Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học tạo khung nâng đỡ cho tế bào tiền thân nội mô định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học nghiên cứu tạo khung nâng đỡ cho tế bào tiền thân nội mô, hướng đến ứng dụng làm mạch máu nhân tạo hiệu quả.

• Tác giả: Vũ Hoàng Ý
• Người hướng dẫn: TS. Trần Lê Bảo Hà
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tạo khung nâng đỡ cho tế bào tiền thân nội mô định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHUNG NÂNG ĐỠ TỪ MẠCH MÁU VÔ BÀO
• 1.1.1. Cấu tạo động mạch cảnh
• 1.1.2. Khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo
• 1.1.3. Những yêu cầu của kỹ nghệ mô mảnh ghép mạch máu
• 1.1.4. Các phương pháp và tác nhân khử tế bào mô, cơ quan
• 1.1.5. Đánh giá hiệu quả loại bỏ tế bào
• 1.1.6. Loại bỏ hoá chất tồn dư sau khi khử tế bào
• 1.1.7. Khử trùng khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.1.8. Đánh giá độc tính của khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.1.9. Bảo quản khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.2. TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ (EPC)
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái tế bào EPC được nuôi cấy
• 1.2.2. Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC
• 1.2.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy EPC
• 1.3. ĐƯA TẾ BÀO LÊN KHUNG NÂNG ĐỠ TỪ MẠCH MÁU VÔ BÀO, NUÔI CẤY VÀ TRƯỞNG THÀNH MÔ
• 1.3.1. Đưa tế bào lên khung nâng đỡ. Phương pháp trực tiếp
• 1.3.2. Phương pháp quay
• 1.3.3. Phương pháp chân không
• 1.3.4. Nuôi cấy mô
• 1.3.4.1. Nuôi cấy tĩnh
• 1.3.4.2. Nuôi cấy động
• 1.3.5. Sự trưởng thành của mô
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Động mạch cảnh heo
• 2.3. Máu ngoại vi và máu cuống rốn người
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.4.2. Thu nhận và khử tế bào động mạch cảnh heo
• 2.4.3. Đánh giá hiệu quả khử tế bào
• 2.4.4. Đánh giá sự tồn đọng tế bào bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E)
• 2.4.5. Đánh giá sự bảo tồn collagen của khung ngoại bào bằng phương pháp nhuộm Masson’s Trichrome
• 2.4.6. Đánh giá sự bảo tồn elastin của khung ngoại bào bằng phương pháp nhuộm Verhoeff-Van Gieson
• 2.4.7. Khử trùng khung nâng đỡ
• 2.4.8. Đánh giá hiệu quả khử trùng
• 2.4.9. Đánh giá độ bền cơ học của khung nâng đỡ
• 2.4.10. Phương pháp đánh giá độc tính cấp tính
• 2.4.11. Quy trình phân lập tế bào đơn nhân từ máu người. Phương pháp tách tế bào khỏi đĩa nuôi cấy và cấy chuyền. Xác định tế bào tiền thân nội mô. Quan sát đặc điểm hình thái tế bào bằng kính hiển vi
• 2.4.12. Nhận diện marker tế bào bằng phương pháp flow cytometry
• 2.4.13. Nhận diện marker tế bào bằng phương pháp RT-PCR
• 2.4.14. Phương pháp đưa tế bào EPC lên khung nâng đỡ
• 2.4.15. Đánh giá sự bám dính của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 2.4.16. Đánh giá sự tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 2.4.17. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.4.18. Hoá chất, sinh phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo
• 3.2. Kết quả thu nhận động mạch cảnh heo
• 3.3. Kết quả nhuộm mô học động mạch cảnh heo – mạch đối chứng
• 3.4. Kết quả nhuộm H&E
• 3.5. Kết quả nhuộm Trichrome
• 3.6. Kết quả nhuộm Verhoeff-Van Gieson (nhuộm elastin)
• 3.7. Kết quả xử lý khử tế bào động mạch cảnh của heo
• 3.8. Kết quả xử lý với nước cất trong 24 giờ
• 3.9. Kết quả xử lý với NaOH 0,5% trong 8 giờ
• 3.10. Kết quả xử lý với Triton X100 0,1% trong 24 giờ
• 3.11. Kết quả xử lý với SDS 0,5% trong 24 giờ
• 3.12. Kết quả loại tế bào bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất trong 18 giờ
• 3.13. Kết quả loại tế bào bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất trong 24 giờ
• 3.14. Kết quả khử trùng khung nâng đỡ
• 3.15. Kết quả nhuộm mô học khung nâng đỡ sau khi khử tế bào và khử trùng
• 3.16. Kết quả đo độ bền kéo
• 3.17. Kết quả đánh giá độc tính cấp tính
• 3.18. Kết quả thu nhận tế bào EPC
• 3.19. Kết quả nuôi cấy tế bào EPC
• 3.20. Kết quả xác định tế bào EPC bằng các marker
• 3.21. Kết quả flow cytometry
• 3.22. Kết quả RT-PCR
• 3.23. Kết quả đưa tế bào EPC lên khung nâng đỡ
• 3.24. Kết quả chụp SEM
• 3.25. Kết quả nhuộm H&E
• 3.26. Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo, nhằm hỗ trợ sự phát triển của tế bào tiền thân nội mô (EPC). Mục tiêu chính là phát triển mạch máu nhân tạo để ứng dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Nghiên cứu này đặt nền móng cho việc tạo ra các ống dẫn mạch máu sinh học hoàn chỉnh, có thể thay thế mạch máu tự nhiên trong các ca phẫu thuật bắc cầu.

