MỞ ĐẦU Ô nhiễm rác thải nhựa được xem như là một trong những thách thức lớn nhất của thế kỉ XXI, gây ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe các sinh vật và đòi hỏi những nỗ lực xử lý kịp thời nhằm giảm tải các tác hại của chúng trên toàn cầu. Chiếm thị phần lớn trong ngành nhựa, polyethylene terephthalate (PET) đã và đang thu hút nhiều sự quan tâm của giới chuyên môn trong việc nghiên cứu tìm ra phương thức tiêu hủy, tái chế tối ưu. Những phương pháp xử lý hóa – lý truyền thống bộc lộ nhiều khuyết điểm như: đòi hòi điều kiện về nhiệt độ, áp suất cao; tiêu tốn nhiều năng lượng và chi phí; thậm chí có thể gây ra ô nhiễm thứ phát. Gần đây, phương pháp tái chế sinh học (sử dụng các chất xúc tác sinh học như các enzyme thủy phân- hydrolase) đã mở ra con đường mới trong việc xử lý nhựa PET phế thải một cách hiệu quả, nhẹ nhàng và thân thiện với môi trường.
Cho đến nay, nhiều enzyme thủy phân PET (PET hydrolase) đã được nhận biết như: esterases, lipases hoặc cutinases, trong đó, enzyme cutinase chiếm chủ yếu. Trừ một số ngoại lệ thuộc nhóm cutinase, đa số các enzyme PET hydrolase chỉ có khả năng biến đổi bề mặt của PET mà không thể phá vỡ cấu trúc khối tảng PET. Thêm vào đó, những cutinase này có thể phân rã nhựa PET đến một vài mức độ nhưng phải thực hiện ở 50oC còn ở nhiệt độ phòng không đạt hiệu quả. Năm 2016, một phát hiện mới của Yoshida và cộng sự về một loài vi khuẩn (Ideonella sakaiensis 201-F6) đã sản sinh ra enzyme poly(ethylene terephthalate) hydrolase (được đặt tên là PETase; EC 3.101) có thể phá vỡ các liên kết ester, phân rã PET thành sản phẩm đơn phân (monomer) là terephthalate (TPA) and ethylene glycol (EG) ở nhiệt độ từ 20 đến 40oC.
Đáng chú ý là PETase có hoạt tính phân rã cấu trúc polymer của màng film PET ở điều kiện sinh lý (30oC, pH 7) cao hơn rất nhiều (từ 5-120 lần) so với các enzyme phân rã PET ưa nhiệt tương đồng đã được báo cáo trước đó. Chính vì vậy, PETase đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm và được nhìn nhận như một công cụ đầy hứa hẹn cho phân hủy rác thải nhựa PET. coli cũng được xem xét sử dụng để biểu hiện protein PETase tái tổ hợp vì thao tác đơn giản, khả năng biểu hiện tốt, thời gian ngắn và chi phí thấp. coli, các peptide tín hiệu đầu-cuối chẳng hạn như: pelB, ompA, phoA, maIE, lamB và ompC,.
làm trung gian cho sự chuyển vị của các protein qua màng tế bào chất, thường được sử dụng để sản xuất protein tiết ngoại bào. Xuất phát từ thực tiễn và tiềm năng xử lý môi trường của loại enzyme này, đề tài “Nghiên cứu biểu hiện tái tổ hợp trong E. coli và đánh giá khả năng phân hủy nhựa PET của enzyme PETase” được thực hiện nhằm tạo ra enzyme có khả năng khử trùng hợp trên màng film PET, tiết trực tiếp ra ngoài môi trường mà không cần trải qua phá tế bào. Bên cạnh đó, PETase tiết nội bào cũng được nghiên cứu để tối ưu khả năng biểu hiện và 2 tạo ra nguồn protein với độ tinh khiết cao làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo.
Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu tạo ra enzyme PETase tái tổ hợp có khả năng phân hủy nhựa PET nhằm ứng dụng trong việc xử lý rác thải nhựa. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thiết kế tối ưu và tổng hợp gen mã hóa cho PETase nhằm mục đích biểu hiện, sản xuất protein tái tổ hợp ở E. Nội dung 2: Nghiên cứu tạo các enzyme PETase tái tổ hợp ở E. Nội dung 3: Đánh giá khả năng phân rã PET của các enzyme tái tổ hợp trên màng film PET.
Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài Các mảnh vụn của chất thải nhựa, đặc biệt là vi nhựa, có thể gây hại cho sinh vật và đe dọa đến cuộc sống, sức khoẻ của con người. Do đó, việc phát triển các công nghệ tiên tiến để xử lý và tái chế nhựa sau tiêu dùng nhằm đạt được cả giá trị về kinh tế và bảo vệ môi trường là đặc biệt quan trọng. Phương pháp tái chế sinh học sử dụng enzyme thủy phân được chứng minh mang lại hiệu quả phân hủy tốt và không gây ô nhiễm thứ phát. Việc tách dòng, biểu hiện PET hydrolase (PETase) tái tổ hợp tiết ngoại bào có hoạt tính phân cắt các liên kết ester của chuỗi polyethylene terephthalate ở điều kiện sinh lý (30oC, pH 7) đã cung cấp cơ sở khoa học, quy trình sản xuất protein tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực xử lý môi trường.
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Khái niệm nhựa PET PET là tên viết tắt của Polyethylene terephthalate, còn biết đến với nhiều tên gọi khác như PETE hoặc PETP hoặc PET-P, được hình thành từ phản ứng trùng hợp giữa các monomer ethylen terephtalat với công thức hóa học C10H8O4. Nó là một loại nhựa trong, dẻo, bền, nhẹ thuộc họ polyester [1]. Mã nhận diện nhựa PET 1.
Cấu tạo của nhựa PET Polyethylene Terephthalate được hình thành từ các acid trung gian terepthalic (TPA) và ethylene glycol (EG). Công thức cấu tạo của Polyethylene terephthalate [1] 1. Tính chất của nhựa PET Nhựa polyester chứa các đặc tính tuyệt vời như: độ bền cơ học, kháng hóa chất, ổn định về mặt hóa học. Về tính chất quang học, PET là một loại polymer nhiệt dẻo không màu và các đặc tính của PET được quyết định bởi quá trình xử lý nhiệt.
Nó có thể tồn tại ở các dạng: vô định hình (amorphous), kết tinh (crystalline) và bán kết tinh (semi-crystalline) [2]. Ở dạng vô định hình, các phân tử của PET sắp xếp không có trật tự, trong suốt. Ở dạng kết tinh, các phân tử sắp xếp theo một trật tự nhất định, màu đục (không trong suốt), tính chịu nhiệt và độ bền cao hơn so với dạng vô định hình. Sự mất đi độ trong suốt như vậy 4 trong các vật liệu polymer kết tinh là do sự hình thành các quả cầu tinh thể làm tán xạ ánh sáng [3].
Dạng bán kết tinh có màu đục, cấu trúc tinh thể có 50% kết tinh. Về tính chất cơ học, độ bền kéo của màng PET tương đương màng nhôm và gấp ba lần màng polycarbonate và màng polyamide. Polyethylene terephthalate chống ăn mòn, độ bền cao, dễ gia công ngay cả khi ở nhiệt độ thấp (< 70oC). Điều này giúp loại nhựa này trở thành nguyên liệu phổ biến trong các ngành công nghiệp thực phẩm, chế tạo máy móc,.
Bên cạnh đó, PET không thấm nước và ít thấm khí hơn so với hầu hết các loại nhựa khác nên nó được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất bao bì [4]. Về tính chất hóa học, PET có khó bị hòa tan trong dung môi hữu cơ, bền hóa học với cả HF, H3PO4, CH3COOH, axit béo. không bền với axit đậm đặc HNO3 và H2SO4 (do tác dụng với gốc este). Ứng dụng của nhựa PET Polyethylene terephthalate được ứng dụng rộng rãi trong hầu hết các lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, dệt may, y tế, công nghiệp điện tử, công nghiệp ô tô và công nghiệp cơ khí chế tạo,.
