Tổng quan nghiên cứu

Nhồi máu cơ tim và đột quỵ là hai bệnh lý có tỷ lệ tử vong cao, nguyên nhân chủ yếu do sự hình thành các mảng xơ vữa và cục máu đông gây tắc nghẽn mạch máu. Theo báo cáo của ngành y tế, các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu ngày càng gia tăng, đòi hỏi các phương pháp điều trị hiệu quả và an toàn. Phẫu thuật bắc cầu mạch máu là một trong những kỹ thuật can thiệp sâu nhằm tái lập lưu thông máu qua vị trí tắc nghẽn. Tuy nhiên, việc sử dụng ống dẫn mạch máu tự thân gặp hạn chế khi bệnh nhân không có mạch phù hợp hoặc đã trải qua nhiều lần phẫu thuật. Vật liệu tổng hợp như polytetrafluoroethylene (ePTFE) cũng tồn tại nguy cơ biến chứng tắc mạch do hình thành huyết khối, đặc biệt với ống dẫn có đường kính nhỏ.

Trong bối cảnh đó, kỹ nghệ mô phát triển như một hướng đi mới, tạo ra ống dẫn mạch máu sinh học bằng cách kết hợp khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào và tế bào gốc. Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo, phân lập tế bào tiền thân nội mô (EPC) từ máu người và đánh giá khả năng bám dính, tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ nhằm định hướng ứng dụng làm mạch máu nhân tạo. Thời gian nghiên cứu từ tháng 2 đến tháng 11 năm 2014 tại Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

Nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vật liệu sinh học thay thế mạch máu tự thân, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị các bệnh lý tắc nghẽn mạch máu, giảm thiểu biến chứng và cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân. Các chỉ số đánh giá bao gồm hiệu quả khử tế bào, bảo tồn cấu trúc khuôn ngoại bào, khả năng bám dính và tăng sinh tế bào EPC, cũng như độ bền cơ học và độc tính của khung nâng đỡ.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên hai lý thuyết chính: kỹ nghệ mô và sinh học tế bào nội mô. Kỹ nghệ mô tập trung vào việc tạo ra mô sinh học bằng cách kết hợp khung nâng đỡ (scaffold) với tế bào gốc để tái tạo mô chức năng. Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào giữ lại cấu trúc khuôn ngoại bào gồm collagen và elastin, đảm bảo tính cơ học và sinh học tương tự mạch máu tự nhiên. Tế bào tiền thân nội mô (EPC) là loại tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, đóng vai trò quan trọng trong tái tạo lớp nội mô, giúp ngăn ngừa hình thành huyết khối và duy trì chức năng mạch máu.

Ba khái niệm chính được áp dụng gồm:

  • Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào: Động mạch cảnh heo được khử tế bào bằng dung dịch SDS 0,5% trong 24 giờ, rửa nước cất 18 giờ và khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ, giữ lại cấu trúc collagen và elastin.
  • Tế bào tiền thân nội mô (EPC): Phân lập từ máu người, nuôi cấy trong môi trường EGM-2 từ 6 đến 15 ngày, biểu hiện các marker nội mô như CD105, CD146, VE-Cadherin, vWF, Thrombomodulin, KDR và không biểu hiện CD14, CD45.
  • Tương tác tế bào - khung nâng đỡ: Đánh giá sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ nhằm tạo lớp nội mô đồng nhất, tiền đề cho ứng dụng làm mạch máu nhân tạo.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm với các bước chính:

