CHƯƠNG 1. Đối tượng nghiên cứu 1. Tổng quan về chitin 1. Lịch sử phát hiện Năm 1811, chitin được tìm ra bởi một giáo sư người Pháp có tên Braconnot, sau khi nhà khoa học người Anh Hachett phát hiện ra vật liệu đặc biệt có khả năng chống lại các hóa chất thông thường vào năm 1799.
Vài năm sau, vào năm 1823, Odier đã tìm thấy một chất tạo màng sinh học tương tự có trong bộ xương ngoài của một số loại côn trùng và đặt tên gọi là chitin [1]. Năm 1843, Lassaigne tìm ra sự hiện diện của nitơ trong chitin khi làm việc với bộ xương ngoài của bướm tằm. Sau đó, Ledderhose chỉ ra sự hiện diện của glucosamine và axit axetic góp phần tạo nên cấu trúc của chitin năm 1879. Năm 1894, Gilson xác nhận glucosamine là đơn vị lặp lại của chitin.
Cuối cùng vào năm 1946, bản chất hóa học của chitin đã được làm sáng tỏ bởi Purchase và Braun [2]. Là chất tạo màng sinh học có khả tái tạo dồi dào thứ hai trên trái đất, chỉ xếp sau xenlulozo, cùng với các đặc tính tuyệt vời như: khả năng tương thích sinh học, phân hủy, hấp thụ sinh học, kháng khuẩn, chữa lành vết thương và tính sinh miễn dịch thấp…Chitin đã xuất hiện trong nhiều báo cáo về các ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như: công nghệ thực phẩm, khoa học vật liệu, vi sinh, nông nghiệp, xử lý nước thải, hệ thống phân phối thuốc, kỹ thuật mô, công nghệ sinh học [3]. Khái niệm về chitin Chitin là polysaccharid tự nhiên phong phú thứ hai thế giới xếp sau xenlulozo, tồn tại chủ yếu trong vỏ của động vật chân đốt như cua, tôm, côn trùng và cũng được tạo ra bởi nấm và vi khuẩn. Cấu trúc của chitin là sự kết hợp của các tiểu phân N-acetyl-D-Glucosamine theo dạng mạch thẳng thông qua liên kết poly[β-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-D- glucopyranose].
Chitin có cấu trúc tinh thể và cấu trúc này tạo nên một mạng lưới tồn tại dưới hình thái các sợi hữu cơ liên kết chặt chẽ qua các cầu nối hydro trên mạch phân tử 3 làm cho chitin có khả năng xảy ra phản ứng hóa học thấp. Mức độ trùng hợp trung bình (số DP trung bình) của chitin vào khoảng 200 - 3000. Cấu trúc phân tử, một số nguồn cung cấp ngoài tự nhiên của chitin được thể hiện thông qua hình 1. Cấu trúc phân tử chitin.
Nguồn gốc của chitin. Tính chất vật lý Trong thực tiễn, sau khi được tổng hợp, chitin tồn tại ở thể rắn với màu trắng ngà, vàng nhạt hoặc trắng hồng, có dạng vẩy, không mùi, không vị, có đặc tính kháng nấm mốc, kháng vi khuẩn, không gây hại cho con người và các loại động vật. Khi bị đun nóng trong natri hydroxit đậm đặc, chitin sẽ chuyển hóa thành chitosan [4]. Tính chất hóa học Chitin là polysaccharide tích điện dương duy nhất trong số tất cả các chất tạo màng sinh học tự nhiên khác, cho phép bản thân chitin có ứng dụng sinh học rộng rãi.
Có hai nhóm chính trong cấu trúc ảnh hưởng đến chức năng của chitin: nhóm amin và nhóm hydroxyl. Các vị trí amin có thể phản ứng với các nhóm aldehyde và keton để hình thành schiff 4 bases và ảnh hưởng đến độ hòa tan. Ngoài ra, hai nhóm hydroxyl trong cấu trúc chitin cung cấp các con đường tuyệt vời để sửa đổi và chức năng hóa chitin theo hướng gia tăng độ hòa tan [4]. Sự hiện diện của nhóm N-acetyl gắn trên đơn vị cấu trúc glucosamine làm cho chitin có đặc tính hòa tan cực kỳ kém đã dẫn đến việc khó có thể xử lý chitin thô từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên, đồng thời hạn chế đi tìm năng kinh tế thu được do quá trình xử lý phức tạp [5].