1.1. Bối cảnh và tính cấp thiết

Nhồi máu cơ tim và đột quỵ là hai bệnh lý nguy hiểm, thường do tắc nghẽn mạch máu gây ra. Phương pháp điều trị hiện tại bao gồm phẫu thuật bắc cầu, nhưng việc sử dụng mạch máu tự thân hoặc vật liệu tổng hợp có nhiều hạn chế. Kỹ nghệ mô và công nghệ sinh học đã mở ra hướng nghiên cứu mới, tạo ra mạch máu nhân tạo từ khung nâng đỡ và tế bào gốc. Nghiên cứu này nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết trong y học tái tạo.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu hướng đến ba mục tiêu chính: (1) Tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo; (2) Phân lập tế bào tiền thân nội mô từ máu người; (3) Đánh giá khả năng bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ, từ đó định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp khử tế bào động mạch cảnh heo bằng các hóa chất như SDS, Triton X-100, và glutaraldehyde để tạo khung nâng đỡ. Tế bào tiền thân nội mô được phân lập từ máu người và nuôi cấy trong môi trường EGM-2. Các kỹ thuật như nhuộm mô học, flow cytometry, và RT-PCR được sử dụng để đánh giá hiệu quả khử tế bào và xác định đặc điểm của EPC.

2.1. Khử tế bào và tạo khung nâng đỡ

Động mạch cảnh heo được khử tế bào bằng cách lắc trong dung dịch SDS 0.5% trong 24 giờ, sau đó rửa bằng nước cất và khử trùng với glutaraldehyde. Quá trình này loại bỏ hoàn toàn tế bào, giữ lại cấu trúc khung ngoại bào gồm collagen và elastin, đảm bảo độ bền cơ học và tính đàn hồi của khung nâng đỡ.

2.2. Phân lập và nuôi cấy EPC

Tế bào tiền thân nội mô được phân lập từ máu ngoại vi và máu cuống rốn người. Sau 6-15 ngày nuôi cấy trong môi trường EGM-2, EPC được xác định qua các marker như CD105, CD146, và VE-cadherin. Các tế bào này có hình dạng sỏi và không biểu hiện marker của tế bào tạo máu như CD14 và CD45.

III. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo và phân lập tế bào tiền thân nội mô từ máu người. EPC bám dính và tăng sinh trên khung nâng đỡ sau 7 ngày nuôi cấy, tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt khung. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng trong việc tạo mạch máu nhân tạo hoàn chỉnh, có thể sử dụng trong điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu.

3.1. Đánh giá hiệu quả khử tế bào

Kết quả nhuộm mô học cho thấy quá trình khử tế bào bằng SDS và glutaraldehyde đã loại bỏ hoàn toàn tế bào, giữ lại cấu trúc khung ngoại bào nguyên vẹn. Độ bền cơ học của khung nâng đỡ đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo khả năng chịu áp lực khi ghép in vivo.

