Nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp và khả năng phân hủy nhựa PET của enzyme Petase trong E. coli

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. MỞ ĐẦU

2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1. Khái niệm nhựa PET

2.2. Cấu tạo của nhựa PET

2.3. Tính chất của nhựa PET

2.4. Ứng dụng của nhựa PET

2.5. Tình hình sử dụng nhựa PET

2.6. Tái chế nhựa PET phế thải

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng nghiên cứu

3.2. Vật liệu sinh học

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp thu thập thông tin lựa chọn gen mã hóa protein PETase, tối ưu mã biểu hiện

3.3.2. Nhân gen petase bằng kỹ thuật PCR

3.3.3. Tách dòng gen mã hóa PETase

3.3.4. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt

3.3.5. Tách chiết DNA từ các tế bào E.

3.3.6. Điện di DNA trên gel agarose

3.3.7. Tách chiết DNA ra khỏi gel agarose

3.3.8. Xác định trình tự gen bằng máy phân tích trình tự gen tự động

3.3.9. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hoá cho PETase

3.3.10. Biểu hiện PETase ở E.

3.3.11. Khảo sát các điều kiện biểu hiện PETase ở E.

3.3.12. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE và Western Blot

3.3.13. Tinh chế protein nội bào bằng sắc kí ái lực Ni-NTA

3.3.14. Thu nhận protein ngoại bào bằng tủa muối và tủa acetone

3.3.15. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

3.3.16. Đánh giá hoạt tính phân hủy PET của enzyme tái tổ hợp

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen mã hóa enzyme PETase

4.2. Thu thập thông tin, tối ưu mã biểu hiện của gen mã hóa PETase

4.3. Tách dòng gen mã hóa protein PETase

4.4. Thiết kế các vector biểu hiện protein PETase

4.5. Biểu hiện PETase tái tổ hợp ở E.

4.6. Biểu hiện PETase ngoại bào

4.7. Biểu hiện PETase nội bào

4.8. Nhận diện PETase bằng phản ứng Western-blotting

4.9. Khảo sát điều kiện biểu hiện tối ưu PETase nội bào

4.10. Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng tới sự biểu hiện protein PETase

4.11. Khảo sát nồng độ cảm ứng IPTG ảnh hưởng tới khả năng biểu hiện PETase

4.12. Tinh sạch PETase nội bào bằng sắc ký ái lực Ni-NTA

4.13. Đánh giá khả năng phân hủy nhựa PET của PETase ngoại bào

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về enzyme Petase

Enzyme Petase, được phát hiện từ Ideonella sakaiensis, là một enzyme thủy phân có khả năng phân hủy nhựa polyethylene terephthalate (PET) thành các sản phẩm đơn phân như terephthalate (TPA) và ethylene glycol (EG). Enzyme này có hoạt tính phân hủy PET ở điều kiện sinh lý, cụ thể là ở nhiệt độ từ 20 đến 40 độ C và pH 7, cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn trong việc xử lý rác thải nhựa. Theo nghiên cứu của Yoshida và cộng sự (2016), Petase có khả năng phân hủy PET cao hơn từ 5 đến 120 lần so với các enzyme khác. Điều này mở ra hướng đi mới trong việc tái chế nhựa PET mà không cần điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ và áp suất cao. Việc nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp enzyme Petase trong E. coli không chỉ giúp tăng cường sản xuất enzyme mà còn tạo ra các ứng dụng thực tiễn trong lĩnh vực sinh học môi trường.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp sinh học hiện đại để tối ưu hóa quá trình biểu hiện tái tổ hợp enzyme Petase trong E. coli. Đầu tiên, gen mã hóa cho enzyme Petase được nhân lên bằng kỹ thuật PCR và sau đó được tách dòng vào hệ thống vector pET. Việc biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli được thực hiện bằng phương pháp sốc nhiệt, cho phép E. coli sản xuất enzyme một cách hiệu quả. Các điều kiện khả năng phân hủy của enzyme được khảo sát thông qua các thí nghiệm với màng film PET. Kết quả cho thấy enzyme Petase có khả năng phân hủy PET cao, mở ra cơ hội ứng dụng enzyme này trong việc xử lý rác thải nhựa. Các kết quả thu được từ quá trình nghiên cứu không chỉ có giá trị trong lĩnh vực sinh học mà còn đóng góp vào các giải pháp xử lý ô nhiễm môi trường.

III. Kết quả và thảo luận

Kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme Petase tái tổ hợp có khả năng phân hủy nhựa PET hiệu quả. Qua các thí nghiệm, enzyme này đã chứng minh được khả năng phân rã PET ở điều kiện sinh lý, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường do rác thải nhựa. Việc phân tích enzyme và khảo sát các điều kiện biểu hiện cho thấy enzyme Petase có thể được sản xuất với độ tinh khiết cao, từ đó có thể sử dụng cho các ứng dụng trong xử lý rác thải nhựa. Đặc biệt, khả năng phân hủy của enzyme này ở điều kiện tự nhiên là một điểm cộng lớn, giúp giảm thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường. Kết quả này khẳng định giá trị thực tiễn của nghiên cứu, góp phần vào việc phát triển công nghệ sinh học trong xử lý rác thải nhựa.

IV. Tính ứng dụng và triển vọng

Nghiên cứu về enzyme Petase không chỉ cung cấp kiến thức sâu sắc về khả năng phân hủy nhựa PET mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các giải pháp sinh học cho ô nhiễm rác thải nhựa. Với khả năng phân hủy PET ở điều kiện sinh lý, enzyme Petase có thể được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp tái chế nhựa. Việc phát triển công nghệ enzyme sẽ giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo ra các sản phẩm có giá trị từ rác thải nhựa. Hơn nữa, nghiên cứu này còn góp phần vào việc nâng cao nhận thức về ô nhiễm nhựa và thúc đẩy các chính sách bảo vệ môi trường hiệu quả hơn.

Luận văn thạc sĩ về biểu hiện tái tổ hợp và khả năng phân hủy nhựa PET của enzyme Petase trong E. coli