  • Thu nhận và xử lý mẫu: Động mạch cảnh heo được thu từ lò mổ, chọn mẫu có chiều dài ≥10 cm, trọng lượng heo 80-100 kg. Máu ngoại vi và máu cuống rốn người được lấy từ người khỏe mạnh và trẻ sơ sinh đủ tháng, đảm bảo tiêu chuẩn xét nghiệm an toàn.
  • Khử tế bào và khử trùng khung nâng đỡ: Động mạch được xử lý bằng SDS 0,5% lắc 60 lần/phút trong 24 giờ, rửa nước cất 18 giờ, khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ. Hiệu quả khử tế bào được đánh giá bằng nhuộm H&E, Trichrome và Verhoeff-Van Gieson. Độ bền cơ học đo bằng máy Tensilon theo tiêu chuẩn ASTM D412. Độc tính cấp tính được đánh giá bằng phương pháp MTT trên nguyên bào sợi.
  • Phân lập và nuôi cấy EPC: Tách tế bào đơn nhân từ máu bằng phương pháp ly tâm trên dung dịch Histopaque, nuôi cấy trên đĩa tráng collagen trong môi trường EGM-2, thay môi trường hàng ngày tuần đầu, sau đó 2 ngày/lần. Xác định EPC qua hình thái tế bào dạng sỏi và marker bằng flow cytometry (CD14, CD34, CD45, CD105) và RT-PCR (CD146, VE-Cadherin, Thrombomodulin, vWF, KDR).
  • Cấy tế bào lên khung nâng đỡ: Huyền phù EPC với mật độ 1x10^4 tế bào/ml được cấy trực tiếp lên khung nâng đỡ cắt đoạn 5 mm, nuôi cấy trong tủ 37°C, 5% CO2. Đánh giá sự bám dính bằng SEM và nhuộm H&E sau 3, 5, 7 ngày. Đánh giá tăng sinh bằng phương pháp MTT vào các ngày 1, 3, 5, 7, 9.
  • Xử lý số liệu: Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, so sánh các nhóm xử lý và thời gian nuôi cấy.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Hiệu quả khử tế bào và bảo tồn cấu trúc khuôn ngoại bào:

    • Khung nâng đỡ sau xử lý SDS 0,5% trong 24 giờ và rửa nước cất 18 giờ loại bỏ gần như hoàn toàn tế bào, không còn nhân tế bào theo nhuộm H&E.
    • Nhuộm Trichrome và Verhoeff-Van Gieson cho thấy collagen và elastin được bảo tồn tốt, giữ nguyên cấu trúc phiến elastin và mạng lưới collagen, đảm bảo tính cơ học.
    • Độ bền kéo trung bình đạt khoảng 1.8 MPa, vượt mức áp lực sinh lý 120 mmHg, phù hợp tiêu chuẩn ANSI/AAMI VP20-1994.

  2. Khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ hiệu quả cao:

    • Mẫu không phát hiện vi khuẩn trên môi trường thạch máu sau 7 ngày ủ, chứng tỏ khử trùng đạt yêu cầu.
    • Độc tính cấp tính đánh giá bằng phương pháp MTT trên nguyên bào sợi cho điểm 0 theo tiêu chuẩn ASTM E2526-08, không gây chết tế bào xung quanh mẫu.

  3. Phân lập và đặc điểm tế bào EPC:

    • EPC phân lập từ máu người xuất hiện sau 6-15 ngày nuôi cấy, có hình dạng cobblestone đặc trưng.
    • Flow cytometry xác nhận tế bào biểu hiện CD105 (85%), CD146 (78%), không biểu hiện CD14 và CD45 (<5%).
    • RT-PCR cho thấy biểu hiện mRNA của các gen nội mô như VE-Cadherin, Thrombomodulin, vWF, KDR, CD146 rõ rệt.

  4. Sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ:

    • SEM sau 2 ngày cấy cho thấy tế bào EPC bám dính tốt trên bề mặt khung nâng đỡ, tạo thành lớp tế bào mỏng.
    • Nhuộm H&E sau 7 ngày cho thấy lớp tế bào nội mô chưa phủ kín toàn bộ bề mặt, nhưng có sự tăng sinh rõ rệt.
    • Phương pháp MTT ghi nhận mật độ tế bào tăng 2.5 lần sau 7 ngày so với ngày đầu, chứng tỏ khả năng tăng sinh tốt trên khung nâng đỡ.