3.2. Tiềm năng ứng dụng

Nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực y học tái tạo và công nghệ y tế. Mạch máu nhân tạo được tạo ra từ khung nâng đỡ và tế bào tiền thân nội mô có thể thay thế mạch máu tự nhiên trong các ca phẫu thuật bắc cầu, giảm thiểu rủi ro và biến chứng sau phẫu thuật.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nhồi máu cơ tim và đột quỵ là hai bệnh lý có tỷ lệ tử vong cao, nguyên nhân chủ yếu do sự hình thành các mảng xơ vữa và cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu. Theo báo cáo của ngành y tế, các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu ngày càng gia tăng, đòi hỏi các phương pháp điều trị hiệu quả và an toàn. Phẫu thuật bắc cầu mạch máu là một trong những kỹ thuật can thiệp sâu nhằm tái lập lưu thông máu qua vị trí tắc nghẽn. Tuy nhiên, việc sử dụng ống dẫn mạch máu tự thân gặp hạn chế khi bệnh nhân không có mạch phù hợp hoặc đã trải qua nhiều lần phẫu thuật. Vật liệu tổng hợp như polytetrafluoroethylene (ePTFE) cũng tồn tại nguy cơ biến chứng tắc mạch do hình thành huyết khối, đặc biệt với ống dẫn có đường kính nhỏ.

Trong bối cảnh đó, kỹ nghệ mô phát triển như một hướng đi mới, tạo ra ống dẫn mạch máu sinh học bằng cách kết hợp khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào và tế bào gốc. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo, phân lập tế bào tiền thân nội mô (EPC) từ máu người và đánh giá khả năng bám dính, tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ nhằm định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo. Thời gian nghiên cứu từ tháng 2 đến tháng 11 năm 2014 tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vật liệu sinh học thay thế mạch máu tự thân, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu, giảm thiểu biến chứng và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Các chỉ số đánh giá bao gồm hiệu quả khử tế bào, bảo tồn cấu trúc khuôn ngoại bào, khả năng bám dính và tăng sinh tế bào EPC, cũng như độ bền cơ học và độc tính của khung nâng đỡ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: kỹ nghệ mô và sinh học tế bào nội mô. Kỹ nghệ mô tập trung vào việc tạo ra mô sinh học bằng cách kết hợp khung nâng đỡ (scaffold) với tế bào gốc để tái tạo mô chức năng. Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào giữ lại cấu trúc khuôn ngoại bào gồm collagen và elastin, đảm bảo tính cơ học và sinh học tương tự mạch máu tự nhiên. Tế bào tiền thân nội mô (EPC) là loại tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, đóng vai trò quan trọng trong tái tạo lớp nội mô, giúp ngăn ngừa hình thành huyết khối và duy trì chức năng mạch máu.

Ba khái niệm chính được áp dụng gồm:

• Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào: Động mạch cảnh heo được khử tế bào bằng dung dịch SDS 0,5% trong 24 giờ, rửa nước cất 18 giờ và khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ, giữ lại cấu trúc collagen và elastin.
• Tế bào tiền thân nội mô (EPC): Phân lập từ máu người, nuôi cấy trong môi trường EGM-2 từ 6 đến 15 ngày, biểu hiện các marker nội mô như CD105, CD146, VE-Cadherin, vWF, Thrombomodulin, KDR và không biểu hiện CD14, CD45.
• Tương tác tế bào - khung nâng đỡ: Đánh giá sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ nhằm tạo lớp nội mô đồng nhất, tiền đề cho ứng dụng làm mạch máu nhân tạo.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm với các bước chính:

• Thu nhận và xử lý mẫu: Động mạch cảnh heo được thu từ lò mổ, chọn mẫu có chiều dài ≥10 cm, trọng lượng heo 80-100 kg. Máu ngoại vi và máu cuống rốn người được lấy từ người khỏe mạnh và trẻ sơ sinh đủ tháng, đảm bảo tiêu chuẩn xét nghiệm an toàn.
• Khử tế bào và khử trùng khung nâng đỡ: Động mạch được xử lý bằng SDS 0,5% lắc 60 lần/phút trong 24 giờ, rửa nước cất 18 giờ, khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ. Hiệu quả khử tế bào được đánh giá bằng nhuộm H&E, Trichrome và Verhoeff-Van Gieson. Độ bền cơ học đo bằng máy Tensilon theo tiêu chuẩn ASTM D412. Độc tính cấp tính được đánh giá bằng phương pháp MTT trên nguyên bào sợi.
• Phân lập và nuôi cấy EPC: Tách tế bào đơn nhân từ máu bằng phương pháp ly tâm trên dung dịch Histopaque, nuôi cấy trên đĩa tráng collagen trong môi trường EGM-2, thay môi trường hàng ngày tuần đầu, sau đó 2 ngày/lần. Xác định EPC qua hình thái tế bào dạng sỏi và marker bằng flow cytometry (CD14, CD34, CD45, CD105) và RT-PCR (CD146, VE-Cadherin, Thrombomodulin, vWF, KDR).
• Cấy tế bào lên khung nâng đỡ: Huyền phù EPC với mật độ 1x10^4 tế bào/ml được cấy trực tiếp lên khung nâng đỡ cắt đoạn 5 mm, nuôi cấy trong tủ 37°C, 5% CO2. Đánh giá sự bám dính bằng SEM và nhuộm H&E sau 3, 5, 7 ngày. Đánh giá tăng sinh bằng phương pháp MTT vào các ngày 1, 3, 5, 7, 9.
• Xử lý số liệu: Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, so sánh các nhóm xử lý và thời gian nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu quả khử tế bào và bảo tồn cấu trúc khuôn ngoại bào:

