 vừa có thêm các alen mới.

3. Phương pháp theo dõi đáp ứng điều trị in vivo

• Phác đồ điều trị: Thuốc Arterakin (viên nén phối hợp Dihydroartemisinin 40 mg + Piperaquin phosphat 320 mg), uống liều chuẩn theo cân nặng và nhóm tuổi (theo hướng dẫn của Bộ Y tế và quy chuẩn WHO, tổng liều 8 viên hoặc 9–12 viên tùy thể trọng), uống 1 lần/ngày trong 3 ngày liên tiếp (D0, D1, D2).
• Lịch trình theo dõi: Bệnh nhân được khám lâm sàng, đo thân nhiệt và lấy máu làm tiêu bản giọt dày - giọt mỏng nhuộm Giemsa kiểm tra ký sinh trùng vào các mốc thời gian: D0 (trước uống thuốc), D1, D2, D3, D7, D14, D21, D28, D35 và D42 (theo dõi 42 ngày).
• Chỉ số đánh giá: Thời gian cắt sốt (FCT), thời gian sạch ký sinh trùng (PCT), tỷ lệ bệnh nhân còn ký sinh trùng thể vô tính ở ngày D3 (sau 72 giờ), tỷ lệ ACPR, ETF, LCF, LPF trước và sau khi hiệu chỉnh PCR phân tích bằng phương pháp sống còn Kaplan-Meier.

4. Phương pháp thử nghiệm in vitro độ nhạy cảm của thuốc

• Mẫu nuôi cấy: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch của bệnh nhân có mật độ ký sinh trùng thể vô tính thích hợp, chống đông bằng heparin.
• Môi trường và điều kiện nuôi cấy: Môi trường RPMI 1640 bổ sung (BMM) với tỷ lệ hồng cầu 4%. Hỗn dịch được phân phối vào các giếng trên phiến nhựa 96 giếng chứa sẵn các nồng độ pha loãng khác nhau của thuốc thử nghiệm (Artesunat, Dihydroartemisinin, Chloroquin, Piperaquin) cùng giếng chứng không có thuốc (giếng A).
• Ủ ấm và thu hoạch: Đặt phiến nuôi cấy vào bình nến kín ở 37°C ± 0,5°C trong vòng 24–30 giờ đến 48 giờ. Thu hoạch cặn hồng cầu làm tiêu bản giọt dày, nhuộm Giemsa pH 6,8.
• Đọc kết quả: Đếm số thể phân liệt chứa ≥ 3 nhân trong tổng số 200 KST ở từng giếng, so sánh tỷ lệ ức chế với giếng chứng. Tiêu chuẩn mẻ thử hợp lệ khi số phân liệt ở giếng chứng đạt ≥ 10% (≥ 20 thể phân liệt/200 KST).
• Xử lý số liệu: Nhập dữ liệu và tính toán nồng độ ức chế 50% sự phát triển ký sinh trùng ($IC_{50}$) bằng phần mềm chuyên dụng Probit của Wernsdorfer.

---

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Trình bày cơ sở khoa học và thực tiễn của bệnh sốt rét trên thế giới và tại Việt Nam. Phân tích hiện tượng suy giảm độ nhạy của ký sinh trùng Plasmodium falciparum đối với các dẫn chất artemisinin và phác đồ phối hợp DHA-PPQ tại khu vực Đông Nam Á và miền Trung - Tây Nguyên. Xác định tính cấp thiết của việc nghiên cứu dịch tễ học phân tử gen K13, đánh giá đáp ứng in vivo và kiểm tra độ nhạy in vitro nhằm cung cấp luận cứ khoa học hoàn thiện chiến lược loại trừ sốt rét.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

