Luận Văn Thạc Sĩ Công Nghệ Sinh Học: Tạo Khung Nâng Đỡ Cho Tế Bào Tiền Thân Nội Mô Định Hướng Ứng Dụng Làm Mạch Máu Nhân Tạo

• Tác giả: Vũ Hoàng Ý
• Người hướng dẫn: TS. Trần Lê Bảo Hà
• Trường học: Đại học Bách Khoa - Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Tạo khung nâng đỡ cho tế bào tiền thân nội mô định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP. Hồ Chí Minh

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• MỤC LỤC
• DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. KHUNG NÂNG ĐỠ TỪ MẠCH MÁU VÔ BÀO
• 1.1.1. Cấu tạo động mạch cảnh
• 1.1.2. Khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo
• 1.1.3. Những yêu cầu của kỹ nghệ mô mảnh ghép mạch máu
• 1.1.4. Các phương pháp và tác nhân khử tế bào mô, cơ quan
• 1.1.5. Đánh giá hiệu quả loại bỏ tế bào
• 1.1.6. Loại bỏ hoá chất tồn dư sau khi khử tế bào
• 1.1.7. Khử trùng khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.1.8. Đánh giá độc tính của khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.1.9. Bảo quản khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào
• 1.2. TẾ BÀO TIỀN THÂN NỘI MÔ (EPC)
• 1.2.1. Đặc điểm hình thái tế bào EPC được nuôi cấy
• 1.2.2. Đặc điểm kháng nguyên bề mặt của tế bào EPC
• 1.2.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy EPC
• 1.3. ĐƯA TẾ BÀO LÊN KHUNG NÂNG ĐỠ TỪ MẠCH MÁU VÔ BÀO, NUÔI CẤY VÀ TRƯỞNG THÀNH MÔ
• 1.3.1. Đưa tế bào lên khung nâng đỡ. Phương pháp trực tiếp
• 1.3.2. Phương pháp quay
• 1.3.3. Phương pháp chân không
• 1.3.4. Nuôi cấy mô
• 1.3.4.1. Nuôi cấy tĩnh
• 1.3.4.2. Nuôi cấy động
• 1.3.5. Sự trưởng thành của mô
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Động mạch cảnh heo
• 2.3. Máu ngoại vi và máu cuống rốn người
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
• 2.4.2. Thu nhận và khử tế bào động mạch cảnh heo
• 2.4.3. Đánh giá hiệu quả khử tế bào
• 2.4.4. Đánh giá sự tồn đọng tế bào bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E)
• 2.4.5. Đánh giá sự bảo tồn collagen của khung ngoại bào bằng phương pháp nhuộm Masson’s Trichrome
• 2.4.6. Đánh giá sự bảo tồn elastin của khung ngoại bào bằng phương pháp nhuộm Verhoeff-Van Gieson
• 2.4.7. Khử trùng khung nâng đỡ
• 2.4.8. Đánh giá hiệu quả khử trùng
• 2.4.9. Đánh giá độ bền cơ học của khung nâng đỡ
• 2.4.10. Phương pháp đánh giá độc tính cấp tính
• 2.4.11. Quy trình phân lập tế bào đơn nhân từ máu người. Phương pháp tách tế bào khỏi đĩa nuôi cấy và cấy chuyền. Xác định tế bào tiền thân nội mô. Quan sát đặc điểm hình thái tế bào bằng kính hiển vi
• 2.4.12. Nhận diện marker tế bào bằng phương pháp flow cytometry
• 2.4.13. Nhận diện marker tế bào bằng phương pháp RT-PCR
• 2.4.14. Phương pháp đưa tế bào EPC lên khung nâng đỡ
• 2.4.15. Đánh giá sự bám dính của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 2.4.16. Đánh giá sự tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 2.4.17. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.4.18. Hoá chất, sinh phẩm
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 3.1. Kết quả tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo
• 3.2. Kết quả thu nhận động mạch cảnh heo
• 3.3. Kết quả nhuộm mô học động mạch cảnh heo – mạch đối chứng
• 3.4. Kết quả nhuộm H&E
• 3.5. Kết quả nhuộm Trichrome
• 3.6. Kết quả nhuộm Verhoeff-Van Gieson (nhuộm elastin)
• 3.7. Kết quả xử lý khử tế bào động mạch cảnh của heo
• 3.8. Kết quả xử lý với nước cất trong 24 giờ
• 3.9. Kết quả xử lý với NaOH 0,5% trong 8 giờ
• 3.10. Kết quả xử lý với Triton X100 0,1% trong 24 giờ
• 3.11. Kết quả xử lý với SDS 0,5% trong 24 giờ
• 3.12. Kết quả loại tế bào bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất trong 18 giờ
• 3.13. Kết quả loại tế bào bằng cách kết hợp xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và nước cất trong 24 giờ
• 3.14. Kết quả khử trùng khung nâng đỡ
• 3.15. Kết quả nhuộm mô học khung nâng đỡ sau khi khử tế bào và khử trùng
• 3.16. Kết quả đo độ bền kéo
• 3.17. Kết quả đánh giá độc tính cấp tính
• 3.18. Kết quả thu nhận tế bào EPC
• 3.19. Kết quả nuôi cấy tế bào EPC
• 3.20. Kết quả xác định tế bào EPC bằng các marker
• 3.21. Kết quả flow cytometry
• 3.22. Kết quả RT-PCR
• 3.23. Kết quả đưa tế bào EPC lên khung nâng đỡ
• 3.24. Kết quả chụp SEM
• 3.25. Kết quả nhuộm H&E
• 3.26. Đánh giá khả năng tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ
• 4. KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

