MỞ ĐẦU 1. Đặt vẫn đề Nattokinase [EC 3.21] là một serin protease ngoại bào có khả năng làm tan huyết khối mạnh, được xem là một tác nhân có tiềm năng trong việc điều trị hiệu quả bệnh tắc nghẽn mạch máu [1,2]. Enzyme này đã được phát hiện từ các nguồn thực phẩm khác nhau như: Natto của Nhật [1], Doen-jang của Hàn Quốc hay từ Dauchi của Trung Quốc [3] và các loài vi sinh vật khác nhau mà quan trọng nhất đó là các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong các thực phẩm lên men truyền thống từ đậu nành [4]. Trong đó, chủng Bacillus subtilis natto là chủng vi khuẩn có kha năng sinh tong hợp nattokinase cao nhất [1].
Nattokinase có khả năng tiêu hủy fibrin bang con đường trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua quá trình hoạt hóa các yếu tô sinh plasminogen [5]. So với các loại protein khác có khả năng làm tan huyết khối như streptokinase, lumbrokinase thì nattokinase được xem là yếu tô có nhiều ưu việt hon vì khả năng phân hủy fibrin cao hơn, thời gian tác dụng dai hơn và gia thành rẻ hơn [6]. Kỹ thuật cô định enzyme và tế bao băng phương pháp bẫy nhốt trong gel đang được ứng dụng rộng rãi và đạt hiệu quả cao trong ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và xử lý môi trường [7]. Trong số các chất mang sử dung trong quá trình cô định tế bào thi alginate va chitosan được sử dụng nhiều do các chất mang này đều có ưu đi m nhẹ, dễ thực hiện va an toàn đối với người sử dung [8].
Tuy nhiên, cố định tế bao trong alginate có sự bất lợi đó là khi tế bào trong hạt gel cô định phát tri n mạnh thì dé dan đến hiện tượng hạt gel bị v , tế bào cố định sẽ thoát ra kh i mạng gel, lẫn vào môi trường lên men và số lần tái sử dụng hạn chế. Bên cạnh đó, quá trình cố định tế bào băng phương pháp bẫy nhốt trong mạng lưới gel chitosan có một số nhược đi m là do kích thước lỗ gel nh nên làm hạn chế sự khuếch tán chất dinh dư ng và sản phẩm trao đối chất qua lại giữa môi trường lên men và tế bào cô định trong hat gel. Đối với hạt gel alginate thường có độ ôn định không cao trong môi trường có chứa citrate va phosphate mà các chất nay thường được sử dụng như dung dịch đệm trong môi trường lên men. Ð khắc phục nhược đi m này thì tế bảo sau khi cỗ định bang calcium alginate sẽ được bao quanh bởi mang chitosan.
Sự kết hợp giữa nhóm amino của chitosan và nhóm cacbonat của alginate sẽ tạo nên độ bền cho mạng lưới gel, điều này sẽ giúp hạn chế sự thất thoát tế bảo và tăng số lần tái sử dụng của hạt gel chứa tế bào cỗ định [9. Ngoài ra, với ưu đi m về khả năng kháng khuẩn của chitosan trong môi trường lên men và ôn định ở nhiệt độ cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào Bacillus subtilis natto phát tri n mạnh [11]. Do vậy, chúng tôi dé xuất thực hiện dé tài “Có định té bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan dé lên men nattokinase”’. Mục tiêu nghiên cứu > Mục tiêu tông quát: Thu nhận nattokinase.
> Mục tiêu cụ th : - Tối ưu hóa quá trình có định tế bào Bacillus subtilis natto bang phức chất mang alginate — chitosan. - Khảo sát quá trình lên men nattokinase bởi tế bao Bacillus subtilis natto cô định. Đối tượng nghiên cứu Đôi tượng nghiên cứu tập trung vào: - C6 định tế bào Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate - chitosan. - Tiến hành lên men chế phẩm cố định đ xác định hoạt độ enzyme nattokinase tao thanh.
Nội dung nghiên cứu > Sang lọc các yêu tô ảnh hưởng đên quá trình cô định tê bào Bacillus subtilis natto. > Tối ưu hóa quá trình có định tế bao Bacillus subtilis natto bằng phức chất mang alginate — chitosan. > So sánh quá trình lên men nattokinase bởi tế bào cố định và tế bao tự do. > Khảo sát số lần tái sử dụng của tế bào có định.