Tương tự như cấu trúc của xenlulozo, chitin là một polyme mạch thẳng gồm các gốc N-acetylglucosamine liên kết với nhau thông qua liên kết β-(1-4)-glycosidic [6], do đó có thể xem chitin là một dẫn xuất của xenlulozo với một nhóm acetamido ở C-2 [7]. Cả hai polyme đều hoạt động như các thành phần cấu trúc của cơ thể, xenlulozo cũng cố thành tế bào của thực vật, chitin mang lại sự tăng cường cho bộ xương ngoài của động vật chân đốt về mặt cơ học và cho cả thành tế bào của nấm. Được giả định là một homopolyme về mặt cấu trúc, tuy nhiên chitin tồn tại ở dạng homopolyme hiếm gặp trong tự nhiên [8]. Sự hình thành cấu trúc của chitin giống như dạng tấm và mỗi chuỗi riêng biệt trong mỗi tấm liên kết với nhau thông qua liên kết giữa nhóm C=O của một chuỗi với nhóm N-H của chuỗi khác.
Cùng với đó, liên kết hydro nội phân tử cũng được hình thành giữa nhóm C=O của một phân tử đường và nhóm O-H trên C-6 của vòng lân cận trong cùng một chuỗi. Một liên kết hydro khác cũng được tìm thấy giữa nguyên tử O trên vòng và nhóm O-H trên C-3, điều này cung cấp độ cứng cho chuỗi chitin [9, 10]. Chitin được sắp xếp dưới dạng các microfibrils tinh thể tụ lại với các chuỗi xoắn sáu sợi như cấu trúc protein. Sự trùng hợp của các monosaccharide, đơn vị β-(1-4)-2-acetamido- 2-deoxy-β-d-glucosamine tạo nên ba đa hình khác nhau (α, β và γ) [11].
Thông qua các nghiên cứu về nhiễu xạ điện tử đã cho thấy bản chất tinh thể cao của chitin ở dạng α và β. Cấu trúc α là dạng thù hình phổ biến nhất với các chuỗi polyme đơn vị được sắp xếp theo kiểu đối song song trong khi các chuỗi liền kề luôn theo hướng ngược nhau. Trong bản chất, đa hình dạng β ít thường xuyên xuất hiện, tất cả các chuỗi đều theo cùng một hướng và song song, cấu trúc γ là một dạng biến thể của cách sắp xếp α trong đó hai chuỗi song song, liền kề và một chiều được sắp xếp với một chuỗi ngược chiều. Cả hai cấu trúc α và β đều duy trì một mạng lưới mạnh mẽ được chi phối bởi các liên kết hydro trong chuỗi 5 giữa các nhóm C=O…N-H và C=O…O-H với khoảng cách 0,47 nm.
Trong cấu trúc α- chitin, các liên kết hydro liên chuỗi bổ sung liên kết các nhóm hydroxy methyl trong khi loại tương tác này không được quan sát thấy trong cấu trúc β. Vì vậy, dạng β-chitin dễ bị phồng trong tinh thể hơn dạng α-chitin. Sự sắp xếp cấu trúc khác nhau của α-chitin và β- chitin cung cấp lý do tại sao nước, rượu và các amin có thể tiếp cận với cấu trúc β bằng cách trương nở mà không phá vỡ sự sắp xếp chuỗi và cấu trúc tinh thể [12, 13]. Sự sắp xếp của chuỗi phân tử chitin cùng các dạng đa hình được thể hiện trong hình 1.3 sau: α-chitin β-chitin γ-chitin Hình 1.
