Đặt vấn đề Trong hàng thập kỉ qua con người đã hướng tới việc sử dụng thực vật để cung cấp các hợp chất thiên nhiên như: polysacarit, carbohydrate, protein, chất béo…để sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Theo WHO thì có tới 80% dân số có xu hướng sử dụng thực vật chứa dược chất để làm thuốc và chăm sóc cho sức khỏe. Do nhu cầu sử dụng của con người ngày càng tăng nên quá trình khai thác và thương mại hóa cũng vô cùng sôi nổi. Tuy nhiên vấn đề đặt ra ở đây việc khai thác và quá trình thương mại hóa không có kế hoạch dẫn đến các loài chứa dược chất bị giảm nhanh chóng về số lượng trong tự nhiên.
Thêm vào đó việc biến đổi khí hậu tác động mạnh mẽ đến môi trường sống trong tự nhiên của chúng khiến số lượng của chúng giảm mạnh trong tự nhiên. Điều này buộc các nhà khoa học phải tính đến việc nghiên cứu tạo ra môi trường nhân tạo và điều kiện thuận lợi để nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm có thể đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày càng tăng của con người. Nuôi cấy mô tế bào thực vật được quan tâm và nghiên cứu từ những năm 1950. Việc nuôi cấy mô tế bào thực vật mang lại nhiều ưu điểm vượt trội so với canh tác ngoài tự nhiên như: thời gian nuôi cấy ngắn hơn, hạn chế được tác động của môi trường tự nhiên, tránh được ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, và tránh được việc nhiễm các hóa chất động hại như thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật… Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho rằng hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học tích lũy bên trong tế bào thực vật được nuôi cấy in vitro tương đương hoặc cao hơn nhiều so với cơ quan tích lũy của chúng bên ngoài tự nhiên.
Lan Thạch Hộc (Dendrobium officinale Kimura et Migo) thuộc chi Thạch Hộc, họ Lan (Orchidaceae), phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng rừng có độ cao 1.400m so với mặt biển. Thạch Hộc Tía là loại dược liệu tốt và quý hiếm có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa, tăng sức đề kháng của cơ thể, làm dãn mạch máu và kháng đông máu. Trong Thạch Hộc Tía có khoảng 190 hợp chất, đặc biệt m 2 có nhóm polysaccharides, Alkaloids là những nhóm hoạt tính chống oxi hóa có hiệu quả cao phòng và điều trị các bệnh về đường huyết, tim mạch và ung thư. Thạch Hộc được chế biến thành phong đấu giá xuất khẩu vào những năm 80 thế kỷ trước đạt mức 3.
Một cây Thạch Hộc tươi 3 tuổi có giá 25. Nhu cầu của Trung Quốc và các nước trên thế giới về Thạch Hộc còn rất lớn với giá cao, đem lại lợi nhuận cho những người trồng và chế biến Thạch Hộc. Dự báo trong 10 năm tới thị trường nội địa cần tới 15.000 tấn/năm tương đương hàng chục tỉ USD. Tuy nhiên việc sản xuất loại dược liệu này từ trước tới nay chưa được quan tâm đầu tư thích đáng khiến Thạch Hộc Tía có nguy cơ bị tuyệt chủng và được đưa vào danh mục đỏ của “Sách đỏ Việt Nam”.
Với giá trị to lớn của Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về bảo tồn, khai thác và phát triển loài lan này đã và đang được thực hiện mạnh mẽ. Trong đó việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống và sản xuất sinh khối, hợp chất tự nhiên từ lan Thạch Hộc Tía đã có những thành công nhất định. Nhiều nhà nghiên cứu đã công bố thành công trong việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng nhằm nâng cao hệ số nhân giống lan Thạch Hộc Tía [31], [ 24]. Bên cạnh đó cũng có nhiều kết quả nghiên cứu khác nhau trong việc sử dụng các chất hữu cơ (nước dừa, khoai tây, carot,…) với mục đích nhân giống lan Thạch Hộc Tía.
Ngoài các công trình nghiên cứu về nhân giống lan Thạch Hộc Tía, các nghiên cứu về nhân sinh khối trên đối tượng này còn hạn chế. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu được công bố về ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro. Xuất phát từ thực tế trên, việc thực hiện “Nghiên cứu ảnh hưởng của chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thach Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo)” là cần thiết và có tính khả thi cao. Thành công của đề tài không những tăng cường khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối lan Thạch Hộc Tía in vitro mà còn giảm thiểu tác hại có thể có trong việc sản xuất sinh khối an toàn Thạch Hộc Tía in vitro xuất phát từ việc sử dụng chất điều tiết sinh trưởng tổng hợp, cung cấp nguồn sinh khối lan Thạch Hộc Tía sạch sử dụng với mục đích chăm sóc sức khỏe và làm đẹp cho con người.
Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu tổng quát Xác định ảnh hưởng của chất hữu cơ đến khả năng sinh trưởng và tích lũy sinh khối của lan Thạch Hộc Tía trong môi trường in vitro. Mục tiêu cụ thể Xác định được nồng độ của một số chất hữu cơ tự nhiên đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro của lan Thạch Hộc Tía. Xác định nồng độ tối ưu của một số chất hữu cơ tổng hợp đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài sẽ xác định được nồng độ ảnh hưởng của các loại chất hữu cơ đến sinh trưởng và tích lũy sinh khối in vitro lan Thạch Hộc Tía, bổ sung cơ sở khoa học cho việc sử dụng các hợp chất hữu cơ trong nuôi cây mô lan Thạch Hộc Tía nói riêng và nuôi cấy mô thực vật nói chung. Đồng thời kết quả của đề tài là nguồn tài liệu khoa học có giá trị có thể tham khảo cho các nghiên cứu trên đối tượng này trong tương lai. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Thực hiện đề tài nghiên cứu giúp cho sinh viên có cơ hội củng cố lại kiến thức cũ , học hỏi được những kiến thức mới, và tích lũy được kinh nghiệm cho bản thân.