• Dịch tễ học bệnh sốt rét: Đánh giá tình hình mắc và tử vong toàn cầu giai đoạn 2000–2019 theo các vùng dịch tễ của WHO (châu Phi chiếm trên 90% gánh nặng; Đông Nam Á giảm 73% số ca mắc). Tại Việt Nam, số ca bệnh giảm dần nhưng tập trung cao tại các vùng rừng núi miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ với loài P. falciparum chiếm 60–70% cơ cấu.
• Định nghĩa và cơ chế kháng thuốc: Hệ thống hóa các khái niệm kháng thuốc, thất bại điều trị, kháng chéo, đa kháng; tiêu chuẩn xác định nghi ngờ và khẳng định kháng artemisinin theo các văn bản cập nhật của WHO (2011, 2014, 2017, 2018).
• Chỉ điểm sinh học phân tử gen K13: Cấu trúc domain cánh quạt K13-propeller, vai trò tương tác với enzym PfPI3K, phân loại 20 vị trí đột biến liên quan đến kháng artemisinin.
• Thực trạng kháng thuốc tại khu vực: Diễn biến suy giảm hiệu lực của các phối hợp ACTs (AS-MQ, AL, DHA-PPQ) tại Campuchia, Thái Lan, Myanmar, Lào và Việt Nam từ năm 2008 đến 2018.
• Đặc tính dược lý và hiệu lực DHA-PPQ: Tổng hợp kết quả thử nghiệm pha 3, dược động học, tính dung nạp và tác dụng kéo dài khoảng QTc.
• Các kỹ thuật giám sát: Nguyên lý và quy trình thử nghiệm in vivo 28/42 ngày, thử nghiệm vi thể in vitro (Microtest Rieckmann 1978, nuôi cấy 48 giờ) và ứng dụng kỹ thuật Nested-PCR (MSP1, MSP2, GLURP, giải trình tự Sanger gen K13).
• Yếu tố dịch tễ thuận lợi: Áp lực thuốc kéo dài, mật độ ký sinh trùng cao, tập tính di biến động dân cư đi rừng, ngủ rẫy qua đêm và sự đột biến di truyền nội sinh của KSTSR.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

• Trình bày chi tiết tiêu chuẩn chọn bệnh và loại trừ tại 5 tỉnh nghiên cứu (Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị) giai đoạn 2016–2018.
• Đặc điểm địa lý, khí hậu và dịch tễ học của từng điểm nghiên cứu thực địa (các xã Bù Gia Mập, Đắk Ơ - Bình Phước; xã Chư Rcăm - Gia Lai; xã Sơn Thái - Khánh Hòa; xã Phước Thắng, Ma Nới - Ninh Thuận; xã Xy, Thanh - Quảng Trị).
• Thiết kế nghiên cứu và quy trình thao tác chuẩn cho ba nội dung:
  • Phân tích dịch tễ học phân tử gen K13 (tách chiết DNA, PCR lồng, tinh sạch Norgen, đo Nanophotometer, giải trình tự ABI 3500, phân tích BioEdit V.3).
  • Thử nghiệm lâm sàng in vivo 42 ngày đánh giá phác đồ Arterakin (thuốc, liều dùng, lịch lấy máu, tiêu chuẩn đánh giá ETF, LCF, LPF, ACPR, hiệu chỉnh PCR bằng MSP1/MSP2/GLURP, phân tích sống còn Kaplan-Meier).
  • Đánh giá nhạy cảm in vitro (nuôi cấy hồng cầu 4%, môi trường BMM/RPMI 1640, ủ bình nến 37°C, nhuộm Giemsa, đọc phân liệt, tính $IC_{50}$ bằng phần mềm Probit).

