CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Cấu trúc và tính chất của melamine Melamine (1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) còn được gọi là cyanuaramide hay triaminotriazine, là hợp chất hữu cơ bazo được cấu thành từ ba phân tử CN2H2, trong đó nguyên tố N chiếm 66% khối lượng. Cấu trúc của phân tử melamine được thể hiện trên hình 1.1: Cấu trúc của phân tử melamine Melamine kết tinh dưới dạng lăng trụ đơn nghiêng không màu, độ hoà tan trong nước và dung môi hữu cơ thấp. Một dung dịch nước bão hoà ở 20 ºC chứa ít hơn 1% melamine và một dung dịch ở 90–100 ºC chứa ít hơn 5% [1].
Melamine có thể thủy phân trong kiềm thành ammeline, ammelide và cyanuric acid [2]. Vào năm 1834, Liebig đã điều chế melamine lần đầu tiên bằng cách đun nóng potassium thiocyanate với ammonium chloride. Melamine có thể được tạo ra từ guanidine carbonate, thiourea, cyanamide, hoặc dicyandiamide [3]. Ngày nay, quy trình sản xuất melamine thường sử dụng urê để điều chế.
Độc tính của Melamine Thành phần melamine chứa 66% nitơ, do đó nó đã được các nhà sản xuất thức ăn gia súc thêm vào như một nguồn nitơ phi protein vào năm 1958. Nhưng việc sử dụng hoá 1 chất này đã bị ngừng lại vào năm 1978, vì nó bị thủy phân không hoàn toàn trong động vật nhai lại [4]. Phương pháp Kjeldahl là phương pháp được sử dụng để đo tổng hàm lượng nitơ có trong mẫu. Lợi dụng điều này, những nhà sản xuất thực phẩm (sữa công thức cho trẻ sơ sinh, sữa chua, kẹo, bánh quy, thức ăn vật nuôi) đã sử dụng một lượng melamine nhằm mục đích làm giả hàm lượng protein, giảm chi phí sản xuất và tăng mức lợi nhuận [5].
Khi thêm 1 g melamine vào 1 L sữa, hàm lượng protein sẽ tăng lên 0,4%. Đối với sữa bột, lượng melamine có thể hoà tan nhiều hơn khi sử dụng nước ấm để pha sữa [6]. Vào năm 2007, melamine đã trở thành chủ đề đáng chú ý khi nó được các nhà khoa học thú y xác định thức ăn cho vật nuôi nhiễm melamine là nguyên nhân khiến hàng trăm vật nuôi tử vong. Thức ăn cho vật nuôi được thử nghiệm từ đợt bùng phát này có chứa melamine và cyanuric acid [7, 8].
Hàm lượng melamine tìm thấy trong một số thực phẩm được kiểm tra dao động từ 10 đến 3,200 ppm (1 ppm tương đương 1 mg/kg nguồn thực phẩm). Ước tính mỗi ngày, vật nuôi ăn khoảng 360 đến 430 mg/kg [8]. Một số nghiên cứu trên động vật đã được thực hiện để xác định độ an toàn của melamine và cyanuric acid. Trong một nghiên cứu, mèo được cho ăn melamine, cyanuric acid hoặc cả hai với liều lượng tăng dần.
Những con mèo chỉ được cho ăn một hợp chất không bị suy thận hoặc tinh thể nước tiểu chứa 181 mg/kg trọng lượng cơ thể đối với melamine hoặc ở liều 243 mg/kg trọng lượng cơ thể đối với cyanuric acid. Tuy nhiên, những con mèo được cho ăn cả hai hợp chất này lại mắc bệnh sỏi tiết niệu với liều 32 mg/kg trọng lượng cơ thể của melamine và cyanuric acid [9]. Cấu trúc liên kết hydro của melamine và cyanuric acid có thể dẫn đến sự hình thành tinh thể và sỏi trong thận như thể hiện ở hình 1.2: Cấu trúc liên kết hydro của melamine và cyanuric acid có thể dẫn đến sự hình thành tinh thể và sỏi trong thận 2 Tuy nhiên, vào năm 2008 đã có một sự kiện chấn động, thu hút rất nhiều sự chú ý của người dân trên toàn thế giới. Đó là việc phát hiện ra trong sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh có chứa hàm lượng melamine rất cao.