Thảo luận kết quả

Kết quả cho thấy phương pháp khử tế bào bằng SDS 0,5% kết hợp rửa nước cất hiệu quả trong việc loại bỏ tế bào khỏi động mạch cảnh heo mà vẫn bảo tồn cấu trúc collagen và elastin, đảm bảo độ bền cơ học cần thiết cho ứng dụng làm mạch máu nhân tạo. Việc khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ vừa đảm bảo vô trùng vừa không gây độc tế bào, phù hợp với yêu cầu vật liệu sinh học.

Phân lập EPC từ máu người theo quy trình nuôi cấy trong môi trường EGM-2 cho ra tế bào có đặc điểm hình thái và marker phù hợp với tế bào nội mô thực thụ, đồng thời không biểu hiện các marker dòng tạo máu, khẳng định tính đặc hiệu của tế bào. Sự bám dính và tăng sinh của EPC trên khung nâng đỡ chứng minh khả năng tương thích sinh học và tiềm năng tái tạo lớp nội mô, giúp ngăn ngừa hình thành huyết khối khi ghép in vivo.

So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả tương đồng với các báo cáo về kỹ thuật khử tế bào và sử dụng EPC trong kỹ nghệ mô mạch máu. Tuy nhiên, việc chưa phủ kín hoàn toàn bề mặt khung nâng đỡ sau 7 ngày nuôi cấy cho thấy cần tối ưu thêm phương pháp cấy tế bào hoặc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy động để tăng hiệu quả tái tạo mô.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ tăng trưởng tế bào EPC theo thời gian (MTT), hình ảnh SEM minh họa sự bám dính tế bào, bảng so sánh độ bền kéo và hiệu quả khử tế bào giữa các phương pháp xử lý.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình cấy tế bào EPC lên khung nâng đỡ

    • Áp dụng phương pháp nuôi cấy động hoặc quay để tăng khả năng bám dính và đồng nhất lớp tế bào nội mô.
    • Mục tiêu: phủ kín ≥90% bề mặt khung nâng đỡ trong vòng 14 ngày.
    • Chủ thể thực hiện: nhóm nghiên cứu kỹ thuật mô, thời gian 6 tháng.

  2. Nâng cao hiệu quả khử trùng và loại bỏ dư lượng hóa chất

    • Phát triển quy trình rửa và trung hòa glutaraldehyde sau khử trùng để giảm tối đa độc tính còn tồn dư.
    • Mục tiêu: giảm độc tính cấp tính xuống mức 0 theo tiêu chuẩn ASTM.
    • Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm vật liệu sinh học, thời gian 3 tháng.

  3. Mở rộng phân lập EPC từ các nguồn máu khác nhau

    • Khảo sát phân lập EPC từ máu cuống rốn, máu ngoại vi và dịch tủy xương để so sánh hiệu quả và đặc tính tế bào.
    • Mục tiêu: xác định nguồn tế bào tối ưu cho ứng dụng lâm sàng.
    • Chủ thể thực hiện: nhóm sinh học tế bào, thời gian 1 năm.

  4. Thử nghiệm in vivo trên mô hình động vật

    • Đánh giá khả năng tương thích, tái tạo nội mô và chức năng mạch máu nhân tạo trong cơ thể sống.
    • Mục tiêu: chứng minh tính an toàn và hiệu quả trước khi ứng dụng lâm sàng.
    • Chủ thể thực hiện: phòng thí nghiệm nghiên cứu tiền lâm sàng, thời gian 1-2 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu kỹ thuật mô và công nghệ sinh học

    • Lợi ích: Tham khảo quy trình khử tế bào, khử trùng và cấy tế bào EPC lên khung nâng đỡ, áp dụng cho các nghiên cứu phát triển mô sinh học khác.
    • Use case: Phát triển vật liệu sinh học thay thế mô tim mạch, da hoặc sụn.

  2. Bác sĩ chuyên khoa tim mạch và phẫu thuật mạch máu

    • Lợi ích: Hiểu rõ về công nghệ tạo mạch máu nhân tạo, tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh tắc nghẽn mạch máu.
    • Use case: Lựa chọn phương pháp điều trị mới cho bệnh nhân không có mạch tự thân phù hợp.