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

• Đặc điểm chung của bệnh nhân: Phân tích cơ cấu dân số, giới tính, nhóm tuổi, nghề nghiệp và mật độ ký sinh trùng ban đầu của bệnh nhân tham gia tại 5 tỉnh.
• Kết quả dịch tễ học phân tử gen K13:
  • Tỷ lệ mang đột biến gen K13 tại từng tỉnh và phân bố theo các biến số nhân khẩu học (Bình Phước, Gia Lai, Ninh Thuận, Khánh Hòa, Quảng Trị).
  • Xác định các vị trí đột biến nucleotide và thay thế axit amin trên gen K13 bằng phân tích gióng hàng BioEdit V.3: Đột biến nucleotide 1739 dẫn đến thay thế axit amin C580Y; đột biến nucleotide 1658 dẫn đến thay thế P553L; đột biến nucleotide 1406 dẫn đến thay thế C469F, cùng các đột biến điểm khác.
  • So sánh tần suất và bản đồ phân bố các kiểu đột biến gen K13 giữa các quần thể P. falciparum tại 5 tỉnh.
• Kết quả đánh giá đáp ứng in vivo với phác đồ DHA-PPQ:
  • Thời gian cắt sốt (FCT) và thời gian làm sạch ký sinh trùng (PCT).
  • Tỷ lệ bệnh nhân còn tồn tại ký sinh trùng thể vô tính ở ngày D3 tại các điểm nghiên cứu.
  • Phân tích mối tương quan giữa sự hiện diện của ký sinh trùng ngày D3 với các điểm đột biến gen K13.
  • Hiệu lực điều trị của phác đồ DHA-PPQ (tỷ lệ ACPR, thất bại điều trị) trước và sau khi hiệu chỉnh PCR phân biệt tái phát/tái nhiễm thông qua đường cong phân tích sống còn Kaplan-Meier (tại Bình Phước, Gia Lai...).
  • Mối liên quan giữa các điểm đột biến gen K13 xác định kháng artemisinin với kết cục thất bại điều trị lâm sàng.
• Kết quả thử nghiệm in vitro tại Gia Lai:
  • Tỷ lệ nuôi cấy thành công các mẫu phân lập thực địa.
  • Đặc điểm đột biến gen K13 trên các mẫu nuôi cấy thành công.
  • Giá trị nồng độ ức chế 50% ($IC_{50}$) và tỷ lệ ức chế sự phát triển của P. falciparum đối với từng loại thuốc: artesunat, dihydroartemisinin, chloroquin, piperaquin.
  • Phân tích mối liên quan giữa đột biến gen K13 với sự gia tăng giá trị $IC_{50}$ của các thuốc sốt rét thử nghiệm.

Chương 4: Bàn luận

• Bàn luận về tính đa hình di truyền, tần suất và sự lưu hành của các đột biến gen K13 (như C580Y, P553L, C469F) tại 5 tỉnh trọng điểm ở Việt Nam so với các quốc gia khác trong Tiểu vùng sông Mê Kông.
• Phân tích nguyên nhân dẫn đến sự suy giảm hiệu lực điều trị của phác đồ DHA-PPQ, sự gia tăng tỷ lệ ký sinh trùng ngày D3 và nguy cơ thất bại điều trị liên quan đến áp lực thuốc phối hợp và sự lan rộng của các chủng mang đột biến kháng.
• Bàn luận về giá trị cảnh báo sớm của thử nghiệm in vitro ($IC_{50}$) và vai trò của giám sát sinh học phân tử trong việc hoạch định chính sách thuốc sốt rét thay thế.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học

1. Dữ liệu dịch tễ học phân tử toàn diện: Luận án cung cấp bức tranh hoàn chỉnh về đặc điểm di truyền, tần suất và phân bố các đột biến trên vùng cánh quạt gen K13 propeller của ký sinh trùng P. falciparum tại 5 tỉnh đại diện cho 4 vùng sinh thái sốt rét trọng điểm ở Việt Nam (Bình Phước, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị) trong giai đoạn 2016–2018.
2. Xác định các chỉ điểm đột biến kháng thực tế: Luận án đã phát hiện và xác định cụ thể các đột biến nucleotide và thay đổi axit amin có ý nghĩa xác định kháng artemisinin (như đột biến C580Y tại vị trí nucleotide 1739; P553L tại vị trí 1658) và các đột biến ứng viên liên quan (như C469F tại vị trí 1406) trên các chủng P. falciparum thực địa tại Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger và phần mềm BioEdit V.3.
3. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình kháng thuốc: Luận án chứng minh mối tương quan có ý nghĩa giữa sự hiện diện của các đột biến gen K13 với hiện tượng kéo dài thời gian làm sạch ký sinh trùng (tỷ lệ KST ngày D3 dương tính), nguy cơ thất bại điều trị lâm sàng in vivo của phác đồ DHA-PPQ (phân tích bằng phương pháp Kaplan-Meier và hiệu chỉnh PCR qua 3 locus PfMSP1, PfMSP2, PfGLURP) và sự thay đổi nồng độ ức chế $IC_{50}$ trong thử nghiệm in vitro.

