Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn atyucca6 từ cây arabidopsis thaliana

Luận văn thạc sĩ công nghệ sinh học tập trung tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana.

• Tác giả: Ma Thị Thu Lệ
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Tiến Dũng
• Trường học: Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Tách Dòng Và Thiết Kế Vector Chuyển Gene Chịu Hạn AtYUCCA6 Từ Cây Arabidopsis Thaliana
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thái Nguyên

Tóm tắt

I. Mở đầu

Luận văn thạc sĩ này tập trung vào việc tách dòng gene và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn ATYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana. Hạn hán là một trong những thách thức lớn đối với an ninh lương thực toàn cầu, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu. Việc phát triển các giống cây trồng có khả năng chịu hạn cao là rất cần thiết để nâng cao năng suất và đảm bảo an toàn lương thực. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập và thiết kế thành công vector chuyển gene ATYUCCA6, từ đó đánh giá khả năng biểu hiện của gene này trên cây Arabidopsis thaliana. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gene trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chính của nghiên cứu là phân lập, tách dòng gene và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn ATYUCCA6. Nghiên cứu sẽ đánh giá khả năng biểu hiện của gene này trên cây Arabidopsis thaliana. Việc này không chỉ giúp khẳng định vai trò của gene ATYUCCA6 trong việc cải thiện khả năng chịu hạn mà còn mở ra hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

1.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu này có ý nghĩa khoa học quan trọng trong việc khẳng định cơ sở lý thuyết cho kỹ thuật chuyển gene trong cải thiện tính chịu hạn của cây trồng. Kết quả nghiên cứu sẽ là tài liệu tham khảo quý giá cho các nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Về mặt thực tiễn, việc thiết kế thành công vector chuyển gene ATYUCCA6 sẽ cung cấp vật liệu quan trọng cho các nghiên cứu ứng dụng trong nông nghiệp, góp phần nâng cao năng suất cây trồng và đảm bảo an ninh lương thực.

II. Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày tổng quan về ảnh hưởng của hạn đối với thực vật, đặc biệt là các cơ chế đáp ứng của thực vật trước điều kiện hạn. Hạn hán gây ra nhiều tác động tiêu cực đến sinh trưởng và phát triển của thực vật, từ việc thay đổi biểu hiện gene đến các phản ứng sinh lý. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng gene ATYUCCA6 có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp auxin, hormone sinh trưởng giúp cây vượt qua điều kiện hạn. Việc hiểu rõ về các gene chịu hạn và cơ chế hoạt động của chúng là rất cần thiết để phát triển các giống cây trồng có khả năng chịu hạn tốt hơn.

2.1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật

Hạn hán ảnh hưởng đến tất cả các giai đoạn phát triển của thực vật, từ hình thái đến phân tử. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hạn làm giảm khả năng hấp thu nước, gây ra sự ngừng sinh trưởng và ảnh hưởng đến quá trình quang hợp. Sự thiếu hụt nước dẫn đến việc tăng cường tổng hợp các hormone như ABA, làm đóng khí khổng và giảm quang hợp. Điều này ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng và khả năng sinh trưởng của chúng.

2.2. Nhóm gene chịu hạn ATYUCCA

Gene ATYUCCA6 thuộc họ gene YUCCA, có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp auxin. Nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện của gene này có thể làm tăng khả năng chịu hạn của cây. Việc phân lập và nghiên cứu gene ATYUCCA6 sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế chịu hạn của thực vật, từ đó có thể ứng dụng trong việc cải thiện giống cây trồng.

III. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương này mô tả chi tiết về đối tượng, phạm vi nghiên cứu và các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu là gene ATYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana. Phương pháp nghiên cứu bao gồm sàng lọc gene, tách dòng gene, thiết kế vector chuyển gene và nghiên cứu chuyển gene trên cây Arabidopsis thaliana. Các phương pháp này được áp dụng nhằm đảm bảo tính chính xác và hiệu quả trong việc phân lập và thiết kế vector chuyển gene.

3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là gene ATYUCCA6 từ cây Arabidopsis thaliana. Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc phân lập gene, thiết kế vector và đánh giá khả năng biểu hiện của gene trên cây. Nghiên cứu được thực hiện tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, với thời gian nghiên cứu từ tháng 8 năm 2019 đến tháng 12 năm 2019.