Ứng dụng của nhựa PET Nhựa PET được ứng dụng chủ yếu nhất làm chai/ lọ, khay đựng thực phẩm, đồ uống. Bên cạnh đó, chúng còn được sử dụng trong việc sản xuất sợi thủ công, trong các 5 ngành công nghiệp dệt may, túi xách. Vải polyester chắc chắn, linh hoạt và có thêm lợi ích là ít nhăn và co rút hơn vải cotton. Vải polyester có trọng lượng nhẹ, giảm gió, chống kéo và chống rách tốt hơn.
Sợi monofilament PET chủ yếu được sử dụng để sản xuất vải lưới để in lụa, lọc dầu và lọc cát, dây giằng cho các ứng dụng nông nghiệp (nhà kính, v.), dây đai dệt/ đan, vải lọc, … PET có đặc tính cách điện tốt, độ ổn định về cấu trúc và kích thước cao cho phép sử dụng chúng trong ngành công nghiệp điện và điện tử. Nó là một polymer hiệu quả để thay thế các kim loại đúc khuôn và nhiệt rắn trong các ứng dụng như: bọc điện, điện tử, máy đo thông minh, bộ phận quang điện, hộp nối năng lượng mặt trời,. Ngoài ra, PET còn được sử dụng để sản xuất các bộ phận trong ngành công nghiệp ô tô như: thảm, vải bọc ghế ngồi, mặt bên, mái, sàn và cửa, dây an toàn, lốp xe, túi khí, bộ lọc không khí, bộ lọc nhiên liệu, giá đỡ đèn pha ô tô, vỏ động cơ, vỏ đầu nối, cần gạt nước và vỏ bánh răng … nhờ tính ổn định nhiệt, tính chất điện, độ hấp thụ nước rất thấp và đặc tính bề mặt tuyệt vời cho phương tiện này. Đối với lĩnh vực y tế, sợi PET được sử dụng trong các sinh vật sống ở dạng sợi dệt, bện hoặc sợi rỗng trong các lĩnh vực ứng dụng của gân nhân tạo, dây chằng nhân tạo, mảnh ghép mạch máu, van tim, thận nhân tạo, chỉ khâu, lưới phẫu thuật, ống thông đường tiết niệu [5].
Tình hình sử dụng nhựa PET Sự phát triển của các vật liệu nhựa tổng hợp đã mang lại những thay đổi rõ rệt cho nền kinh tế thế giới từ nửa cuối thế kỉ trước và trở nên không thể thiếu được trong xã hội hiện đại [6]. Bằng chứng là từ năm 1950 tới nay, sản lượng nhựa đã tăng hơn 20 lần và đạt tới 390,7 triệu tấn vào năm 2021 [7]. Vật liệu PET là vật liệu có nhu cầu tiêu dùng tăng trưởng tương đối nhanh. Sản phẩm PET tiêu dùng ở Liên minh Châu Âu tăng từ 1.9 triệu tấn trong giai đoạn 2001 – 2008 sau đó tăng mạnh từ 42 triệu tấn lên 73 triệu tấn trong giai đoạn 2014 - 2020.
Châu Á là khu vực có lượng tiêu thụ nhựa PET lớn nhất thế giới và gấp đôi các khu vực khác với sản lượng 10 triệu tấn/ năm vào năm 2018. Nhu cầu về lượng tiêu thụ nhựa PET được dự đoán sẽ phát triển nhanh chóng với mức tăng trưởng 30% ở Châu Á và 20% ở Châu Âu, còn ở khu vực Trung Đông và Châu Phi là 33% trong giai đoạn 2018 - 2022. Sản xuất PET ở Nam Mỹ chỉ có thể đáp ứng 50% nhu cầu tiêu dùng trong khu vực, phần sản lượng thiếu hụt được Châu Á cung cấp. Đặc biệt Trung Quốc là nước xuất khẩu vật liệu PET lớn nhất thế giới do có có lợi thế về chi phí sản xuất từ nguyên liệu than đá [8].
6 Việt Nam hiện đang là một trong những quốc gia có lượng tiêu thụ nhựa cao hàng đầu thế giới.1 triệu tấn rác thải nhựa trên đất liền mỗi năm [9]. Theo thống kê của Bộ Tài nguyên và Môi trường, mỗi năm Việt Nam thải ra môi trường khoảng 1.