Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú Penaeus monodon tại Việt Nam

Luận văn thạc sĩ phân tích nghiên cứu hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú penaeus monodon tại việt nam, đánh giá thực trạng, chỉ ra hạn chế, đề xuất giải pháp khả thi cho thực tiễn.

• Tác giả: Nguyễn Thị Minh Thư
• Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng
• Trường học: Trường Đại Học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh Học Thực Nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Từ Mô Cơ Của Tôm Sú Penaeus Monodon Tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận Văn Thạc Sỹ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 2. CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Đại cƣơng về Tôm Sú
• 2.2. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú
• 2.3. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng
• 2.4. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú
• 2.5. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú
• 3. CHƯƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Trang thiết bị
• 3.2. Nội dung nghiên cứu
• 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ
• 3.3.2. Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Tôm Sú Penaeus Monodon

Nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú (Penaeus monodon transcriptome) là một lĩnh vực quan trọng trong sinh học phân tử và nuôi trồng thủy sản. Tôm sú, một loài tôm có giá trị kinh tế cao, đóng góp đáng kể vào thị trường xuất khẩu của Việt Nam. Việc hiểu rõ biểu hiện gen trong tôm sú giúp nâng cao hiệu quả nuôi trồng, chọn giống và phòng chống dịch bệnh. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích giải trình tự RNA tôm sú từ mô cơ, cung cấp dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học và di truyền của loài tôm này. Các kết quả này có thể ứng dụng trong việc phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh, cải thiện tốc độ tăng trưởng và nâng cao khả năng kháng bệnh của tôm sú.

1.1. Giới thiệu về Tôm Sú Penaeus monodon

Tôm sú (Penaeus monodon), hay còn gọi là Black tiger shrimp, là một loài tôm biển thuộc họ Penaeidae. Đây là một trong những loài tôm nuôi quan trọng nhất trên thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương. Tôm sú có giá trị kinh tế cao nhờ kích thước lớn, tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Tuy nhiên, việc nuôi trồng tôm sú cũng đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm dịch bệnh và biến đổi khí hậu. Do đó, nghiên cứu về sinh học phân tử tôm sú là rất cần thiết.

1.2. Tầm quan trọng của nghiên cứu Transcriptome Tôm Sú

Nghiên cứu transcriptome tôm sú có vai trò quan trọng trong việc giải mã các cơ chế sinh học cơ bản của loài tôm này. Transcriptome là tập hợp toàn bộ các phân tử RNA được phiên mã từ DNA trong một tế bào hoặc mô tại một thời điểm nhất định. Phân tích transcriptome giúp xác định các gen đang hoạt động, mức độ biểu hiện của chúng và các con đường tín hiệu liên quan. Thông tin này có thể được sử dụng để cải thiện năng suất nuôi trồng, tăng cường khả năng kháng bệnh và phát triển các phương pháp quản lý bền vững.

II. Thách Thức và Vấn Đề Trong Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Tôm Sú

Mặc dù có tiềm năng lớn, nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú cũng đối mặt với nhiều thách thức. Một trong những khó khăn lớn nhất là kích thước genome lớn và phức tạp của tôm sú. Việc giải mã và phân tích cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú đòi hỏi nguồn lực lớn về tài chính, nhân lực và công nghệ. Ngoài ra, sự đa dạng di truyền giữa các dòng tôm sú cũng gây khó khăn trong việc so sánh và đối chiếu kết quả nghiên cứu. Dịch bệnh cũng là một vấn đề nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất nuôi trồng và gây thiệt hại kinh tế lớn.

2.1. Khó khăn trong giải trình tự và phân tích dữ liệu

Việc giải trình tự hệ gen tôm sú gặp nhiều khó khăn do kích thước bộ gen lớn và độ phức tạp cao. Dữ liệu giải trình tự cần được xử lý và phân tích bằng các công cụ tin sinh học phức tạp. Quá trình này đòi hỏi kiến thức chuyên sâu về tin sinh học và kỹ năng lập trình. Hơn nữa, việc chú giải chức năng của các gen mới phát hiện cũng là một thách thức lớn, đòi hỏi sự kết hợp giữa phân tích transcriptome và các phương pháp sinh học phân tử khác.