  3. Sinh viên và học viên cao học ngành công nghệ sinh học, y sinh

    • Lợi ích: Nắm bắt kiến thức chuyên sâu về kỹ thuật phân lập tế bào EPC, xử lý mô và kỹ thuật nuôi cấy mô.
    • Use case: Tham khảo làm luận văn, đề tài nghiên cứu hoặc thực hành phòng thí nghiệm.

  4. Doanh nghiệp sản xuất vật liệu y sinh và thiết bị y tế

    • Lợi ích: Nắm bắt công nghệ mới trong sản xuất ống dẫn mạch máu sinh học, phát triển sản phẩm đáp ứng nhu cầu thị trường.
    • Use case: Đầu tư nghiên cứu phát triển sản phẩm mạch máu nhân tạo, hợp tác nghiên cứu với các viện trường.

Câu hỏi thường gặp

  1. Khung nâng đỡ từ mạch máu vô bào là gì?
    Khung nâng đỡ là cấu trúc khuôn ngoại bào của mạch máu đã được loại bỏ tế bào, giữ lại collagen và elastin để tạo môi trường cho tế bào mới bám dính và phát triển. Ví dụ, động mạch cảnh heo được xử lý bằng SDS để khử tế bào mà vẫn bảo tồn cấu trúc này.

  2. Tế bào tiền thân nội mô (EPC) có vai trò gì trong kỹ nghệ mô?
    EPC là tế bào có khả năng biệt hóa thành tế bào nội mô, giúp tái tạo lớp nội mô trên khung nâng đỡ, ngăn ngừa hình thành huyết khối và duy trì chức năng mạch máu nhân tạo.

  3. Phương pháp khử tế bào bằng SDS có ưu điểm gì?
    SDS là chất tẩy ion giúp phá vỡ màng tế bào và loại bỏ nhân hiệu quả, đồng thời ít làm biến tính protein trong khuôn ngoại bào, giúp bảo tồn cấu trúc collagen và elastin quan trọng cho tính cơ học.

  4. Tại sao cần khử trùng khung nâng đỡ?
    Khử trùng loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm khuẩn, đảm bảo an toàn khi ghép in vivo. Phương pháp khử trùng bằng glutaraldehyde được ưu tiên vì ít ảnh hưởng đến cấu trúc khuôn ngoại bào và có hiệu quả diệt khuẩn cao.

  5. Làm thế nào để đánh giá sự tăng sinh của tế bào EPC trên khung nâng đỡ?
    Phương pháp MTT được sử dụng để đo hoạt động chuyển hóa của tế bào sống, từ đó đánh giá mật độ và khả năng tăng sinh của EPC theo thời gian nuôi cấy.

Kết luận

  • Đã tạo thành công khung nâng đỡ từ động mạch cảnh vô bào của heo với cấu trúc collagen và elastin được bảo tồn, độ bền cơ học phù hợp tiêu chuẩn sinh lý.
  • Phân lập và nuôi cấy thành công tế bào tiền thân nội mô từ máu người, xác định đặc điểm hình thái và marker đặc trưng.
  • Tế bào EPC bám dính và tăng sinh trên khung nâng đỡ, tạo tiền đề cho việc tái tạo lớp nội mô trong mạch máu nhân tạo.
  • Khử trùng bằng glutaraldehyde 0,15% trong 1 giờ đạt hiệu quả vô trùng và không gây độc tế bào cấp tính.
  • Nghiên cứu mở hướng phát triển ống dẫn mạch máu nhân tạo ứng dụng trong điều trị bệnh lý tắc nghẽn mạch máu, cần tiếp tục tối ưu kỹ thuật cấy tế bào và thử nghiệm in vivo.

Next steps: Tối ưu phương pháp cấy tế bào, mở rộng phân lập EPC từ các nguồn khác, đánh giá in vivo trên mô hình động vật.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học được khuyến khích hợp tác phát triển sản phẩm mạch máu nhân tạo dựa trên nền tảng nghiên cứu này.