Kết quả của đề tài có thể dùng làm cơ sở khoa học cho quá trình nhân sinh khối các loài thực vật chứa dược chất quy mô lớn. Góp phần bảo tồn nguồn gene, cũng như thúc đẩy phát triển nuôi cấy cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, đồng thời tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học. m 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về lan Thạch Hộc Tía Theo từ điển Bách khoa dược học của Việt Nam (1999) đã ghi “Thạch Hộc” (Dendrobium nobile Lindt) có tên khác là Kim Thạch Hộc [28].
Thạch Hộc sống phụ sinh trên thân gỗ hoặc trên các vách đá ở vùng rừng có độ ẩm cao. Hiện nay trên khắp thế giới có khoảng 1.400 loài Lan, ở Trung Quốc có khoảng 81 loài. Trong chi Thạch Hộc cũng có rất nhiều loài được dùng để chữa bệnh. Tại Trung Quốc, chi Thạch Hộc có khoảng 12 loài phụ và 14 loài chính, trong đó có tới 11 loài được xem là dược liệu quý.
Đặc biệt, Thạch Hộc Tía là loài được đánh giá cao nhất và cũng có giá trị kinh tế lớn nhất. Tại Việt Nam cũng có nhiều loài Lan. Chúng được phân bố rộng rãi, trải dài từ Bắc vào Nam. Có nhiều loại sắp hoặc đã bị tuyệt chủng, một số khác thì đang được liệt vào sách đỏ cần phải được bảo tồn.
Trong số những loài này, chúng ta cần kể đến loài lan Thạch Hộc Dendrobium nobile Lindl. Nó phân bố chủ yếu ở vùng trung du và miền núi phía Bắc, được nghiên cứu nhân giống nhằm mục đích làm thuốc. Tên khoa học Thạch Hộc Tía (Dendrobium officinale Kimura et Migo) là một loài thuộc chi Dendrobium, họ lan (Orchidaceae). Đặc điểm hình thái và phân bố Đặc điểm hình thái Là cây phụ sinh trên thân gỗ hay vách đá, cao 30-50 cm, thường mọc thành bụi.
Thân hơi dẹt, có rãnh dọc, phía trên hơi dày hơn, có đốt dài 2,5-3 cm. Lá hình thuôn dài, phía cuống tù, gần như không cuống, ở đầu hơi cuộn hình nón, dài 12cm, rộng 2-3cm trên có 5 gân dọc. Lá mọc so le thành dãy đều ở hai bên thân. Hoa to màu hồng, mọc thành chùm trên những cuống dài, ở họng hoa có những điểm màu tím.
Hoa rất đẹp, to, màu hồng hay điểm hồng. Cánh môi hình bầu dục nhọn, dài 4-5cm, rộng 3cm cuộn thành hình phễu trong hoa, ở nơi họng hoa điểm màu tía [5], [13]. m 5 Quả nang hình thoi, khi khô tự mở. Hạt nhiều, mùa hoa tháng 2-4, mùa quả: tháng 4-6 Đặc điểm phân bố Thạch Hộc được phân bố ở Việt Nam, Lào, Trung Quốc, Myanma và nhiều nước vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [13].
Ở Trung Quốc chi Thạch Hộc chủ yếu phân bố ở các tỉnh: Chiết Giang, Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Quý Châu. Thạch Hộc khó sinh sản, mọc chậm, khó trồng, những cây mọc hoang dã đã được đưa vào “Công ước buôn bán quốc tế động thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng” được pháp luật bảo vệ, do đó nguồn cung cấp tự nhiên đã cạn kiệt, cấm thu hái và buôn bán. Trong tự nhiên Thạch Hộc thường sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm khoảng 70%, lượng mưa khoảng 900 – 1.500mm, nhiệt độ từ 12 – 18ºC. Do đó nó thường tập trung ở các phần dốc núi râm mát, độ ẩm cao và các vách đá chua.
Giá trị dược liệu của lan Thạch Hộc Tía Thành phần hóa học Trong Thạch Hộc có chất nhầy và chất ankaloit gọi là dendrobin khoảng 0,3% có CT thô C16H25O22. Theo báo cáo của Viện nghiên cứu y học, hệ dược học Bắc Kinh năm 1958 thì trong Thạch Hộc Dendrobium nolile có 0,05% ankaloit, không có saponin và không cho phản ứng tanin đới [13]. Tác dụng dược lý Năm 1936, hai tác giả Kinh Lợi Bâu và Lý Đăng Bảng đã báo cáo dùng cao Thạch Hộc chế bằng rượu 1ml = 4g dược liệu tiến hành thí nghiệm tác dụng giảm sốt thì thấy với liều 2,5ml trên 1kg thể trọng, tiêm vào màng bụng thỏ đã được gây sốt bằng dung dịch 0,03% trực trùng coli (2,3ml đối với 1kg thể trọng) không thấy có tác dụng giảm sốt [13]. Trên tràng thỏ cô lập, với nồng độ thấp (0,0001-0,5%) thì thấy có tác dụng kích thích, sự co bóp được tăng cường.
Nhưng với nồng độ cao: 1-10% thì lại thấy tác dụng ức chế [13]. m 6 Đối với tim cô lập của loài cóc Bugo sp. (dùng dung dịch Locke-Ringer) bất kể nồng độ như thế nào đều thấy sử dụng ức chế co bóp.