Đặt vấn đề Cây ngô (Zea mays L.) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới. Ở Việt Nam, ngô là cây trồ ng quan tr ọng thứ hai sau lúa gạo. Hạt ngô chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc. Trong những năm gần đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn nuôi và công nghiệp chế biến.
Hạt ngô cũng như các loại ngũ cốc khác dễ bị mọt xâm hại. Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch.) là loại đa thực, chúng có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác. Thức ăn thích hợp nhất với mọt là hạt ngô và gạo. Mọt trưởng thành dùng vòi khoét một lỗ sâu vào hạt, rồi đẻ trứng ở đó và tiết ra một thứ dịch nhầy để bít kín lỗ đó lại.
Sâu non nở ra trong hạt ngô, thường ăn phôi trước, sau đó mới đến nội nhũ và các bộ phận khác làm cho hạt chỉ còn lại một lớp vỏ mỏng. Khi đẫy sức, sâu non đục những lỗ nhỏ lộ rõ trên hạt để vũ hoá bay ra ngoài [16]. Defensin thực vật là peptide cation và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩn. Defensin thực vật hoạt động sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh protein màng, làm suy yếu vi sinh vật, tăng cường khả năng chống chịu kẽm, làm thay đổi trạng thái oxi hoá khử ascorbic acid và đặc biệt ức chế hoạt động của α-amylase ở côn trùng [16].
Liu và cs (2006) đã phân lập defensin 1 từ cây đậu xanh (VrD1) và chứng minh được vai trò chống côn trùng, kháng mọt của protein VrD1. VrD1 ức chế hoạt động của α-amylase cho nên kìm hãm sự tiêu hóa tinh bột trong ruột mọt [23]. Năm 2008, Pelegrini và cs đã thông báo phân lập protein defensin1 từ cây đậu đũa (VuD1) có khả năng ức chế hoạt động của α- amylase ở ấu trùng mọt [25]. Các giống ngô lai cho năng suất cao nhưng sản lượng, giá thành, chất lượng bị giảm nhiều do hạt của các gi ống ngô này rất dễ bị mọt xâm hại.
Hiê ̣n nay, nhiề u bi ện pháp bảo quản hạt ngô sau thu hoạch đã đươ ̣c áp du ̣ng , nhưng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3 tốn thời gian, hiệu quả thấp và tổn thất sau thu hoạch vẫn rất lớn. Nghiên cứu ứng dụng công ngh ệ sinh học hiện đại tạo giống ngô kháng mọt đang được nhiều nhà khoa học quan tâm , trong đó có chi ến lược tạo cây ngô chuyển gen kháng mọt ở Việt Nam. Do vậy viê ̣c nghiên cứu xây dựng quy trình chuyể n gen ở cây ngô làm cơ sở cho viê ̣c chuyể n thành công gen defensin vào giống ngô Việt Nam phục vụ tạo dòng ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt cao là rất cần thiết. Xuấ t phát từ những lý do trên chúng tôi đã xây dựng và thực hiê ̣n đ ề tài luâ ̣n văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu chuyển gen gus vào giố ng ngô LVN 99 Viê ̣t Nam”.
Mục tiêu nghiên cứu Xác định được tuổi phôi non thích hợp cho biến nạp gen thông qua A. tumefaciens và đề xuất được quy trình chuyển gen ở cây ngô. Nội dung nghiên cứu 3. Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của tuổi phôi ngô non phu ̣c vu ̣ chuyể n gen và ảnh hưởng của mâ ̣t đô ̣ tế bào vi khuẩ n A.
tumefaciens, nồ ng đô ̣ acetosyringone (AS), nồ ng đô ̣ kanamycin và thời gian nhiễm khuẩ n đến hiệu quả chuyể n gen gus ở giống ngô lai LVN99. Nghiên cứu chuyể n gen gus và tạo cây ngô chuyển gen từ giống ngô lai LVN99. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Về khoa ho ̣c , kế t quả nghiên cứu đã xác đ ịnh được tuổi phôi non thích hợp đố i với sự tá i sinh in vitro và hoàn thi ện quy trình tái sinh từ phôi ngô non phục vụ chuyển gen ở ngô. Chuyển thành công gen gus và đề xuất quy trình chuyển gen vào giống LVN99.