Điều này đã khiến cho khoảng 294000 trẻ sơ sinh ở Trung Quốc bị ảnh hưởng, với hơn 51900 ca nhập viện và 6 ca tử vong [12]. Sau khi uống sữa, các triệu chứng xuất hiện sau 3 đến 6 tháng. Sỏi đã được mang đi phân tích thì cho thấy các tinh thể melamine-urate với lượng gần bằng nhau mà không có bằng chứng về cyanuric acid. So với người lớn, trẻ sơ sinh bài tiết lượng uric acid gấp 5 đến 8 lần, một yếu tố có khả năng dẫn đến sự hình thành sỏi melamine-urate [13].
Trẻ sơ sinh mắc các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh, bệnh bạch cầu, ung thư hạch hoặc các bệnh khác làm tăng tiết uric acid có thể làm tăng nguy cơ hình thành sỏi từ melamine [14]. Liên kết hydro có thể có của melamine và urate có thể dẫn đến hình thành sỏi ở trẻ sơ sinh ăn phải sữa công thức bị ô nhiễm được trình bày ở hình 1.3: Liên kết hydro có thể có của melamine và urate có thể dẫn đến hình thành sỏi ở trẻ sơ sinh ăn phải sữa công thức bị ô nhiễm Theo báo cáo của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), cơ sở để xác định mức độ melamine được đặt ở mức 50 ppb. Mức 50 ppb thể hiện ước tính thận trọng về giới hạn phát hiện (LOD) đối với các phương pháp được sử dụng, một giá trị đảm bảo được mức độ phơi nhiễm là an toàn. FDA đã nêu rõ melamine không được phép bổ sung trực tiếp vào thực phẩm cho người hoặc động vật và không nhà sản xuất nào được phép cố tình thêm nó vào bất kỳ thực phẩm nào cho người tiêu dùng Hoa Kỳ.
FDA Hoa Kỳ sẽ kiểm tra các sản phẩm có chứa protein ngoài sữa và các sản phẩm có chứa sữa để xem có bị nhiễm melamine và các hợp chất liên quan đến melamine hay không [15]. Theo báo cáo Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) đã sử dụng TDI là 0,5 mg.kg−1 trọng lượng cơ thể, là mức bảo vệ khỏi phơi nhiễm trong suốt cuộc đời. Điều này xem xét các tác động có thể có của việc tiếp xúc với melamine trong một thời gian tương đối ngắn, và những tác động như vậy có thể xảy ra khi tiêu thụ nhiều lần các sản phẩm bị nhiễm melamine. Do hàm lượng melamine cao có thể ảnh hưởng chủ yếu đến thận, EFSA đã áp dụng TDI là 0,5 mg.kg−1 trọng lượng cơ thể đối với melamine trong 3 một trường hợp nhiễm độc cụ thể vào năm 2007.
Liên minh Châu Âu cấm hoàn toàn tất cả sữa sản xuất tại Trung Quốc và các sản phẩm liên quan [16]. Theo Cơ quan An toàn Thực phẩm New Zealand (NZFSA) đã áp dụng ngưỡng bảo toàn là 5 ppm đối với hầu hết các loại thực phẩm vào ngày 26 tháng 9 năm 2008. Điều này cho thấy rằng thực phẩm chứa tới 5 ppm melamine không gây rủi ro cho sức khỏe con người. Tuy nhiên, đối với sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh, mức tối đa vẫn giữ nguyên như mức phát hiện hiện tại là 1 ppm.