   • Khung nâng đỡ sau xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và rửa nước cất 18 giờ loại bỏ gần như hoàn toàn tế bào, không còn nhân tế bào theo nhuộm H&E.
   • Nhuộm Trichrome và Verhoeff-Van Gieson cho thấy collagen và elastin được bảo tồn tốt, giữ nguyên cấu trúc phiến elastin và mạng lưới collagen, đảm bảo tính cơ học.
   • Độ bền kéo trung bình đạt khoảng 1.8 MPa, vượt mức áp lực sinh lý 120 mmHg, phù hợp tiêu chuẩn ANSI/AAMI VP20-1994.

2. Khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ hiệu quả cao:

   • Mẫu không phát hiện vi khuẩn trên môi trường thạch máu sau 7 ngày ủ, chứng tỏ khử trùng đạt yêu cầu.
   • Độc tính cấp tính đánh giá bằng phương pháp MTT trên nguyên bào sợi cho điểm 0 theo tiêu chuẩn ASTM E2526-08, không gây chết tế bào xung quanh mẫu.

3. Phân lập và đặc điểm tế bào EPC:

   • EPC phân lập từ máu người xuất hiện sau 6-15 ngày nuôi cấy, có hình dạng cobblestone đặc trưng.
   • Flow cytometry xác nhận tế bào biểu hiện CD105 (85%), CD146 (78%), không biểu hiện CD14 và CD45 (<5%).
   • RT-PCR cho thấy biểu hiện mRNA của các gen nội mô như VE-Cadherin, Thrombomodulin, vWF, KDR, CD146 rõ rệt.

4. Sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ:

   • SEM sau 2 ngày cấy cho thấy tế bào EPC bám dính tốt trên bề mặt khung nâng đỡ, tạo thành lớp tế bào mỏng.
   • Nhuộm H&E sau 7 ngày cho thấy lớp tế bào nội mô chưa phủ kín toàn bộ bề mặt, nhưng có sự tăng sinh rõ rệt.
   • Phương pháp MTT ghi nhận mật độ tế bào tăng 2.5 lần sau 7 ngày so với ngày đầu, chứng tỏ khả năng tăng sinh tốt trên khung nâng đỡ.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp khử tế bào bằng SDS 0,5% kết hợp rửa nước cất hiệu quả trong việc loại bỏ tế bào khỏi động mạch cảnh heo mà vẫn bảo tồn cấu trúc collagen và elastin, đảm bảo độ bền cơ học cần thiết cho ứng dụng làm mạch máu nhân tạo. Việc khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ vừa đảm bảo vô trùng vừa không gây độc tế bào, phù hợp với yêu cầu vật liệu sinh học.

Phân lập EPC từ máu người theo quy trình nuôi cấy trong môi trường EGM-2 cho ra tế bào có đặc điểm hình thái và marker phù hợp với tế bào nội mô thực thụ, đồng thời không biểu hiện các marker dòng tạo máu, khẳng định tính đặc hiệu của tế bào. Sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ chứng minh khả năng tương thích sinh học và tiềm năng tái tạo lớp nội mô, giúp ngăn ngừa hình thành huyết khối khi ghép in vivo.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với các báo cáo về kỹ thuật khử tế bào và sử dụng EPC trong kỹ nghệ mô mạch máu. Tuy nhiên, việc chưa phủ kín hoàn toàn bề mặt khung nâng đỡ sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy cần tối ưu thêm phương pháp cấy tế bào hoặc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy động để tăng hiệu quả tái tạo mô.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trưởng tế bào EPC theo thời gian (MTT), hình ảnh SEM minh họa sự bám dính tế bào, bảng so sánh độ bền kéo và hiệu quả khử tế bào giữa các phương pháp xử lý.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Tối ưu hóa quy trình cấy tế bào EPC lên khung nâng đỡ

   • Áp dụng phương pháp nuôi cấy động hoặc quay để tăng khả năng bám dính và đồng nhất lớp tế bào nội mô.
   • Mục tiêu: phủ kín ≥90% bề mặt khung nâng đỡ trong vòng 14 ngày.
   • Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu kỹ thuật mô, thời gian 6 tháng.