Ý nghĩa thực tiễn và kiến nghị giải pháp

• Cơ sở khoa học thay đổi chính sách thuốc: Kết quả nghiên cứu về tỷ lệ thất bại điều trị và tần suất đột biến kháng K13 cao tại các điểm nghiên cứu là bằng chứng khoa học phục vụ Bộ Y tế và Chương trình Quốc gia Phòng chống Sốt rét quyết định điều chỉnh phác đồ điều trị tuyến đầu (chuyển đổi thay thế phác đồ DHA-PPQ bằng các thuốc phối hợp ACTs mới như Pyramax tại các vùng có lưu hành ký sinh trùng kháng thuốc).
• Xây dựng mô hình giám sát tích hợp: Đề xuất duy trì và mở rộng hệ thống giám sát kháng thuốc phối hợp ba yếu tố: xét nghiệm lâm sàng in vivo, nuôi cấy vi thể in vitro và giải trình tự gen K13 định kỳ tại các vùng sốt rét lưu hành nặng để chủ động ngăn chặn sự lan rộng của các chủng ký sinh trùng đa kháng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Phạm vi thử nghiệm in vitro: Do yêu cầu nghiêm ngặt về cơ sở vật chất phòng xét nghiệm, điều kiện nuôi cấy tế bào sống và kỹ thuật thực địa phức tạp, thử nghiệm in vitro đánh giá độ nhạy cảm của ký sinh trùng với các thuốc sốt rét mới chỉ triển khai thực hiện tập trung tại tỉnh Gia Lai, chưa mở rộng đồng thời ra toàn bộ 5 tỉnh nghiên cứu.
• Biến động số lượng bệnh nhân: Do số ca mắc sốt rét tại một số địa bàn giảm mạnh theo lộ trình phòng chống sốt rét chung của cả nước, cỡ mẫu thu thập được ở một số xã có thời điểm còn hạn chế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục mở rộng nghiên cứu dịch tễ học phân tử gen K13 trên phạm vi toàn quốc, kết hợp nghiên cứu các chỉ điểm phân tử kháng thuốc đi kèm như đột biến đa bản sao gen plasmepsin 2/3 (liên quan đến kháng piperaquin) hoặc đột biến trên các gen Pfmdr1, Pfcrt.
• Đánh giá theo dõi liên tục hiệu lực điều trị in vivo và độ nhạy cảm in vitro của các phác đồ phối hợp ACTs thay thế mới (như Pyramax - pyronaridine artesunat hoặc artesunat-mefloquin) sau khi được đưa vào áp dụng tại các vùng sốt rét lưu hành ở Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Y - Dược: Tài liệu tham khảo hữu ích cho các chuyên ngành Dịch tễ học, Bệnh truyền nhiễm nhiệt đới, Ký sinh trùng học và Sinh học phân tử y học.
• Các nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên xét nghiệm: Tham khảo quy trình kỹ thuật khuếch đại gen PCR lồng, giải trình tự Sanger gen K13, kỹ thuật PCR đa locus phân biệt tái phát - tái nhiễm (MSP1, MSP2, GLURP), và kỹ thuật nuôi cấy in vitro vi thể đánh giá $IC_{50}$ bằng phần mềm Probit.
• Cán bộ quản lý và hoạch định chính sách y tế: Các cán bộ thuộc Cục Y tế Dự phòng, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Viện Sốt rét – KST – CT Quy Nhơn, Viện Sốt rét – KST – CT TP. Hồ Chí Minh và Trung tâm Kiểm soát bệnh tật (CDC) các tỉnh trong việc lập kế hoạch giám sát dịch tễ và lựa chọn thuốc điều trị sốt rét thích hợp.

Các phần đáng tham khảo trong luận án

• Quy trình sinh học phân tử chuẩn: Phương pháp và hệ thống mồi PCR lồng giải trình tự gen K13 propeller và phương pháp so sánh trình tự với chủng chuẩn 3D7 trên BioEdit V.3.
• Bộ công cụ phân biệt tái phát và tái nhiễm: Bảng trình tự mồi và quy trình phân tích đa hình alen của 3 gen PfMSP1, PfMSP2 và PfGLURP.
• Quy trình thử nghiệm in vivo và in vitro: Thiết kế theo dõi 42 ngày theo chuẩn WHO và quy trình thử nghiệm vi thể microtest 48 giờ tính $IC_{50}$.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Đột biến gen K13 nào được xác định là chỉ điểm kháng artemisinin phổ biến nhất tại các điểm nghiên cứu?

Trong các đột biến vùng cánh quạt K13-propeller, đột biến C580Y (đột biến thay thế nucleotide ở vị trí 1739 làm biến đổi axit amin cysteine thành tyrosine tại codon 580) là chỉ điểm kháng artemisinin phổ biến nhất, cùng với sự xuất hiện của các đột biến khác như P553L (vị trí nucleotide 1658) và C469F (vị trí nucleotide 1406).