Các dạng đa hình của chitin. Ứng dụng Chitin đã được sử dụng để chuẩn bị cột sắc ký ái lực để phân lập lectin và xác định cấu trúc của chúng trong báo cáo của Pradip Datta và cộng sự vào năm 2014 [14]. Chitin và carboxymethylchitin kích hoạt đại thực bào phúc mạc, ngăn chặn sự phát triển của các tế bào khối u ở chuột, kích thích đề kháng không đặc hiệu của vật chủ chống lại sự nhiễm khuẩn Escherichia Coli, đồng thời cũng làm tăng tốc độ chữa lành vết thương [15]. Chitin được sử dụng rộng rãi với mục tiêu cố định các enzym và toàn bộ tế bào; sự cố định enzym đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Với đặc điểm không độc hại, khả năng phân hủy sinh học, tính trơ sinh lý, kháng khuẩn, kỵ nước, đặc tính tạo gel và ái lực với protein, chitin đã góp mặt trong nhiều lĩnh vực ứng dụng khác 6 ngoài thực phẩm chẳng hạn như trong cảm biến sinh học [16]. Bên cạnh đó, vật liệu dựa trên chitin cũng được ứng dụng cho việc xử lý chất ô nhiễm công nghiệp và hấp phụ phức bạc thiosulfate và actinides [16]. Chitin có thể được xử lý ở dạng màng và được phát triển lần đầu tiên bởi Austin và sau đó là Hirano [17]. Chúng không gây dị ứng, có khả năng khử mùi, kháng khuẩn và kiểm soát độ ẩm.
Dẫn xuất chitin tái sinh được sử dụng làm chất kết dính trong quá trình làm giấy [15]. Tuy nhiên, sự phát triển mang tính đột phá của màng chitin là trong lĩnh vực y tế và dược phẩm như vật liệu băng bó vết thương và giải phóng thuốc [18, 19]. Chitin cũng được sử dụng như một tá dược và chất mang thuốc ở dạng gel. Một ứng dụng thú vị khác là trong vật liệu làm đầy xương composite hydroxyapatite-chitin-chitosan, tạo thành hỗn hợp tự đông cứng cho mô được hướng dẫn tái tạo trong điều trị xương nha chu khuyết tật [20].
CM-chitin được chọn lọc và sửa đổi nhằm mục đích tạo ra các liên hợp thuốc kháng u [21]. Ví dụ: 5-fluorouracil đánh dấu hoạt động chống khối u và chất tương tự D-glucose của muramyl-L-alanyl-isoglutamine, chịu trách nhiệm cho hoạt động của chất bổ trợ miễn dịch được ghép trên CM-chitin sử dụng một chất đệm cụ thể và một liên kết este. Các oligomer chitin đã được chứng minh là thuốc chống ung thư và oligomer có DP 1/4 5 hoạt động trong kiểm soát quá trình quang hợp của ngô và đậu tương [22]. Tổng hợp chitin Nguồn nguyên liệu chính, có ảnh hưởng đến việc tổng hợp chitin là từ lớp biểu bì của các loài động vật giáp xác.
Bộ xương ngoài của động vật giáp xác bao gồm protein, chitin và canxi cacbonat liên kết với nhau tạo thành lớp vỏ bên ngoài. Do đó, việc tách chitin đòi hỏi phải loại bỏ hai thành phần chính là protein và khoáng chất. Protein bị loại bỏ bởi quá trình khử protein và các khoáng chất được loại bỏ bằng quá trình khử khoáng. Trong một số trường hợp, một quá trình khử màu bổ sung được tiến hành nhằm loại bỏ các chất màu.
Nhiều phương pháp đã được phát minh ra để sản xuất chitin. Trong số đó, các phương pháp hóa học và sinh học là phương pháp chính để sản xuất chitin [23]. Phương pháp hóa học Quá trình khử khoáng 7 Quá trình khử khoáng dựa trên việc sử dụng axit để loại bỏ các khoáng chất như canxi cacbonat và canxi photphat. Thuốc thử phổ biến nhất là HCl, HNO3, H2SO4, CH3COOH và HCOOH.
Sau đó vỏ được rửa sạch bằng nước cất cho đến khi pH trở nên trung tính. Với các loại vỏ khác nhau, điều kiện của quá trình khử khoáng khác nhau. Quá trình khử khoáng nói chung xảy ra ở nhiệt độ cao vì nó cho phép dung môi khuếch tán vào cấu trúc chitin dễ dàng hơn và sự khuếch tán phụ thuộc vào kích thước vỏ. Hơn nữa, nồng độ axit cao, nhiệt độ cao, thời gian xử lý dài sẽ ảnh hưởng xấu đến các đặc tính của chitin [24].