I. Giới thiệu và mục tiêu nghiên cứu

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo, nhằm hỗ trợ sự phát triển của tế bào tiền thân nội mô (EPC). Mục tiêu chính là phát triển mạch máu nhân tạo để ứng dụng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến tắc nghẽn mạch máu. Nghiên cứu này đặt nền móng cho việc tạo ra các ống dẫn mạch máu sinh học hoàn chỉnh, có thể thay thế mạch máu tự nhiên trong các ca phẫu thuật bắc cầu.

1.1. Bối cảnh và tính cấp thiết

Nhồi máu cơ tim và đột quỵ là hai bệnh lý nguy hiểm, thường do tắc nghẽn mạch máu gây ra. Phương pháp điều trị hiện tại bao gồm phẫu thuật bắc cầu, nhưng việc sử dụng mạch máu tự thân hoặc vật liệu tổng hợp có nhiều hạn chế. Kỹ nghệ mô và công nghệ sinh học đã mở ra hướng nghiên cứu mới, tạo ra mạch máu nhân tạo từ khung nâng đỡ và tế bào gốc. Nghiên cứu này nhằm giải quyết nhu cầu cấp thiết trong y học tái tạo.

1.2. Mục tiêu cụ thể

Nghiên cứu hướng đến ba mục tiêu chính: (1) Tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo; (2) Phân lập tế bào tiền thân nội mô từ máu người; (3) Đánh giá khả năng bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ, từ đó định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo.

II. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp khử tế bào động mạch cảnh heo bằng các hóa chất như SDS, Triton X-100, và glutaraldehyde để tạo khung nâng đỡ. Tế bào tiền thân nội mô được phân lập từ máu người và nuôi cấy trong môi trường EGM-2. Các kỹ thuật như nhuộm mô học, flow cytometry, và RT-PCR được sử dụng để đánh giá hiệu quả khử tế bào và xác định đặc điểm của EPC.

2.1. Khử tế bào và tạo khung nâng đỡ

Động mạch cảnh heo được khử tế bào bằng cách lắc trong dung dịch SDS 0.5% trong 24 giờ, sau đó rửa bằng nước cất và khử trùng với glutaraldehyde. Quá trình này loại bỏ hoàn toàn tế bào, giữ lại cấu trúc khung ngoại bào gồm collagen và elastin, đảm bảo độ bền cơ học và tính đàn hồi của khung nâng đỡ.

2.2. Phân lập và nuôi cấy EPC

Tế bào tiền thân nội mô được phân lập từ máu ngoại vi và máu cuống rốn người. Sau 6-15 ngày nuôi cấy trong môi trường EGM-2, EPC được xác định qua các marker như CD105, CD146, và VE-cadherin. Các tế bào này có hình dạng sỏi và không biểu hiện marker của tế bào tạo máu như CD14 và CD45.

III. Kết quả và ứng dụng

Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo và phân lập tế bào tiền thân nội mô từ máu người. EPC bám dính và tăng sinh trên khung nâng đỡ sau 7 ngày nuôi cấy, tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt khung. Kết quả này mở ra tiềm năng ứng dụng trong việc tạo mạch máu nhân tạo hoàn chỉnh, có thể sử dụng trong điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu.

3.1. Đánh giá hiệu quả khử tế bào

Kết quả nhuộm mô học cho thấy quá trình khử tế bào bằng SDS và glutaraldehyde đã loại bỏ hoàn toàn tế bào, giữ lại cấu trúc khung ngoại bào nguyên vẹn. Độ bền cơ học của khung nâng đỡ đáp ứng tiêu chuẩn quốc tế, đảm bảo khả năng chịu áp lực khi ghép in vivo.

3.2. Tiềm năng ứng dụng

Nghiên cứu này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực y học tái tạo và công nghệ y tế. Mạch máu nhân tạo được tạo ra từ khung nâng đỡ và tế bào tiền thân nội mô có thể thay thế mạch máu tự nhiên trong các ca phẫu thuật bắc cầu, giảm thiểu rủi ro và biến chứng sau phẫu thuật.