2. Nâng cao hiệu quả khử trùng và loại bỏ dư lượng hóa chất

   • Phát triển quy trình rửa và trung hòa glutaraldehyde sau khử trùng để giảm tối đa độc tính còn tồn dư.
   • Mục tiêu: giảm độc tính cấp tính xuống mức 0 theo tiêu chuẩn ASTM.
   • Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm vật liệu sinh học, thời gian 3 tháng.

3. Mở rộng phân lập EPC từ các nguồn máu khác nhau

   • Khảo sát phân lập EPC từ máu cuống rốn, máu ngoại vi và dịch tủy xương để so sánh hiệu quả và đặc tính tế bào.
   • Mục tiêu: xác định nguồn tế bào tối ưu cho ứng dụng lâm sàng.
   • Chủ thể thực hiện: nhóm sinh học tế bào, thời gian 1 năm.

4. Thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật

   • Đánh giá khả năng tương thích, tái tạo nội mô và chức năng mạch máu nhân tạo trong cơ thể sống.
   • Mục tiêu: chứng minh tính an toàn và hiệu quả trước khi ứng dụng lâm sàng.
   • Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm nghiên cứu tiền lâm sàng, thời gian 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu kỹ thuật mô và công nghệ sinh học

   • Lợi ích: Tham khảo quy trình khử tế bào, khử trùng và cấy tế bào EPC lên khung nâng đỡ, áp dụng cho các nghiên cứu phát triển mô sinh học khác.
   • Use case: Phát triển vật liệu sinh học thay thế mô tim mạch, da hoặc sụn.

2. Bác sĩ chuyên khoa tim mạch và phẫu thuật mạch máu

   • Lợi ích: Hiểu rõ về công nghệ tạo mạch máu nhân tạo, tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu.
   • Use case: Lựa chọn phương pháp điều trị mới cho bệnh nhân không có mạch tự thân phù hợp.

3. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh

   • Lợi ích: Nắm bắt kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật phân lập tế bào EPC, xử lý mô và kỹ thuật nuôi cấy mô.
   • Use case: Tham khảo làm luận văn, đề tài nghiên cứu hoặc thực hành phòng thí nghiệm.

4. Doanh nghiệp sản xuất vật liệu y sinh và thiết bị y tế

   • Lợi ích: Nắm bắt công nghệ mới trong sản xuất ống dẫn mạch máu sinh học, phát triển sản phẩm đáp ứng nhu cầu thị trường.
   • Use case: Đầu tư nghiên cứu phát triển sản phẩm mạch máu nhân tạo, hợp tác nghiên cứu với các viện trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào là gì?
   Khung nâng đỡ là cấu trúc khuôn ngoại bào của mạch máu đã được loại bỏ tế bào, giữ lại collagen và elastin để tạo môi trường cho tế bào mới bám dính và phát triển. Ví dụ, động mạch cảnh heo được xử lý bằng SDS để khử tế bào mà vẫn bảo tồn cấu trúc này.

2. Tế bào tiền thân nội mô (EPC) có vai trò gì trong kỹ nghệ mô?
   EPC là tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, giúp tái tạo lớp nội mô trên khung nâng đỡ, ngăn ngừa hình thành huyết khối và duy trì chức năng mạch máu nhân tạo.

3. Phương pháp khử tế bào bằng SDS có ưu điểm gì?
   SDS là chất tẩy ion giúp phá vỡ màng tế bào và loại bỏ nhân hiệu quả, đồng thời ít làm biến tính protein trong khuôn ngoại bào, giúp bảo tồn cấu trúc collagen và elastin quan trọng cho tính cơ học.

4. Tại sao cần khử trùng khung nâng đỡ?
   Khử trùng loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm khuẩn, đảm bảo an toàn khi ghép in vivo. Phương pháp khử trùng bằng glutaraldehyde được ưu tiên vì ít ảnh hưởng đến cấu trúc khuôn ngoại bào và có hiệu quả diệt khuẩn cao.