3.2. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu bao gồm các bước sàng lọc gene, tách dòng gene, thiết kế vector chuyển gene và nghiên cứu chuyển gene. Các kỹ thuật như PCR, giải trình tự DNA và phân tích biểu hiện gene được sử dụng để đảm bảo tính chính xác trong quá trình nghiên cứu. Việc áp dụng các phương pháp này giúp đạt được kết quả đáng tin cậy và có giá trị thực tiễn cao.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Ảnh hưởng của hạn đối với thực vật Hạn đối với thực vật là khái niệm đựợc dùng để chỉ trạng thái thiếu nước do môi trường gây nên trong suốt quá trình sống hay trong từng giai đoạn sống, làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Môi trường khô hạn gây ra hàng loạt những tác động tiêu cực tới thực vật ở tất cả các cấp độ, từ hình thái tới phân tử và ở tất cả các giai đoạn phát triển [4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất cây trồng. Hạn làm thay đổi nhiều quá trình sinh lý và có thể làm bi 4].ối với thực ác yếu tố môi tH 4].ối với thực ác yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất tới sinh trưởng và năng suất câng mưa, giảm lượng ẩm trong không khí, suy kiệt dòng chảy sông suối, hạ thấp mực nước ao hồ, mực nước trong các tầng chứa nước dưới đất, … Xét trên mối quan hệ giữa hạn với thực vật, hạn của môi trường được chia làm hai kiểu: Hạn đất và hạn không khí [3].

- Hạn đất: Hạn đất xuất hiện khi không có mưa trong thời gian dài, khi cây không thể hút đủ nước bù đắp lại lượng nước mất đi qua con đường thoát hơi nước, dẫn tới sự mất cân bằng nước trong cây và cây có dấu hiệu bị khô héo. - Hạn không khí: Hạn không khí xuất hiện khi độ ẩm tương đối của không khí giảm xuống quá thấp, gia tăng gradient hơi nước giữa không gian bên trong lá dưới khí khổng và không gian ngay bên ngoài lá, thoát hơi nước tăng nhanh, gây nên sự mất cân bằng nước trong mô cây và cây bị héo a. Ảnh hưởng của hạn đến sinh trưởng và phát triển của thực vật. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về khả năng chống chịu của thực vật trước các điều kiện phi sinh học.

Nhiệt độ cao, hạn và nồng độ muối cao là những yếu tố gây hại lớn nhất, ảnh hưởng nghiêm trọng đến thực vật. Nhiệt độ cao ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc protein, màng sinh chất và làm ngừng các quá trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 4 quang hợp, hô hấp nội bào và thậm chí có thể gây chết tế bào hàng loạt. Trong khi đó, hạn và mặn làm giảm thế nước của thực vật, làm tế bào không thể phát triển, phá vỡ các protein trong tế bào, gây mất cân bằng ion dẫn đến các hoạt động trao đổi chất bị đình trệ, quang hợp bị ức chế và có thể gây chết tế bào [2]. Ảnh hưởng của hạn đến sự sinh trưởng và hấp thu nước Đáp ứng đầu tiên của thực vật đối với điều kiện bất lợi gây ra bởi hạn là ngừng sinh trưởng.

Sự hạn chế sinh trưởng của chồi trong điều kiện hạn làm giảm nhu cầu trao đổi chất của thực vật và kích thích các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất bảo vệ, điều chỉnh thẩm thấu. Sự ngưng sinh trưởng ở rễ cho phép mô phân sinh của rễ vẫn thực hiện chức năng và phát triển nhanh chóng khi điều kiện bất lợi giảm. Hạn chế sự phát triển rễ bên cũng là một cách thức đáp ứng hạn, điều này thúc đẩy sự sinh trưởng của rễ chính, giúp tăng cường khả năng hấp thu nước từ các tầng đất sâu hơn. Nước sẵn có trong tế bào bị giảm do thiếu hụt nước từ rễ lên lá, gây ra bởi sự đóng khí khổng.

Quá trình dẫn truyền nước trong cây giảm làm giảm nhu cầu dinh dưỡng của chồi, nó cũng cản trở sự dẫn truyền trong mạch gỗ và có thể hình thành một đáp ứng thích nghi. Điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một cách đối phó với hạn của thực vật. Sự tổng hợp các chất tan như polyol và proline trong điều kiện bất lợi giúp thực vật ngăn chặn sự mất nước và các chất này đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sức trương của tế bào [3]. Sự thay đổi trong sinh trưởng cùng với việc giảm hoạt động của cơ quan quang hợp do sự tiếp xúc với điều kiện bất lợi trước đó dẫn đến sự biến đổi trong sự phân chia nguồn carbon giữa các tế bào/mô sản xuất và tế bào/mô tích trữ.

Vì vậy, các phân tử carbohydrate cung cấp cho quá trình sinh trưởng trong điều kiện bình thường bây giờ được dùng cho sinh trưởng rễ hoặc để tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu [1]. Ảnh hưởng của hạn đến quang hợp Sự thiếu hụt nước đã làm tăng cường tổng hợp ABA khiến cho khí khổng đóng lại. Điều này làm giảm hàm lượng CO2 trong mô lá và cản trở quá trình quang hợp. Sự cản trở quá trình quang hợp sẽ mất đi và quang hợp sẽ phục hồi nếu khí khổng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 5 mở ra khi điều kiện trở lại bình thường.