2.2. Ảnh hưởng của dịch bệnh đến nghiên cứu Transcriptome

Dịch bệnh là một trong những nguyên nhân chính gây thiệt hại cho ngành nuôi tôm sú. Các bệnh do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen của tôm, làm thay đổi transcriptome. Nghiên cứu transcriptome tôm sú và khả năng kháng bệnh giúp xác định các gen liên quan đến hệ miễn dịch và cơ chế kháng bệnh của tôm. Thông tin này có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp phòng ngừa và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

2.3. Thiếu hụt thông tin về hệ gen tôm sú

So với nhiều loài sinh vật mô hình khác, thông tin về gen tôm sú Penaeus monodon còn hạn chế. Điều này gây khó khăn cho việc phân tích và so sánh transcriptome với các loài khác. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú đầy đủ và chính xác là rất cần thiết để thúc đẩy các nghiên cứu tiếp theo. Các dự án giải mã bộ gen và transcriptome tôm sú đang được triển khai nhằm giải quyết vấn đề này.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Tôm Sú Hiện Đại

Các phương pháp nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú ngày càng được cải tiến nhờ sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử và tin sinh học. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) cho phép giải trình tự hàng loạt các phân tử RNA một cách nhanh chóng và hiệu quả. Các phương pháp phân tích tin sinh học giúp xử lý và phân tích dữ liệu giải trình tự, xác định các gen biểu hiện khác biệt và các con đường tín hiệu liên quan. Các nghiên cứu so sánh transcriptome giữa các dòng tôm sú khác nhau cũng cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng di truyền và khả năng thích nghi của loài tôm này.

3.1. Ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới NGS

Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) đã cách mạng hóa nghiên cứu transcriptome. NGS cho phép giải trình tự hàng triệu phân tử RNA một cách nhanh chóng và hiệu quả, cung cấp một bức tranh toàn diện về biểu hiện gen trong tế bào. Các nền tảng NGS phổ biến bao gồm Illumina, PacBio và Oxford Nanopore. Mỗi nền tảng có ưu và nhược điểm riêng, tùy thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và nguồn lực sẵn có.

3.2. Phân tích tin sinh học trong nghiên cứu Transcriptome

Dữ liệu giải trình tự từ NGS cần được xử lý và phân tích bằng các công cụ tin sinh học. Các bước phân tích bao gồm: kiểm tra chất lượng dữ liệu, loại bỏ các trình tự thừa, ánh xạ các trình tự đọc vào bộ gen tham chiếu, đếm số lượng đọc cho mỗi gen và phân tích biểu hiện gen khác biệt. Các công cụ tin sinh học phổ biến bao gồm: Bowtie, TopHat, Cufflinks, DESeq2 và edgeR.

3.3. Nghiên cứu so sánh Transcriptome giữa các dòng tôm sú

Nghiên cứu so sánh transcriptome giữa các dòng tôm sú khác nhau giúp xác định các gen liên quan đến các đặc điểm quan trọng như tốc độ tăng trưởng, khả năng kháng bệnh và khả năng thích nghi với môi trường. Các nghiên cứu này có thể được sử dụng để chọn lọc và lai tạo các dòng tôm sú có năng suất cao và khả năng chống chịu tốt hơn. Phân tích biểu hiện gen khác biệt giữa các dòng tôm có thể tiết lộ các cơ chế di truyền đằng sau các đặc điểm này.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Tôm Sú

Nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú có nhiều ứng dụng thực tiễn trong nuôi trồng thủy sản và quản lý dịch bệnh. Thông tin về biểu hiện gen có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh sớm, giúp người nuôi tôm phát hiện và xử lý dịch bệnh kịp thời. Nghiên cứu transcriptome tôm sú và tăng trưởng giúp xác định các gen liên quan đến tốc độ tăng trưởng, từ đó có thể chọn giống và lai tạo các dòng tôm có năng suất cao hơn. Ngoài ra, nghiên cứu transcriptome tôm sú và sinh sản cũng giúp hiểu rõ hơn về quá trình sinh sản của tôm, từ đó có thể cải thiện hiệu quả sinh sản trong nuôi trồng.

4.1. Phát triển marker phân tử từ Transcriptome tôm sú

Phát triển marker phân tử từ transcriptome tôm sú là một ứng dụng quan trọng trong chọn giống và quản lý di truyền. Các marker phân tử có thể được sử dụng để xác định các dòng tôm có các đặc điểm mong muốn, chẳng hạn như khả năng kháng bệnh hoặc tốc độ tăng trưởng nhanh. Các marker này cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự đa dạng di truyền trong quần thể tôm và ngăn ngừa sự suy giảm di truyền.

4.2. Nghiên cứu chức năng gen tôm sú

Nghiên cứu chức năng gen tôm sú là một lĩnh vực quan trọng để hiểu rõ hơn về sinh học của loài tôm này. Các phương pháp như RNA interference (RNAi) và CRISPR-Cas9 có thể được sử dụng để tắt hoặc chỉnh sửa các gen cụ thể và quan sát ảnh hưởng của chúng đến các đặc điểm của tôm. Các nghiên cứu này có thể giúp xác định các gen quan trọng cho sự phát triển, sinh sản và khả năng kháng bệnh của tôm.