2. Tiêu chuẩn nào của WHO được áp dụng để đánh giá hiệu lực điều trị in vivo của thuốc DHA-PPQ trong luận án?

Luận án áp dụng tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2009) theo dõi bệnh nhân trong vòng 42 ngày sau điều trị với thuốc Arterakin. Kết quả được phân loại thành 4 nhóm: Thất bại điều trị sớm (ETF), Thất bại lâm sàng muộn (LCF), Thất bại ký sinh trùng muộn (LPF) và Đáp ứng lâm sàng và ký sinh trùng đầy đủ (ACPR).

3. Kỹ thuật sinh học phân tử nào được tác giả sử dụng để phân biệt giữa tái phát và tái nhiễm ký sinh trùng?

Tác giả sử dụng kỹ thuật Nested-PCR phân tích tính đa hình chiều dài phân đoạn trên 3 locus gen di truyền của Plasmodium falciparum gồm:

• PfMSP1 (Merozoite surface protein 1),
• PfMSP2 (Merozoite surface protein 2),
• PfGLURP (Glutamate-rich protein). Nếu kiểu gen và kích thước alen tại thời điểm ký sinh trùng xuất hiện lại trùng khớp hoàn toàn với ngày D0 thì xác định là tái phát; nếu khác biệt thì xác định là tái nhiễm.

4. Cơ chế phân tử của gen K13 trong việc gây kháng artemisinin ở Plasmodium falciparum là gì?

Gen K13 mã hóa protein Kelch 13 có chức năng điều hòa phức hợp ubiquitin ligase E3 nhằm kiểm soát và ức chế nồng độ enzym PfPI3K. Khi vùng cánh quạt của protein K13 bị đột biến điểm, sự liên kết này bị gián đoạn, làm tăng nồng độ enzym PfPI3K và gia tăng tích lũy lipid PfPI3P. Lượng PfPI3P tăng cao giúp ký sinh trùng chống lại tác động tiêu diệt của thuốc có gốc artemisinin.

5. Nghiên cứu thực nghiệm in vitro của luận án được thực hiện tại địa phương nào và đánh giá độ nhạy cảm của những loại thuốc nào?

Thử nghiệm in vitro được tiến hành trên các chủng ký sinh trùng P. falciparum phân lập từ bệnh nhân thực địa tại xã Chư Rcăm, huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai. Thử nghiệm tiến hành nuôi cấy hồng cầu 4% trong môi trường RPMI 1640/BMM ở 37°C để xác định nồng độ ức chế 50% ($IC_{50}$) đối với 4 loại thuốc: artesunat, dihydroartemisinin, chloroquin và piperaquin.

---

Kết luận

Luận án của tác giả Đỗ Mạnh Hà đã hoàn thành toàn diện ba mục tiêu nghiên cứu, cung cấp bằng chứng khoa học hệ thống về đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của ký sinh trùng Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh trọng điểm sốt rét lưu hành nặng ở Việt Nam giai đoạn 2016–2018. Công trình đã xác định sự hiện diện và phân bố của các đột biến kháng artemisinin then chốt (như C580Y, P553L, C469F), đồng thời làm rõ mối liên quan giữa kiểu gen đột biến với hiện tượng chậm làm sạch ký sinh trùng ngày D3, nguy cơ thất bại điều trị lâm sàng in vivo của phác đồ DHA-PPQ và sự gia tăng giá trị $IC_{50}$ trong thử nghiệm in vitro. Những kết quả này mang giá trị lý luận và thực tiễn sâu sắc, là căn cứ quan trọng phục vụ công tác giám sát dịch tễ học và hoạch định chính sách điều chỉnh thuốc sốt rét quốc gia hướng tới mục tiêu loại trừ sốt rét tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sốt rét là một bệnh truyền nhiễm, do ký sinh trùng Plasmodium spp. của ngƣời gây nên. Bệnh lây theo đƣờng máu, do muỗi Anopheles spp. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO, 2021), trên toàn thế giới năm 2020 ƣớc tính có khoảng 241 triệu ca mắc sốt rét, 627.000 ngƣời tử vong.