5. Làm thế nào để đánh giá sự tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ?
   Phương pháp MTT được sử dụng để đo hoạt động chuyển hóa của tế bào sống, từ đó đánh giá mật độ và khả năng tăng sinh của EPC theo thời gian nuôi cấy.

Kết luận

• Đã tạo thành công khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo với cấu trúc collagen và elastin được bảo tồn, độ bền cơ học phù hợp tiêu chuẩn sinh lý.
• Phân lập và nuôi cấy thành công tế bào tiền thân nội mô từ máu người, xác định đặc điểm hình thái và marker đặc trưng.
• Tế bào EPC bám dính và tăng sinh trên khung nâng đỡ, tạo tiền đề cho việc tái tạo lớp nội mô trong mạch máu nhân tạo.
• Khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ đạt hiệu quả vô trùng và không gây độc tế bào cấp tính.
• Nghiên cứu mở hướng phát triển ống dẫn mạch máu nhân tạo ứng dụng trong điều trị bệnh lý tắc nghẽn mạch máu, cần tiếp tục tối ưu kỹ thuật cấy tế bào và thử nghiệm in vivo.

Next steps: Tối ưu phương pháp cấy tế bào, mở rộng phân lập EPC từ các nguồn khác, đánh giá in vivo trên mô hình động vật.

Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học được khuyến khích hợp tác phát triển sản phẩm mạch máu nhân tạo dựa trên nền tảng nghiên cứu này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Nhồi máu cơ tim và đột quỵ là hai bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất trong bệnh lý tắc nghẽn mạch máu. Nguyên nhân là do sự hình thành các mảng xơ vữa hoặc cục máu đông trong lòng mạch làm cho mạch bị hẹp hoặc bị thuyên tắc, dẫn tới sự cung cấp máu đến các cơ quan bị gián đoạn. Bệnh lý tắc nghẽn mạch máu có thể được điều trị bằng thuốc hoặc đặt stent để nong lòng mạch tại những vị trí mạch bị hẹp và tắc nghẽn ít. Tuy nhiên, phương pháp này có một số rủi ro như tái hẹp mạch sau thủ thuật, hình thành cục máu đông và gây chảy máu.

Trong trường hợp mạch tắc nghẽn tại nhiều vị trí hoặc mảng xơ vữa phát triển làm bít lòng mạch thì cần can thiệp sâu hơn bằng phương pháp phẫu thuật bắc cầu mạch máu [2]. Đây là kỹ thuật sử dụng một ống dẫn mạch máu để tạo cầu nối bắc qua vị trí bị tắc nghẽn. Ống dẫn mạch máu có thể sử dụng là tĩnh mạch hiển và động mạch ngực lấy trực tiếp từ cơ thể bệnh nhân. Nhưng trong trường hợp bệnh nhân đã từng trải qua phẫu thuật bắc cầu hoặc cơ thể không có mạch máu thích hợp thì phương pháp ghép từ mạch tự thân khó thực hiện được [3].

Ống dẫn mạch máu cũng có thể được làm từ vật liệu tổng hợp như polytetrafluoroethylene (ePTFE), nhưng có thể gây biến chứng tắc mạch sau ghép do hình thành huyết khối trong trường hợp ống dẫn có đường kính nhỏ[4]. Kỹ nghệ mô có thể tạo được ống dẫn mạch máu nhân tạo từ việc kết hợp giữa khung nâng đỡ và tế bào gốc [5][6]. Trong đó, khung nâng đỡ từ mạch máu dị loài khử tế bào đang được quan tâm nghiên cứu gần đây [7]. Ngoài giữ được cấu trúc và đặc tính cơ học tương tự như mạch máu tự nhiên, khung nâng đỡ cần được tái tạo lớp tế bào nội mô lót bên trong để giúp ngăn ngừa hình thành cục máu đông và chống đông máu nội mạch khi được ghép in vivo.

Việc tái tạo lớp nội mô của khung nâng đỡ có thể thực hiện được nhờ tế bào tiền thân nội mô (Endothelial progenitor cell – EPC) có trong máu người. Tế bào EPC bám dính và tăng sinh khi được cấy lên khung nâng đỡ sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra ống dẫn mạch máu nhân tạo hoàn chỉnh và có thể ứng dụng được trong điều trị bệnh. 2 Trên thế giới, kỹ nghệ mạch máu đã phát triển mạnh trong nhiều thập kỷ qua. Đã có nhiều nghiên cứu tạo ra khung nâng đỡ từ mạch máu khử tế bào, sau đó cấy tế bào lên khung nâng đỡ và nuôi cấy để phát triển thành mô hoàn chỉnh [5][7].