Y nghĩa khoa học và thực tiễn Hiện nay trên thê giới cũng như ở Việt Nam, tỷ lệ mac các bệnh vê tim mạch liên quan đến huyết khói là rất cao. Do đó, nhu cầu sử dụng các loại thuốc làm tan huyết khối là rất lớn. Nattokinase là một trong những loại enzyme được xem là ưu việt nhất trong việc sử dụng điều trị và ngăn ngừa tinh trạng tắc nghẽn mạch máu. Tuy nhiên, việc sản xuất nattokinase chỉ mới dựa trên việc tối ưu hóa môi trường, điều kiện lên men và sản xuất nattokinase tái tổ hợp.
Việc kết hợp những ưu đi m của tế bảo cô định với các phương pháp tối ưu hóa môi trường và điều kiện lên men sẽ nâng cao được hiệu suất thu hồi enzyme sau quá trình lên men đồng thời sẽ tiết kiệm được chi phí sử dụng chủng giỗng Bacillus subtilis natto sử dụng trong lên men sản xuất nattokinase. CHUONG 1: TONG QUAN TÀI LIEU 1.1 Bacillus subtilis natto 1.1 Nguôn gốc Bacilus subfilis natto được giáo sư Swamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905. Bacillus subtilis natto có nhiều trongc khô, đậu nành. Ngoài ra, vi khuẩn này cũng phát tri n trong các loại đậu, các thực phẩm CÓ nguồn gốc từ động vật, thực vật khác nhau như tao bi n, cá, tôm, cua.
Bacillus subtilis natto không được thừa nhận như một loài độc lập. tuy nhiên khi sử dụng các chung Bacillus subtilis khác đ lên men môi trường đậu nành chín thì cũng không tạo thành natto giống như Bacillus subtilis natto [14].2 Đặc điểm phân loại và hình thái Hình 1.1: Đặc đi m hình thai cua Bacillus subtilis natto [15] Bacillus subtilis natto là trực khuẩn Gr(+), hiểu khí, nội bao tử hình que, có kích thước dưới lum, các tế bao vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành chuỗi. Khuan lạc khô, không màu, có kích thước lớn và hình dạng bất định, bề mặt hơi nhăn lan rộng trên bề mặt thạch nên trong quá trình nuôi cấy có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [13]. Bacillus subtilis natto là vi khuan hiểu khí nên trong quá trình nuôi cay cần phải cung cấp oxy, nó cóth phát tri n trong môi trường có nồng độ oxy >3%.
Nhiệt độ tối ưu là 39°C - 43°C, ở 55°C tế bào ngừng sinh trưởng, nhiệt độ tối ưu cho bảo tử nảy mam là 40°C. Bacillus subtilis natto phát trí n ở pH trung tính, sự nảy mam va phát tri n bị ức chế khi pH < 4,5 [13]. Bacillus subtilis là sinh vat dị dư ng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydrat cacbon: glucose, fructose, saccarose.trong đó saccarose là cần thiết cho vi khuẩn phát tri n va tạo ra chất nhớt cho sản phẩm. Bacillus subtilis natto cũng cần có biotin, trong môi trường nuôi cay không có biotin thì các tế bào sinh dư ng không phát tri n được và bào tử cũng không nảy mầm được.
Môi trường nuôi cây chứa vitamin B thích hợp cho sự phát tri n của bào tử [15,16].2 Đại cương về nattokinase 1.1 Giới thiệu chung về Nattokinase Nattokinase được bác sĩ Hyroyuki Sumi phát hiện vào năm 1980 khi ông tiến hành nghiên cứu khả năng làm tan cục máu đông của các loại thực phẩm. Ông đã sử dung khoảng 173 mẫu thực phẩm cho nghiên cứu của mình va phát hiện ra dịch chiết từ một loại sản phẩm truyền thống của Nhật Bản lên men từ đậu nành là loại thực phẩm có khả năng làm tan cục máu đông nhanh và mạnh nhất. Khi lay dịch chiết xuất từ natto nh lên trên cục huyết khối nhân tạo (sợi huyết) trong một đĩa Petri và giữ ở 37°C, cục huyết khối xung quanh natto hoa tan dan dan và hoan toàn tan trong 18 giờ. Bác sĩ Hyroyuki Sumi đặt tên la enzyme "nattokinase" có nghĩa "enzyme trong natto".