Số mắc sốt rét tăng khoảng 14 triệu ca bệnh và tăng khoảng 69.000 ngƣời tử vong so với năm 2020, trong đó có khoảng 47.000 ngƣời chết liên quan đến việc bị gián đoạn cung cấp các biện pháp phòng chống, chẩn đoán, điều trị bệnh trong bối cảnh đại dịch Covid. Khu vực châu Phi chiếm 90% số ca mắc và tử vong sốt rét trên thế giới [107], [108]. Ở Việt Nam theo số liệu chƣơng trình phòng chống sốt rét năm 2015 cả nƣớc có 9331 bệnh nhân sốt rét trong đó tập chung chủ yếu ở ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ [28]. Một trong những khó khăn và là một trong những thách thức trong lộ trình loại trừ sốt rét là ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) đã kháng với hầu hết các thuốc đang dùng, ngoại trừ một số thuốc phối hợp có gốc artemisinin và dẫn chất [103].

Artemisinin và dẫn chất là thành phần quan trọng trong thuốc phối hợp (ACTs) để điều trị sốt rét Plasmodium falciparum (P. falciparum) kháng thuốc [28]. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã khuyến cáo sử dụng các loại thuốc ACTs tại nhiều nƣớc, kể cả Việt Nam [103]. Tuy nhiên, đến năm 2005, WHO đã ghi nhận P.

falciparum giảm nhạy với ACTs và đến cuối năm 2008 thì báo cáo P. falciparum biểu hiện kháng artemisinin tại tỉnh Pailin, Campuchia - nơi giáp biên giới với Thái Lan, từ đó lan rộng kháng ra 5 nƣớc thuộc Tiểu vùng sông Mê Kông (Lào, Thái Lan, Myanmar, Việt Nam) [103]. Ở Việt Nam thuốc phối hợp dihydroartemisinin- piperaquin (DHA-PPQ) đƣợc lựa trọn đƣa vào điều trị sốt rét do P. falciparum, giai đoạn từ 2005-2010 tỷ lệ đáp ứng lâm sàng đầy đủ (ACPR) từ 97,8% đến 100%, nhƣng sau đó thời gian cắt ký sinh trùng ngày càng kéo dài, ký sinh trùng ngày D3 đã tăng lên nhanh chóng, năm 2012 là 30,6%, 2 năm 2014 là 36% (Bình Phƣớc) [16], Gia Lai 24,1% (2015) [12], Khánh Hòa 17,4% D3 (2014) [17].

Gần đây, một số đột biến trong gen K13 đã đƣợc xác định nhƣ các chỉ điểm phân tử liên quan chặt chẽ kháng thuốc artemisinin của P. falciparum trong các nghiên cứu lâm sàng cũng nhƣ tại các chủng tại phòng thí nghiệm [40]. Việc kết hợp dữ liệu phân tích chỉ điểm phân tử đột biến gen K13 và hiệu lực thuốc dihydroartemisinin-piperaquin phosphate trên các bệnh nhân là cần thiết, góp phần đánh giá chính xác tình hình P. falciparum kháng thuốc tại các vùng sốt rét lƣu hành.

Ngoài thử nghiệm in vivo và tìm chỉ điểm phân tử, thử nghiệm in vitro đóng vai trò quan trọng giám sát nhạy-kháng trên các mẫu phân lập P. falciparum thu thập tại thực địa, giúp nhận định tình hình kháng chính xác và quan trọng trong thay đổi chính sách thuốc [40]. Với ý tƣởng kết hợp giữa phân tích các đột biến gen K13 và theo dõi hiệu quả điều trị của thuốc sốt rét dihydro artemisinin - piperaquin trên bệnh nhân là cần thiết, góp phần đánh giá chính xác hơn tình hình P. falciparum kháng artemisinin thuốc tại các vùng sốt rét lƣu hành.

Để đánh giá tình hình nhạy- kháng thuốc trên in vivo, in vitro và các chỉ điểm phân tử K13 liên quan kháng trên quần thể P. falciparum, đề tài luận án “Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử gen K13 và đáp ứng của Plasmodium falciparum với dihydroartemisinin-piperaquin phosphat ở một số vùng sốt rét lƣu hành tại Việt Nam” đƣợc thực hiện nhằm các mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: 1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ học phân tử đột biến gen K13 của Plasmodium falciparum tại 5 tỉnh Bình Phƣớc, Gia Lai, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Quảng Trị năm 2016 – 2018. Đánh giá đáp ứng của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc dihydroartemisinin - piperaquin phosphat tại các điểm nghiên cứu.