Một vài loài thực vật đã sử dụng sản phẩm của quang hợp để điều chỉnh thẩm thấu, điều này giúp ngăn cản sự mất sức trương của tế bào. Sự hạn chế CO2 do kéo dài thời gian đóng khí khổng trong điều kiện bất lợi dẫn đến sự tích lũy các hợp chất làm giảm khả năng vận chuyển electron, điều này có thể làm giảm các phân tử oxy và tăng cường các dạng ROS (reactive oxygene species). ROS là các phân tử hóa học chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp vỏ ngoài cùng như superoxide, hydropeoxide, hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gây tác động trực tiếp đến các phân tử lớn như axit nucleic (DNA và RNA), protein và lipid.

Các phân tử bị oxy hóa bởi ROS có thể bị biến đổi cấu trúc và cơ chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng hoặc mất chức năng, thậm chí gây chết tế bào [3]. Ảnh hưởng của hạn đến hô hấp nội bào Sinh trưg của hạn đến hô hấp nội bàoc chứa oxi, bị mất một điện tử ở lớp 2 đưh trưg của hạn đến hô hấp nội bào2 thh trưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp - ATP, nưg của hạn đến hô hấp nội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển của thực vật). Trong điều kiện hạn, các quá trình này bị ảnh hưởng và dẫn đến sự tăng cường hô hấp.

Bên cạnh đó, sự tăng cường hô hấp cũng là do sự kích hoạt các quá trình đòi hỏi nhiều năng lượng như tổng hợp các chất điều chỉnh thẩm thấu và chống oxi hóa xảy ra trong điều kiện hạn [1]. Ảnh hưởng của hạn đến hormone Hormone thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyl. Việc tích lũy các hợp chất ROS trong tế bào gt triển của tàm khí khổng đóng lại và cản trở quá trình sinh trưởng của thực vật, vì vậy nó cho phép thực vật thích ứng với điều kiện hạn [1]. Ở lúa mne thcủa hạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các quá trình mà chúng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 6 sử dụng sản phẩm của hô hấp hydroxyhống chịu hạn.

Kết quả theo dõi 9-cis- epoxycarotenoid dioxygenease (NCED3), mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được điều chỉnh bởi các A. thaliana trong điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hấp được hiong[34]. Bên c điana, mhạn đến hormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chống chịu với hạn. Ở lúa mì, khả năng chống chịu hạn đã được hỗ trợ bởi sự giảm hàm lượng indole-3-acetic acid (IAA) ormo.

gihiên, có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai đoạn đầu tiếp Cytokinin đư có m(IAA) ormonenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của gene ipt liên quan đm(IAA) ormonenội bệ số hôn dẫn đến những đáp ứng hạn. Cytokinin cũng gây ng hạnnenội bệ số hô hượng auxin cũng có sự biến đổi khi thực vật chốsuốt giai có sự tăng cường biểu hiện của đó giúp thực vật tậchịu hạn của A. Brassinosteroid (BR) cũng đã được báo cáo rằng có khả năng bảo vệ thực vật chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học. BR làm tăng cường khả năng hấp thu nước và ổn định màng cũng như làm giảm sự rò rỉ ion khỏi màng ở lúa mì khi chống chịu với hạn.

Đáp ứng hạn của thực vật Tính chịu hạn của những thực vật ở cạn hạn sinh có bản chất di truyền, thể hiện ra ở các thích nghi về hình thái và sinh lý. Một số giảm thiểu sự thoát hơi nước nhờ có lớp cutin dày, khí khổng nằm sâu, thân mọng nước, lá có thể tiêu giảm, sử dụng nước hiệu quả bằng cách tiến hành quang hợp theo con đường CAM. Một số ngừng sinh trưởng cho đến khi điều kiện trở lại bình thường. Một số có chu kỳ sinh dưỡng ngắn, chỉ trong vài tuần.

Khi có mưa, đất ẩm, hạt giống của chúng nảy mầm. Chúng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.vn 7 trưởng và phát triển thật nhanh chóng, hình thành hạt trước khi mùa khô hạn đến [3]. Thực vật có những cơ chế đáp ứng giúp chúng tăng cường tính chống chịu đối với các điều kiện bất lợi trên. Hệ thống mô hình xử lý hạn cho cây mô hình A.

thaliana đã được Amal Harb và cs thiết kế để nghiên cứu những thay đổi của cây khi bị hạn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, thực vật đáp ứng với yếu tố bất lợi qua ba giai đoạn: giai đoạn ban đầu là giai đoạn đánh giá điều kiện, tiếp đó thực vật đáp ứng tập chống chịu và cuối cùng sẽ hình thành một cân bằng mới [25]. Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua 2 con đường: phụ thuộc ABA và không phụ thuộc ABA. Theo các con đường đó các tín hiệu bất lợi từ môi trường được tế bào tiếp nhận và được dẫn truyền đến nhân theo hai con đường hoặc thông qua ABA hoặc không thông qua ABA.

Các yếu tố phiên mã gây ra sự tăng cường biểu hiện của các gene liên quan đến tính chống chịu. Các đáp ứng này sẽ bị mất dần khi điều kiện bất lợi mất đi [6].