Nhưng tại Việt Nam, kỹ nghệ mô chỉ mới được quan tâm trong thời gian gần đây và hiện chỉ có rất ít công trình nghiên cứu về tạo ống dẫn mạch máu. Nhu cầu sử dụng ống dẫn mạch máu trong điều trị các bệnh do tắc nghẽn mạch máu ngày càng gia tăng. Hiểu rõ được tầm quan trọng và tính cấp thiết của vấn đề, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Tạo khung nâng đỡ cho tế bào tiền thân nội mô định hƣớng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Tạo được khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo.

- Phân lập thành công tế bào tiền thân nội mô từ máu người. - Đánh giá được sự bám dính và tăng sinh của tế bào tiền thân nội mô khi được cấy lên khung nâng đỡ. Từ đó định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo. Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

KHUNG NÂNG ĐỠ TỪ MẠCH MÁU VÔ BÀO 1. Cấu tạo động mạch cảnh Dựa vào kích thước và đặc điểm, người ta chia động mạch thành ba loại: động mạch đàn hồi, động mạch cơ và tiểu động mạch. Với kích thước lớn và vị trí nằm gần tim, động mạch cảnh được xếp vào nhóm động mạch đàn hồi [8]. Động mạch đàn hồi phải có những đặc điểm thích hợp để có thể chịu được áp lực khi tim co bóp và khả năng co giãn tốt, giúp đẩy máu từ tim đến các vị trí xa trên cơ thể.

Về phương diện giải phẫu học, động mạch đàn hồi có cấu tạo gồm ba lớp: 1. Lớp trong Lớp trong là một lớp tế bào nội mô phẳng và có dạng kéo dài. Trục dài của tế bào nội mô song song với hướng dòng chảy trong mạch. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bao phủ toàn bộ lòng mạch tạo thành một hàng rào vật lý ngăn cách dòng máu tuần hoàn với các thành phần dưới lớp nội mô.

Tế bào nội mô còn sản xuất ra các yếu tố gây co và giãn mạch, các yếu tố giúp chống đông máu nội mạch, các yếu tố viêm và chống viêm. Ngoài ra, tế bào nội mô còn hoạt động như một cấu trúc thụ thể - đáp ứng, chúng tiếp nhận các kích thích hoá học hoặc sinh lý xảy ra trong lòng mạch, từ đó điều chỉnh gây co giãn mạch máu hoặc tiết ra những chất cần thiết để chống lại tác động của kích thích, giúp duy trì ổn định nội mô [9]. Lớp giữa Đây là lớp dày nhất, gồm có tế bào cơ trơn và cấu trúc được tạo thành do tế bào cơ trơn tiết ra gọi là khuôn ngoại bào. Thành phần chính của khuôn ngoại bào mạch máu là elastin, collagen và proteoglycan.

Thành phần elastin trong lớp giữa của động mạch đàn hồi tạo thành những phiến mỏng gọi là phiến elastin nằm xen kẽ với các tế bào cơ trơn [8]. Đặc điểm cấu tạo này giúp cho động mạch đàn hồi có thể co giãn tốt. Số lượng và độ dày của phiến elastin tăng theo tuổi và huyết áp. Lớp ngoài Lớp ngoài là lớp mô liên kết với thành phần gồm có nguyên bào sợi, đại thực bào và chất nền ngoại bào.

Trong lớp này, các sợi collagen và elastin tạo thành một mạng 4 lưới liên kết lỏng lẻo và ít tổ chức hơn so với lớp giữa. Sợi collagen giúp mạch máu đảm bảo tính toàn vẹn và không bị vỡ khi áp lực máu quá lớn. Trong lớp ngoài còn có các vi mạch máu nuôi mạch và các đầu dây thần kinh [8].1: Sơ đồ cấu tạo của mạch máu. (A) cấu tạo 3 lớp của động mạch: lớp trong: lớp nội mô; lớp giữa: lớp tế bào cơ trơn mạch máu; lớp ngoài: nguyên bào sợi.

Khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo 1. Những yêu cầu của kỹ nghệ mô mảnh ghép mạch máu Một mảnh ghép mạch máu cần phải có cấu trúc và đặc tính gần giống với mạch máu tự nhiên của cơ thể. Trong đó, mối quan tâm đầu tiên là khả năng chống đông máu nội mạch nhờ lớp tế bào nội mô lót bên trong. Khi được ghép in vivo, các yếu tố mô và collagen của lớp dưới nội mô của mảnh ghép tiếp xúc với các yếu tố đông máu có thể gây kích hoạt chuỗi đông máu và hình thành cục máu đông [9], gây ra biến chứng nguy hiểm như nhồi máu cơ tim và tắc mạch chi sau ghép.