4.3. Ứng dụng trong chẩn đoán và phòng ngừa dịch bệnh

Nghiên cứu transcriptome tôm sú có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán và phòng ngừa dịch bệnh hiệu quả hơn. Phân tích biểu hiện gen trong tôm bị nhiễm bệnh có thể giúp xác định các gen liên quan đến phản ứng miễn dịch và cơ chế gây bệnh. Thông tin này có thể được sử dụng để phát triển các bộ kit chẩn đoán nhanh và chính xác, cũng như các vaccine và phương pháp điều trị mới.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Hệ Phiên Mã Tôm Sú Tương Lai

Nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú đã đạt được nhiều tiến bộ đáng kể trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của công nghệ sinh học phân tử và tin sinh học. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều câu hỏi chưa được giải đáp và nhiều cơ hội để khám phá. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc giải mã toàn diện bộ gen tôm sú, xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome đầy đủ và chính xác, và ứng dụng các kết quả nghiên cứu vào thực tiễn nuôi trồng thủy sản. Hợp tác quốc tế và chia sẻ dữ liệu là rất quan trọng để thúc đẩy sự phát triển của lĩnh vực này.

5.1. Tầm quan trọng của hợp tác quốc tế

Hợp tác quốc tế đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy nghiên cứu hệ phiên mã tôm sú. Các dự án hợp tác có thể chia sẻ nguồn lực, kiến thức và kinh nghiệm, giúp đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu và tránh trùng lặp. Các dự án hợp tác cũng có thể tạo ra các cơ sở dữ liệu transcriptome lớn hơn và toàn diện hơn, có lợi cho cộng đồng nghiên cứu toàn cầu.

5.2. Phát triển các công cụ tin sinh học chuyên dụng

Việc phát triển các công cụ tin sinh học chuyên dụng cho phân tích transcriptome tôm sú là rất cần thiết. Các công cụ này nên được thiết kế để xử lý dữ liệu giải trình tự lớn, chú giải chức năng của các gen mới phát hiện và tích hợp dữ liệu từ các nguồn khác nhau. Các công cụ này cũng nên dễ sử dụng và có giao diện thân thiện với người dùng.

5.3. Nghiên cứu ứng dụng trong điều kiện nuôi trồng thực tế

Các nghiên cứu transcriptome tôm sú nên được thực hiện trong điều kiện nuôi trồng thực tế để đảm bảo tính ứng dụng của kết quả. Các nghiên cứu này nên xem xét các yếu tố như môi trường, chế độ dinh dưỡng và quản lý dịch bệnh. Kết quả của các nghiên cứu này có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp nuôi trồng bền vững và hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ngành nuôi tôm sú (Penaeus monodon) giữ vai trò chiến lược trong cơ cấu kinh tế thủy sản Việt Nam, đóng góp trên 50% tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu toàn ngành tôm. Theo thống kê của Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD và tăng trưởng mạnh mẽ đạt gần 2,94 tỷ USD trong 9 tháng đầu năm 2014, hướng tới mốc 3,8 tỷ USD vào cuối năm. Diện tích nuôi tôm trên cả nước mở rộng từ 530.000 ha năm 2012 lên 600.000 ha năm 2014 với sản lượng ước tính 270.000 tấn, phục vụ xuất khẩu tới 92 thị trường quốc tế.

Mặc dù có tiềm năng kinh tế vượt trội, ngành sản xuất tôm sú đối mặt với thách thức lớn về dịch bệnh do virus và sự thiếu hụt nguồn giống bản địa có chất lượng di truyền ổn định. Kích thước hệ gen của tôm sú rất lớn với hơn 2 tỷ cặp base, tương đương 2/3 bộ gen người. Việc giải mã toàn bộ hệ gen đòi hỏi kinh phí lên tới hàng chục triệu USD và kéo dài nhiều năm. Do đó, nghiên cứu hệ phiên mã (transcriptome) thông qua giải mã thẻ trình tự biểu hiện và RNA-Seq nổi lên như một giải pháp đột phá, tiết kiệm chi phí để xác định các gen chức năng quan trọng.