Nattokinase la enzyme có khả năng chống đông máu mạnh hơn cả các urokinase. Enzyme này đã được chứng minh là an toàn và được sử dụng ở Nhat Bản trong hơn 20 năm qua, có khả năng tăng cường va kéo dải tác dụng trong huyết tương khi sử dụng enzyme nảy thông qua đường miệng [17].1: Các đặc tính của Nattokinase [5] Tên protein Tên dé nghị: Subtilisin NAT, EC=3.62 Tên gen Tên: aprN Sinh vật Bacillus subtilis subsp.natto Nhan dang phan loai 86028 [NCBI] Dong phan loai Bacteria> Firmicutes>Bacillales> Bacillaceae> Bacillus Thuộc tính cua protein Chiéu dai chudi 275 AA Trạng thái chuỗi Hoàn chỉnh Xử lý chuỗi Trinh tự hi n thị tiếp tục được xây dựng tới lúc trưởng thành Sự tôn tại của protein Băng chứng ở mức độ protein Chú thích chung Chức năng Subtilisin là một protease ngoại bào, xúc tác thủy phân protein và các peptide amides. Subtilisin NAT cũng có tác dụng thủy phan fibrinolytic. Hoạt động xúc tác Thủy phân protein với độ đặc hiệu rộng rãi cho các liên kết peptide.
Câu trúc ti u đơn vi Monomer Vị trí dưới té bao Chưa khám phá ra Chuỗi tương tự Thuộc về họ peptide S8 Đặc tính hóa sinh Tham số động học: Km=0.48mM cho Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 1.2 Cau trúc của nattokinase Nattokinase (subtlisin NAT, NK) là một loại enzyme có kha năng phân hủy sợi huyết, được phân lập từ một loại thực phẩm truyền thống của Nhật Ban có tên là “Natto”’. Nattokinase là một serine protease gồm 275 acid amin, có khối lượng phân tử là 27,7 kDa [12]. Nattokinase là một protease serin, trung tâm hoạt động là bộ 3 xúc tác gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His 64 và nhóm cacboxyl của Asp 32. Cơ chất đặc hiệu của nattokinase là cơ chất đặc hiệu chung của subtilisin: Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA.
Nattokinase 6n định trong khoảng pH từ 6 - 10 và nhiệt độ 30 - 60°C, mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°C. Enzyme nay có đi m đăng điện là pI = 8 [12]. l AOSVPYGISO IKAPALHSQG YTGSNVKVAV IDSGIDSSHP DLNVRGGASF VPSETNPYQD 6l GSSHGTHVAG TIAAILNNSIG VIGVAPSASI YAVKVLDSTG SGOYSWIING IEWAISNNMG 121 VINMSLGGPS GSTALKIVVD KAVSSGIVVA AAAGNEGSSG SSSTVGYPAK YPSTIAVGAV 181 NSSNOQRASFS SAGSELDVMA PGVSIOSTLP GGTYGAYNGT SMATPHVAGA AALILSKHIPT 241 WITNAOVRDRL ESTATYLGNS FYYGKGLINV QAAAO Hình 1.2: Cau trúc bậc 1 của nattokinase [12] 1.3 Tác dụng và cơ chế tác dụng Nattokinase |A 4- Tissue Plasminogen Activator (t-PA) | Hình 1.4: Các hiệu ứng sinh ly của nattokinase lên fibrin [5]. Nattokinase có đặc đi m sinh học giống như plasmin, phân hủy fibrin trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua 3 con đường (hình 1.
- Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp (A). - Nattokinase tăng cường plasmin thông qua hoạt hóa prourokinase (nội sinh) thành urokinase (B). - Nattokinase làm tăng nồng độ t-PA (tissue plasminogen activators- yếu tố hoạt hóa plasminoge) (C) [5,18].3 Có định tế bao Cố định tế bào là sự giới hạn về vật lý hoặc định vi của các tế bào nguyên vẹn ở một khu vực không gian nhất định nhưng vẫn giữ được hoạt tính xúc tác của chúng và có th sử dụng nhiều lần.