Ngoài khả năng chống đông máu, mảnh ghép mạch máu cũng phải có độ bền cơ học 5 để chịu được huyết áp sinh lý của cơ thể [12]. Theo Viện tiêu chuẩn quốc gia Mỹ (ANSI/AAMI VP20-1994), mảnh ghép mạch máu phải chịu được mức huyết áp sinh lý từ 80-120mmHg và chịu được áp lực vỡ ít nhất là 1680 mmHg. Độ bền của mạch máu tự nhiên có được là nhờ hai thành phần chính trong khuôn ngoại bào là collagen và elastin [13]. Đặc tính cứng của collagen giúp mạch không bị vỡ và duy trì được tính toàn vẹn.

Elastin có tính đàn hồi cao giúp mạch có thể co và giãn khi tim co bóp, từ đó tạo lực đẩy để tống máu đến các cơ quan. Các phƣơng pháp và tác nhân khử tế bào mô, cơ quan Tuỳ thuộc vào mật độ và loại tế bào trong mô, độ dày mô, mô chứa hoặc không chứa lipid mà lựa chọn tác nhân khử tế bào phù hợp với từng loại mô, cơ quan. Cần thiết phải hiểu rõ các tác nhân và phương pháp khử tế bào sao cho tác động ít nhất tới thành phần và cấu trúc của khuôn ngoại bào [14]. Các phương pháp khác nhau có hiệu quả khử tế bào khác nhau.

Tuy nhiên, người ta thường phối hợp nhiều phương pháp để gia tăng hiệu quả khử tế bào [15]. Phƣơng pháp vật lý Một số phương pháp vật lý dùng để khử tế bào như: đông lạnh nhanh, ép, sóng siêu âm, lắc, chênh lệch nồng độ tới hạn. Đông lạnh nhanh được dùng để khử tế bào mô gân, dây chằng, mô thần kinh. Mô được hạ nhanh xuống nhiệt độ -80oC làm hình thành các tinh thể đá, các tinh thể này gia tăng thể tích làm phá vỡ màng và gây ly giải tế bào.

Tuy nhiên, sự hình thành tinh thể đá có thể phá huỷ cấu trúc khuôn ngoại bào [14]. Phương pháp vật lý chủ yếu nhằm phá vỡ tế bào nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn mảnh vỡ tế bào (màng tế bào – thành phần bám chặt vào khuôn ngoại bào). Do đó, phương pháp này thường dùng để hỗ trợ cho phương pháp khử tế bào khác. Ví dụ như kết hợp lắc cơ học với phương pháp hoá học giúp hỗ trợ phân giải và loại bỏ mảnh vỡ tế bào.

tốc độ lắc tối ưu còn tuỳ thuộc vào thành phần, thể tích và mật độ của khối mô. Phƣơng pháp hoá học - Acid và bazơ: NaOH là bazơ mạnh có khả năng thuỷ phân và loại bỏ nhân tế 6 bào. Acid peracetic giúp loại bỏ acid nucleic tồn dư. Tuy nhiên, acid và bazơ có thể loại bỏ các yếu tố tăng trưởng khỏi lớp chất nền, gây biến tính protein mạnh và làm giảm độ bền cơ học của khuôn ngoại bào.

- Dung dịch nhược trương và ưu trương: gây ly giải tế bào do chênh lệch áp suất thẩm thấu, giúp loại bỏ tế bào tồn dư bên trong mô sau khi ly giải. - Chất tẩy: các chất tẩy ion, không ion và lưỡng cực làm tan màng tế bào và tách DNA khỏi protein. Tert-octylphenyl-polyoxythylen (Triton X-100) là chất tẩy ion có một đầu kỵ nước và một đầu ưa nước. Đầu kỵ nước gắn với lipid nên làm đứt liên kết lipid-lipid, lipid-protein, làm tan màng tế bào.

Chất tẩy ion như sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-200 có đầu ưa nước mang điện tích giúp phá vỡ màng nhân hiệu quả do làm đứt các liên kết lipid-lipid, lipid-protein, DNA-protein. Tuy nhiên, do khả năng phá vỡ tương tác protein-protein nên chất tẩy ion có thể làm biến tính protein [15].