Đánh giá nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với thuốc sốt rét bằng kỹ thuật in vitro tại Gia Lai. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 1. Sốt rét và một số yếu tố liên quan dịch tễ bệnh sốt rét Sốt rét là một bệnh truyền nhiễm lan truyền qua đƣờng máu gây nên bởi ký sinh trùng Plasmodium spp.

thông qua muỗi Anopheles cái đốt qua da và truyền các thoa trùng ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) vào máu. Bệnh sốt rét tồn tại trong cộng đồng cần có 3 yếu tố: Tác nhân gây bệnh KSTSR, muỗi Anopheles spp. truyền và quần thể ngƣời trong cộng đồng. Ngoài ra, còn một số yếu tố khác ảnh hƣởng đến sự tồn tại và phát triển của bệnh nhƣ môi trƣờng, kinh tế, xã hội.

Trong đó, nguồn bệnh là bệnh nhân sốt rét (BNSR), ngƣời mang KSTSR lạnh hay không triệu chứng. Sốt rét lan truyền từ ngƣời này qua ngƣời khác nhờ trung gian truyền bệnh, đó là muỗi Anopheles spp., có nhiều loại muỗi Anopheles spp. nhƣng hiện nay có ít nhất 62 loài có khả năng truyền bệnh sốt rét ở các vùng trên thế giới [4]. Theo tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) hiện nay có ít nhất 5 loài Plasmodium spp.

gây bệnh cho ngƣời đƣợc ghi nhận, trong đó nghiêm trọng nhất là P. falciparum, số còn lại P. knowlesi có thể gây thể bệnh nhẹ hơn và thƣờng ít dẫn đến tử vong (WHO, 2009) [101]. Việt Nam, có 2 loài chủ yếu P.

falciparum chiếm 60-70% trong cơ cấu, thƣờng gây sốt rét nặng, đa biến chứng và tử vong. vivax chiếm 30-40%, gây sốt rét cách nhật, tái phát xa, loài P. ovale có tỷ lệ thấp, riêng P. knowlesi mới phát hiện vào năm 2008 [4].

Tại Việt Nam có 3 vector chính gồm An. epiroticus và một số vector phụ nhƣ An. Muỗi đốt ngƣời có KST thể giao bào, tiếp đó giao bào phát triển thành thoa trùng trong cơ thể muỗi, khi đó muỗi đốt ngƣời và thoa trùng sẽ từ tuyến nƣớc bọt của 4 muỗi qua ngƣời [4]. Cơ thể cảm thụ gồm ngƣời lành, chƣa có miễn dịch sốt rét hoặc đã có miễn dịch nhƣng đã giảm thấp.

Tình hình mắc sốt rét trên thế giới và Việt Nam Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, ƣớc tính năm 2019 có khoảng 229 triệu trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét ở 87 quốc gia có sốt rét lƣu hành, giảm 3,78% so với năm 2000 (229/238 triệu). Tỷ lệ mắc bệnh sốt rét trên 1.000 dân số nguy cơ giảm từ 80 (năm 2000) xuống 58 (năm 2015) và 57 (năm 2019). Từ năm 2000 đến năm 2015, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét toàn cầu đã giảm 27,00% và từ năm 2015 đến năm 2019 số mắc giảm dƣới 2,00%, cho thấy tốc độ giảm đã chậm hơn sau năm 2015. Toàn cầu có 29 quốc gia có số mắc cao nhất chiếm 95,00%, trong đó có 5 quốc gia chiếm cao nhất nhƣ Nigeria (27,00%), Cộng hòa Congo (12,00%), Uganda (5,00%), Mozambique (4,00%) và Niger (3,00%) chiếm khoảng 51,00% tất cả các trƣờng hợp trên toàn cầu [107], [108].