Về thực tiễn, kế t quả chuy ển thành công gen gus và tạo cây ngô chuyển gen là cơ sở của việc ứng dụng quy trình chuyển gen ở ngô nhằm tạo cây ngô chuyể n gen có sự tăng cường khả năng chố ng chiụ các stress từ ngoa ̣i cảnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nguồn gốc, đặc điểm sinh học của cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ hoà thảo (Gramineae), bộ hoà thảo (Graminales).
Từ loài Zea mays Line, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài, ngô được phân thành các loài phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm. Căn cứ vào hầu hết các kết quả khảo cổ học, các dẫn liệu lịch sử và tế bào học.
cho thấy ngô có nguồn gốc từ châu Mỹ. Tuy nhiên dạng ngô dại hiện không còn tồn tại nên có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc di truyền của cây ngô. Điều quan trọng nhất là hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước [32]. Cơ quan sinh dưỡng của cây ngô gồm rễ, thân, lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể.
Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành cây mầm. Cây mầm chủ yếu sử dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phận phía trên hạt phát triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm.
Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá mầm. Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Ngô là cây có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hoà thảo. Hệ rễ có 3 loại: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng.
Ngô ra lớp rễ đốt đầu tiên lúc 3- 4 lá mầm và mọc theo thứ tự từ dưới lên trên. Rễ đốt giúp cho cây ngô hút nước và dinh dưỡng. Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, bám chặt vào đất và tham gia vào hút nước và thức ăn cho cây. Số lượng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống.
Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của cây. Thân cây ngô thường phát triển mạnh, thẳng, cứng, dạng bền chắc. Thân chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần từ dưới lên. Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau.
Độ lớn và số lá ngô dao động từ 6 – 22 là tuỳ thuộc vào giống và điều kiện tự nhiên. theo hình thái và vị trí lá trên cây, lá ngô được chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi. Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá, thìa lá. Trên lá có rất nhiều khí khổng.
Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán. Bắp ngô phát sinh từ mầm nách lá trên thân. Số mầm nách lá trên thân nhiều nhưng chỉ 1 – 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc, thời vụ mà số bắp trên cây, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu và trỗ cờ.
là khác nhau. Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phận chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ (Hình 1. Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô. Vỏ hạt bao bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tuỳ thuộc vào từng giống.
Nằm sau lớp vỏ hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là bộ phận chính chiếm 70- 78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngoài ra có chứa protein, lipit, vitamin, khoáng và enzym để nuôi phôi phát triển. Phôi ngô lớn (chiếm 8- 15%) nên cần chú trọng bảo quản [32]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.
Sơ đồ hạt ngô bổ dọc [43]. Các chất trong hạt ngô dễ được đồng hoá nên có giá trị dinh dưỡng cao. Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô nếp (68% so với 65%) và được chia thành tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng).
Ngô nếp được cấu tạo hoàn toàn từ amilopectin nên có độ dẻo hơn ngô tẻ. Hàm lượng lipit cao thứ hai trong các loại hạt ngũ cốc (3,5- 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điệu kiện tự nhiên. Lipit được tập trung ở phôi và tầng alơron. Dầu ngô chứa đến 50% axit linoleic liên kết với các glyxerit, axit oleic, panmitic, rixinic.
Hàm lượng lipit là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt. Phôi ngô chiếm 1/3 thể tích của hạt và gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dưới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [32]. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Ngô là cây có địa bàn phân bố rộng rãi nhất.
Trong những năm gần đây, diện tích ngô trên toàn thế giới tăng lên gấp rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần. Diện tích, sản lượng và năng suất ngô trên thế giới có xu hướng tăng qua các năm từ niên vụ 2001 – 2002 đến niên vụ 2014 – 2015. Diện tích từ 173,3 triệu ha trong niên vụ 2001 - 2002 tăng lên 177,4 triệu ha trong niên vụ 2013 – 2014, tăng 29% trong vòng 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.vn LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 niên vụ. Năng suất cũng tăng 26% trong giai đoạn 2001 – 2013.