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh học thực nghiệm do học viên Nguyễn Thị Minh Thư thực hiện trong giai đoạn 2012 - 2014 tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật phối hợp cùng Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nghiên cứu tập trung vào mô cơ của tôm sú thu thập tại vùng biển Nghệ An thuộc khu vực Bắc Trung Bộ. Mục tiêu cốt lõi của đề tài là xây dựng quy trình tách chiết, tinh sạch mRNA, tổng hợp thư viện cDNA chất lượng cao và giải trình tự hệ phiên mã mô cơ bằng công nghệ thế hệ mới NGS. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu phân tử giá trị, hỗ trợ phát hiện các chỉ thị phân tử nhằm nâng cao tỷ lệ sống và tăng trưởng từ 10% đến 15% cho tôm nuôi thương phẩm.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết hệ phiên mã (Transcriptome Theory) và nguyên lý giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS). Hệ phiên mã đại diện cho toàn bộ các phân tử RNA hoàn chỉnh được biểu hiện tại một thời điểm xác định trong mô cơ quan, phản ánh chính xác các quá trình sinh lý và biến đổi sinh hóa của cơ thể sinh vật.

Trong nghiên cứu sinh học phân tử giáp xác, tôm sú thuộc bộ Thập túc (Decapoda), có kích thước cơ thể trưởng thành đạt tới 330 mm. Bộ nhiễm sắc thể của loài gồm 44 cặp, trong đó có 40 cặp dạng tâm giữa (metacentric), 1 cặp tâm lệch (submetacentric) và 3 cặp tâm mút (acrocentric). Các khái niệm lý thuyết trung tâm được áp dụng gồm:

• Axit ribonucleic thông tin trưởng thành (mature mRNA): Phân tử mang mã di truyền đã trải qua quá trình gắn mũ đầu 5', gắn đuôi polyA đầu 3' và cắt bỏ các đoạn intron không mã hóa.
• DNA bổ sung (cDNA): Chuỗi DNA được tổng hợp nhân tạo từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase).
• Thẻ trình tự biểu hiện (EST) và Contigs: Các đoạn trình tự DNA ngắn từ 200 đến 500 nucleotide và các vùng trình tự nằm kề nhau được ghép nối trong quá trình phân tích tin sinh học.
• Nguyên lý giải trình tự bằng tổng hợp (Sequencing by Synthesis - SBS): Kỹ thuật sử dụng các nucleotide kết thúc hồi tính có gắn huỳnh quang (Reversible Terminators) trên vi bản Flow Cell của hệ thống Illumina.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 10 cá thể tôm sú khỏe mạnh được thu thập trực tiếp tại vùng biển tự nhiên tỉnh Nghệ An. Phương pháp chọn mẫu là chọn mẫu chủ đích kết hợp sàng lọc nghiêm ngặt các bệnh lý nguy hiểm. Tất cả cá thể tôm đều được kiểm tra và xác nhận âm tính với 5 loại virus gây hại phổ biến gồm WSSV, IHHNV, YHV, MBV và virus gây hội chứng Taura.

Quy trình thực nghiệm và phân tích được triển khai qua các bước:

1. Tách chiết RNA tổng số: Đồng hóa 100 mg mô cơ trong dung dịch Trizol, ly tâm 12.000 vòng/phút ở 4°C, kết tủa bằng isopropanol và rửa bằng cồn 70%.
2. Tinh sạch mRNA: Sử dụng bộ kit Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit dựa trên nguyên lý hạt từ tính gắn đoạn dò oligo(dT), xử lý nhiệt ở 70°C trong 2 phút để loại bỏ hoàn toàn rRNA và tạp chất.
3. Tổng hợp và khuếch đại cDNA: Phân cắt mRNA ở 94°C trong 8 phút, tổng hợp cDNA sợi một và sợi hai, gắn đầu nối adaptor chuyên biệt và khuếch đại 14 chu kỳ PCR bằng Platinum PCR SuperMix High Fidelity.
4. Đọc trình tự thế hệ mới: Tiến hành trên hệ thống máy Illumina MiSeq với công suất đạt 8 Gb mỗi lần chạy.
5. Phân tích tin sinh học: Sử dụng phần mềm Cutadapt để loại bỏ trình tự adaptor cùng các đoạn đọc có chỉ số chất lượng Q nhỏ hơn 20 hoặc tỷ lệ base N lớn hơn 2%. Tiếp đó, phần mềm Trinity thực hiện lắp ráp de novo và phần mềm TGICL tiến hành gom cụm để tạo các unigene tối ưu.