Đối với thực phẩm làm từ sữa ở dạng cuối cùng, không phải là sữa công thức dành cho trẻ sơ sinh mức này là 2,5 ppm [17]. Tại Việt Nam sau khi WHO đưa ra mức khuyến cáo về thức ăn hàng ngày chấp nhận được đối với các thực phẩm nhiễm melamine 0,2 mg/kg trọng lượng cơ thể thì vào ngày 11/12 Bộ Y Tế đã ban hành quyết định: Thực phẩm dành cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi không vượt quá 1 mg/kg thực phẩm (≤ 1 ppm). Các loại thực phẩm khác không vượt quá 2,5 mg/kg thực phẩm (≤ 2,5 ppm) [18]. Các cách để phát hiện melamine Ngày nay, có rất nhiều cách để phát hiện ra melamine và các hợp chất liên quan như phương pháp sắc ký lỏng (LC), phương pháp sắc ký khí (GC), xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết với Enzyme (ELISA), polymer in dấu phân tử (MIP), điện di mao quản [19], phương pháp phát hiện điện hoá, đo quang phổ… Bảng 1.1: So sánh các phương pháp phát hiện melamine hiện nay Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Tiền xử lý mẫu LC và GC kết Phương pháp xác nhận hiệu quả nhất để phân Giá thành cao hợp với MS tích melamine và các hợp chất liên quan Tốn nhiều thời gian Cho ra kết quả nhanh hơn Để chắc chắn hơn thì cần ELISA Đơn giản phải được kiểm tra lại Chi phí thấp Phương pháp phân tích hiệu quả Điện di mao Tiết kiệm chi phí Dùng cho các chất có thể quản Tốc độ tách nhanh điện li Các bước tiền xử lý không phức tạp Độ nhạy cao Tốn nhiều thời gian để Cảm biến Khả năng chọn lọc với phân tử mục tiêu lớn.
tính toán hàm lượng sử MIP Thời gian nhanh chóng dụng. Không cần tiền xử lý phức tạp 4 Tuy nhiên, vẫn có một số khó khăn chung khi phân tích melamine như độ hòa tan của phức hợp melamine-cyanuric acid, ô nhiễm nền và một số phương pháp vẫn cần phải kiểm tra lại. Chính vì thế, cần phải giải quyết những khó khăn này, nghiên cứu và cải tiến các phương pháp sàng lọc di động, đơn giản và có độ chính xác cao [20]. Polymer in dấu phân tử (Molecularly imprinted polymer) 1.
Khái niệm Cùng với sự phát triển của công nghiệp hoá, hiện đại hoá, hàng loạt những chất ô nhiễm độc hại như thuốc nhuộm, thuốc trừ sâu, kim loại nặng, các chất độc trong thực phẩm,… đã và đang dần xuất hiện ngày càng nhiều và được thải ra ngoài môi trường hay đi dần vào cơ thể con người. Chỉ với một lượng rất nhỏ, chúng có thể gây ra ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khoẻ thậm chí là gây ra tử vong. Chính vì thế, các nhà khoa học vẫn luôn tìm và phát triển một công cụ có thể xác định nhanh chóng, có tính đặc hiệu cao với phân tử mục tiêu. Kỹ thuật in dấu phân tử chính là một trong những công cụ sáng giá và được phát triển gần đây.
Công nghệ in dấu ấn phân tử (Molecularly Imprinted Technology-MIT) là một kỹ thuật thiết kế các thụ thể nhân tạo với độ chọn lọc và độ đặc hiệu được xác định trước đối với một chất phân tích nhất định [21]. Polymer in dấu phân tử (MIP) là thụ thể nhân tạo của các phân tử mục tiêu và hoạt động tương tự như hệ thống kháng nguyên − kháng thể tự nhiên. Nói cách khác, cơ chế của chúng giống như “ổ khoá và chìa khoá”[22]. Những thành phần chính để tạo nên các MIP là khuôn mẫu (template), monomer chức năng, chất liên kết chéo và chất khơi mào.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để chế tạo MIP như tổng hợp MIP từ monomer với sự có mặt của khuôn mẫu, đảo pha sử dụng kết tủa polymer bằng cách thêm dung môi không tương thích hoặc làm bay hơi dung môi từ dung dịch polymer cộng với khuôn mẫu và in khắc mềm hoặc dập bề mặt [23].