Tại Khu vực Châu Phi ƣớc tính có khoảng 215 triệu trƣờng hợp bệnh sốt rét năm 2019 chiếm khoảng 94,00%; Mặc dù năm 2019 có số mắc thấp hơn so với năm 2000 (204 triệu) và tỷ lệ mắc bệnh sốt rét giảm từ 363 (năm 2000) xuống 225 trƣờng hợp (năm 2019) trên 1000 dân số nguy cơ; Tuy nhiên sự phức tạp về thay đổi lây truyền bệnh một cách nhanh chóng đó chính là sự gia tăng dân số. Dân số sống ở Khu vực Châu Phi tăng từ khoảng 665 triệu năm 2000 lên 1,1 tỷ ngƣời trong năm 2019 [107], [108]. Ở Khu vực Đông Nam Á có số mắc sốt rét chiếm khoảng 3,00% gánh nặng trên toàn cầu. Số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét giảm 73,00%, từ 23 triệu năm 2000 xuống còn khoảng 6,3 triệu năm 2019.

Tỷ lệ mắc bệnh ở khu vực này giảm 78,00%, từ khoảng 18 trƣờng hợp trên 1000 dân số chung năm 2000 còn 4 trƣờng hợp trong năm 2019 [107]. Ấn Độ đóng góp mức giảm tuyệt đối lớn từ 20 triệu trƣờng hợp năm 2000 xuống còn 5,6 triệu trƣờng hợp năm 2019. Sri Lanka đƣợc chứng nhận không có bệnh sốt rét trong năm 2015 và Timor-Leste báo cáo không có sốt rét trong năm 2018 và 2019 [107], [108]. 5 Các trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét ở Khu vực Đông Địa Trung Hải giảm 26,00%, từ khoảng 7 triệu ngƣời năm 2000 xuống còn 5 triệu trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét năm 2019.

Khoảng một phần tƣ số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét năm 2019 là P.vivax, chủ yếu ở Afghanistan và Pakistan. Trong giai đoạn 2000 - 2019, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét ở Khu vực Đông Địa Trung Hải giảm từ 20 xuống 10 trên 1.000 dân số nguy cơ. Sudan là nƣớc đóng góp hàng đầu cho bệnh sốt rét ở khu vực này, chiếm khoảng 46,00% trƣờng hợp. Quốc gia Iran không có sốt rét nội địa trong năm 2018 và 2019.

Khu vực Tây Thái Bình Dƣơng ƣớc tính có khoảng 1,7 triệu trƣờng hợp vào năm 2019, giảm 43,00% (1,7/3 triệu trƣờng hợp) so với năm 2000. Trong cùng kỳ, tỷ lệ mắc bệnh sốt rét giảm từ 5 xuống còn 2 trƣờng hợp trên 1000 dân số chung. Quốc gia Papua New Guinea chiếm gần 80% tổng số các trƣờng hợp bệnh ở khu vực này vào năm 2019. Trung Quốc không có trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét nội địa từ năm 2017.

Malaysia đã không có trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét trong năm 2018 và 2019 [108]. Tại Khu vực Châu Mỹ, số trƣờng hợp mắc bệnh sốt rét giảm 40,00% (từ 1,5 triệu xuống 0,9 triệu) và tỷ lệ mắc bệnh giảm 57,00% (từ 14 xuống 6). Tiến bộ của khu vực trong những năm gần đây đã bị sự gia tăng số mắc sốt rét ở Venezuela, nơi có khoảng 35.500 trƣờng hợp (năm 2000) tăng lên hơn 467. Brazil, Colombia và Venezuela chiếm hơn 86,00% tổng số mắc sốt rét ở khu vực này [107].

Việt Nam năm 2016 cả nƣớc có 4.161 bệnh nhân sốt rét , năm 2017 có 4.548 bệnh nhân, năm 2018 có 4813 bênh nhân và năm 2019 có 4.665 bệnh nhân đến năm 2020 số bệnh nhân mắc sốt rét giảm mạnh chỉ còn 1. Tỷ lệ cơ cấu ký sinh trùng P. falciparum tại tỉnh Bình Phƣớc năm 2016 có 715 trƣờng hợp chiếm 64,41%, tỉnh Khánh Hòa năm 2016 có 294 trƣờng hợp bệnh nhân P. tỉnh Gia Lai năm 2016 có 269 trƣờng hợp P.

falciparum chiếm 67,27%, tỉnh Ninh Thuận có 252 bệnh nhân P. falciparum chiếm 79,52%, tỉnh Quảng Trị có 46 bệnh nhân P. 6 Quảng trị Gia Lai Khánh Hòa Bình phƣớc Ninh Thuận Hình 1. Phân bố ký sinh trùng sốt rét năm 2016 tại Việt Nam 1.