Lý do lựa chọn hệ thống Illumina MiSeq kết hợp lắp ráp de novo là vì tôm sú chưa có bản đồ hệ gen chuẩn hoàn chỉnh. Công nghệ này cung cấp chiều dài đọc cặp paired-end ổn định, sai số dưới 2%, khắc phục được hạn chế chi phí đắt đỏ của phương pháp Sanger truyền thống và vấn đề lỗi chuỗi đơn nucleotide lặp lại của các công nghệ bán dẫn thế hệ cũ. Toàn bộ tiến trình nghiên cứu được triển khai xuyên suốt trong khung thời gian 24 tháng.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã ghi nhận những phát hiện thực nghiệm quan trọng với độ tin cậy khoa học cao:

Thứ nhất, hàm lượng RNA tổng số tách chiết từ mô cơ của 10 cá thể tôm sú Nghệ An đạt độ đồng đều cao, dao động trong khoảng từ 2152,1 ng đến 2425,9 ng. Tỷ số quang phổ hấp thụ A260/A280 đạt từ 1,85 đến 2,01, chứng minh độ sạch tuyệt đối và không bị nhiễm protein hay hóa chất hữu cơ. Trong đó, mẫu NA9 đạt 2385,8 ng và mẫu NA10 đạt 2425,9 ng đã được chọn lựa thành công cho các bước tinh chế chuyên sâu.

Thứ hai, quá trình tinh sạch bằng hạt từ tính thu được nồng độ mRNA đạt trên 20 ng/µL, tỷ số A260/A280 vượt ngưỡng chuẩn 1,8. Đây là điều kiện kỹ thuật bắt buộc để triển khai phản ứng tổng hợp chuỗi cDNA bổ sung.

Thứ ba, thư viện cDNA từ mô cơ sau khi gắn adaptor và làm giàu qua phản ứng PCR đạt nồng độ 17,1 ng/µL ở mẫu GM4. Phân tích kích thước đoạn gen trên thiết bị Bioanalyzer cho thấy các phân đoạn tập trung chủ yếu trong dải kích thước chuẩn từ 264 đến 500 bp.

Thứ tư, quá trình giải trình tự trên máy Illumina MiSeq đã tạo ra hàng triệu đoạn đọc ngắn với công suất đạt tới 8 Gb. Sau bước tiền xử lý lọc bỏ hơn 98% tạp nhiễu kỹ thuật, dữ liệu được lắp ráp de novo thành công thành hàng nghìn contigs và unigenes đại diện cho các gen chức năng biểu hiện trong mô cơ tôm sú.

Thảo luận kết quả

Kết quả thu nhận hàm lượng RNA tổng số trên 2100 ng và nồng độ cDNA thư viện 17,1 ng/µL khẳng định tính chuẩn xác của quy trình xử lý mẫu mô cơ bằng nitơ lỏng kết hợp tinh chế ái lực hạt từ. Việc kiểm soát phân cắt mRNA ở 94°C trong 8 phút đã tạo ra phổ kích thước cDNA 264 - 500 bp hoàn hảo cho buồng nạp Flow Cell của máy Illumina MiSeq.

Khi so sánh với các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam sử dụng máy đọc thế hệ cũ ABI PRISM 3100 theo phương pháp Sanger vốn chỉ thu được vài chục đến hàng trăm đoạn EST đơn lẻ, nghiên cứu này đã tạo ra bước nhảy vọt về dung lượng dữ liệu gấp hơn 10.000 lần. So với các công trình quốc tế tại Thái Lan thu nhận 10.100 clone năm 2006 hay Đài Loan phân tích 256 chỉ thị microsatellite năm 2010, kết quả giải mã hệ phiên mã mô cơ tôm sú Nghệ An bằng công nghệ NGS đã rút ngắn thời gian phân tích từ nhiều tháng xuống còn dưới 48 giờ chạy máy, đồng thời cắt giảm hơn 80% chi phí vận hành.

Dữ liệu nghiên cứu được trình bày một cách trực quan thông qua:

• Bảng đối chiếu nồng độ quang phổ NanoDrop minh họa sự đồng nhất về hàm lượng RNA tổng số giữa 10 mẫu khảo sát.
• Biểu đồ phân tích điện di huỳnh quang Bioanalyzer với dạng đỉnh đơn sắc nét thể hiện dải kích thước cDNA tối ưu từ 264 đến 500 bp.
• Biểu đồ phân bố độ dài contigs và unigenes biểu thị tần suất xuất hiện của các bản phiên mã từ 200 bp đến hơn 2000 bp, hỗ trợ đắc lực cho công tác chú giải chức năng sinh học phân tử sau này.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả giải mã hệ phiên mã mô cơ tôm sú, bốn nhóm giải pháp hành động cụ thể được đề xuất nhằm ứng dụng kết quả vào thực tiễn:

1. Xây dựng và tích hợp Cơ sở dữ liệu Hệ phiên mã Tôm sú Quốc gia: Viện Công nghệ sinh học phối hợp cùng Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật số hóa 100% dữ liệu unigene và contig mô cơ đã lắp ráp. Mục tiêu hoàn thiện cổng thông tin tra cứu trực tuyến trong vòng 12 tháng, tạo nền tảng chia sẻ dữ liệu nghiên cứu cho các trường đại học và viện chuyên ngành trên cả nước.

2. Mở rộng giải trình tự transcriptome trên các mô miễn dịch và cơ quan sinh sản: Nhóm nghiên cứu thuộc các phòng thí nghiệm trọng điểm cần triển khai phân tích hệ phiên mã tế bào máu (hemocyte), tuyến gan tụy và buồng trứng tôm sú trong thời gian 18 đến 24 tháng. Đặt chỉ tiêu nhận diện ít nhất 50 gen ứng viên liên quan trực tiếp đến khả năng kháng virus đốm trắng WSSV và hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính.

3. Phát triển các bộ chỉ thị phân tử microsatellite và SNP đặc hiệu: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, 2 và 3 chủ trì ứng dụng các unigene mô cơ để thiết kế các marker phân tử phục vụ chương trình chọn giống tôm bố mẹ. Mục tiêu đến năm thứ hai nâng cao độ chính xác trong chọn lọc tính trạng tăng trưởng nhanh và tăng tỷ lệ chuyển đổi thịt lên từ 15% đến 20%.

4. Chuyển giao quy trình sàng lọc chất lượng di truyền cho các cơ sở sản xuất giống: Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cùng Hiệp hội VASEP ban hành tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm định đàn tôm bố mẹ dựa trên dữ liệu phân tử. Kế hoạch triển khai trong 3 năm nhằm áp dụng quy trình kiểm soát di truyền cho tối thiểu 50% trại giống tập trung tại các tỉnh duyên hải miền Trung như Nghệ An, Khánh Hòa, Ninh Thuận.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng sâu rộng cho bốn nhóm đối tượng chính:

1. Học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học và Nuôi trồng thủy sản: Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về quy trình tách chiết RNA mô khó, kỹ thuật tinh sạch mRNA bằng hạt từ tính Dynabeads và phương pháp xây dựng thư viện cDNA đạt chuẩn giải trình tự NGS.

2. Các nhà khoa học và chuyên viên tin sinh học (Bioinformatics): Đây là tài liệu thực tế giá trị để tiếp cận quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự thô (raw reads), phương pháp lọc chất lượng bằng Cutadapt, kỹ thuật lắp ráp de novo hệ phiên mã sinh vật nhân thực bằng Trinity và quy trình giảm độ dư thừa unigene bằng TGICL.

3. Chuyên gia di truyền và chọn tạo giống thủy sản tại các viện nghiên cứu: Nguồn dữ liệu EST và các unigene mô cơ là cơ sở dữ liệu nền tảng giúp khai thác các gen quy định cấu trúc sợi cơ, các hormone điều hòa sinh trưởng, phục vụ thiết kế các cặp mồi PCR định danh kiểu gen.

4. Doanh nghiệp và chủ cơ sở sản xuất giống tôm nước lợ: Nghiên cứu giúp các nhà quản lý kỹ thuật nắm bắt cơ chế biểu hiện gen của đàn tôm bản địa, từ đó xây dựng tiêu chí tuyển chọn nguồn tôm bố mẹ tự nhiên chất lượng cao, hạn chế rủi ro dịch bệnh và nâng cao hiệu quả kinh tế.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu hệ phiên mã mô cơ lại được ưu tiên hơn giải mã toàn bộ hệ gen tôm sú? Hệ gen tôm sú có kích thước khổng lồ với hơn 2 tỷ cặp base, đòi hỏi kinh phí hàng chục triệu USD và kỹ thuật phân tích vô cùng phức tạp. Nghiên cứu hệ phiên mã chỉ tập trung vào các đoạn RNA mã hóa đang hoạt động ở mô cơ, giúp giảm hơn 90% chi phí nhưng vẫn thu được đầy đủ thông tin về các gen điều khiển sinh trưởng và phát triển cơ thịt.

2. Công nghệ giải trình tự Illumina MiSeq có ưu thế gì vượt trội so với phương pháp Sanger truyền thống? Hệ thống Illumina MiSeq sở hữu công suất giải trình tự đạt 8 Gb mỗi lần chạy với hàng triệu đoạn đọc cặp song song, sai số kiểm soát dưới 2%. Trong khi đó, phương pháp Sanger truyền thống chỉ đọc đơn lẻ từng đoạn gen với chi phí tốn kém gấp hàng trăm lần và thời gian kéo dài nhiều tháng.

3. Tiêu chuẩn nào quyết định chất lượng RNA tổng số và mRNA đạt chuẩn giải trình tự NGS? Mẫu RNA tổng số phải đạt hàm lượng tối thiểu 1000 ng và tỷ số quang phổ A260/A280 trong khoảng 1,8 đến 2,0. Đối với phân đoạn mRNA tinh sạch qua hạt từ tính, nồng độ dung dịch phải đạt từ 20 ng/µL trở lên nhằm bảo đảm hiệu suất cho phản ứng tổng hợp cDNA phân đoạn từ 264 đến 500 bp.

4. Phần mềm tin sinh học nào được sử dụng để lắp ráp hệ phiên mã khi chưa có bộ gen tham chiếu? Đề tài sử dụng phần mềm Trinity để thực hiện lắp ráp de novo các đoạn đọc ngắn thành contigs mà không cần bộ gen tham chiếu. Sau đó, phần mềm TGICL được ứng dụng để loại bỏ các đoạn trình tự trùng lặp, giữ lại tập hợp unigenes hoàn chỉnh và đặc trưng nhất của mô cơ.

5. Dữ liệu hệ phiên mã mô cơ đóng góp thế nào vào chiến lược phát triển tôm sú bền vững tại Việt Nam? Dữ liệu cung cấp danh mục các gen chức năng quy định tốc độ tăng trưởng cơ thể và quá trình chuyển hóa năng lượng. Điều này giúp các nhà khoa học nhanh chóng thiết lập các chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống nhân tạo, nâng cao tỷ trọng xuất khẩu tôm sú đạt mốc kỳ vọng trên 3,8 tỷ USD.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình chuẩn tách chiết RNA tổng số từ mô cơ 10 mẫu tôm sú tự nhiên tại Nghệ An với hàm lượng cao đạt từ 2152,1 ng đến 2425,9 ng, độ tinh sạch A260/A280 đạt chuẩn 1,85 - 2,01.
• Tinh chế thành công mRNA nồng độ trên 20 ng/µL bằng hạt từ tính Dynabeads và tổng hợp thư viện cDNA chất lượng cao với kích thước phân đoạn tập trung từ 264 đến 500 bp, nồng độ đạt 17,1 ng/µL.
• Ứng dụng thành công công nghệ giải trình tự thế hệ mới Illumina MiSeq với công suất 8 Gb để giải mã toàn diện hệ phiên mã mô cơ tôm sú bản địa Việt Nam.
• Chuẩn hóa quy trình phân tích tin sinh học tiền xử lý chất lượng đoạn đọc bằng Cutadapt, lắp ráp de novo bằng Trinity và rút gọn unigene bằng công cụ TGICL.
• Cung cấp nguồn dữ liệu hệ gen biểu hiện có giá trị khoa học và thực tiễn, tạo tiền đề then chốt cho các chương trình chọn giống phân tử kháng bệnh và tăng trưởng nhanh.

Trong giai đoạn 12 đến 24 tháng tiếp theo, các đơn vị nghiên cứu cần tiếp tục mở rộng giải trình tự transcriptome trên các mô miễn dịch và gan tụy để hoàn thiện bản đồ biểu hiện gen toàn diện. Các nhà khoa học, học viên và doanh nghiệp quan tâm có thể khai thác trực tiếp nguồn tư liệu này để phục vụ công tác nghiên cứu chuyên sâu và ứng dụng vào thực tế nuôi trồng thủy sản.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của Việt Nam cũng nhƣ nhiều quốc gia trong khu vực. Trong đó, ngành nuôi tôm là một trong những ngành mũi nhọn mang lại nguồn ngoại tệ lớn. Chiến lƣợc phát triển ngành nuôi trồng tôm sú ở Việt Nam cũng nhƣ của các nƣớc trong khu vực là làm sao để có đƣợc ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế đƣợc tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trƣờng, sinh thái. Nền tảng cho chiến lƣợc phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chƣơng trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trƣởng.

Để đạt đƣợc mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen (genome) tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng hết sức quan trọng. Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản đƣợc nuôi trồng và mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu cho nhiều quốc gia ở châu Á - Thái Bình Dƣơng (Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Autralia v. Năm 2008, tổng sản lƣợng tôm trên toàn thế giới đạt 6 triệu tấn, đạt giá trị thƣơng mại 10 tỷ USD, chiếm 16% tổng kim ngạch xuất khẩu hải sản (Leu và cs, 2010). Riêng ở Việt Nam, theo Hội nghị tổng kết xuất khẩu tôm năm 2012 do VASEP tổ chức vào ngày 28/12/2012 tại thành phố Hồ Chí Minh thì kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD.

Ngày 2/11/2014, tại hội nghị tổng kết nuôi tôm nƣớc lợ 2014 cho biế t: 9 tháng đầu năm 2014 xuấ t khẩ u tôm của Viê ̣t Nam đa ̣t gầ n 2,94 tỷ USD , tăng 42% so với cùng kỳ. Đến cuối năm dự báo xuất khẩu tôm sẽ đạt mức 3,8 tỷ USD. Xuất khẩu tôm nhiều năm liền độc chiếm ngôi đầu, chiếm trên 50% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản của cả nƣớc. Ở nƣớc ta nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon đã và đang phát triển mạnh trong những năm gần đây.

Thống kê cho thấy, năm 2012 tổng diện tích nuôi tôm trên cả nƣớc là 530000 héc ta (ha). Dự kiến năm 2014, con số này sẽ tăng lên Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.vn c đến 600000 ha và sản lƣợng dự kiến sẽ là 270000 tấn. Sản lƣợng nuôi tôm sú qua các năm tăng mạnh kéo theo giá trị xuất khẩu tôm sú cũng tăng nhanh tạo ra nguồn lợi đáng kể cho kinh tế nƣớc ta.Việt Nam xuất khẩu tôm vào 92 thị trƣờng, trong đó tôm sú chiếm trên 50% giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm của nƣớc ta hàng năm chịu thiệt hại rất lớn do dịch bệnh, trong đó dịch bệnh do virus đóng vai trò chủ yếu.

Vì vậy, việc kiểm tra, phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh để đề ra biện pháp phòng chống, giảm thiểu thiệt hại tới mức thấp nhất cho ngành nuôi tôm là vấn đề đƣợc nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm. Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự sinh sản, hệ miễn dịch và đặc biệt là sự điều khiển sinh trƣởng của tôm sú còn rất hạn chế do những thiếu sót thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thƣớc genome của tôm sú cũng rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen ngƣời), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí rất lớn, ƣớc tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vi vệ tinh hay lập bản đồ gen tôm sú từ giải mã EST/cDNA, bằng việc lựa chọn những gen ứng viên dự báo phù hợp với mục đích nghiên cứu, ta có thể xây dựng đƣợc các chỉ thị phân tử phục vụ cho công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan.

Việc nghiên cứu giải mã và lập bản đồ bộ gen thƣờng tập trung vào các đối tƣợng có giá trị kinh tế cao. Nhƣ đã trình bày ở trên, tôm sú là đối tƣợng nuôi trồng có giá trị kinh tế mang tính chiến lƣợc. Chính vì vậy việc phối hợp giữa các quốc gia nhằm giải mã và lập bản đồ gen tôm sú sẽ mang lại lợi ích chung cho cộng đồng và cũng là cho mỗi quốc gia. Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) là một hƣớng nghiên cứu quan trọng, tập chung nghiên cứu gen mã hóa protein và mức độ biểu hiện của chúng trong từng loại mô cơ quan, từng giai đoạn của quá trình phát triển hay trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.vn c Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu mô Cơ của Tôm Sú. Hiện nay, kết quả nghiên cứu từ mô Cơ của Tôm Sú là những dữ liệu quan trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ của Tôm Sú (penaues monodon) tại Việt Nam” 1. Mục tiêu đề tài - Tách chiết và tinh sạch đƣợc ARN thông tin (mRNA) từ mô cơ của Tôm Sú.

- Đánh giá đƣợc chất lƣợng mRNA đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự hệ phiên mã của Tôm Sú bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Chuẩn bị đƣợc mẫu, cho đi giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Phân tích hệ phiên mã mô cơ của Tôm Sú Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.vn c CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đại cƣơng về Tôm Sú 2. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ.

Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thƣớc lớn (có thể lên đến 330 mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thƣơng mại quan trọng. Hình 1 Hình ảnh tôm sú 2. Phân loại Tôm sú có tên tiếng Anh là Black tiger shrimp. Chúng thuộc ngành Arthropoda; phân ngành Crustacea; lớp Malacostraca; bộ Decapoda; phân bộ Dendrobranchiata; họ Penaeidea; giống Penaeus; loài Penaeus Monodon.

Cấu tạo Phần đầu trên của tôm sú Penaeus Monodon có chủy cứng với các răng cƣa. Phía trên của chủy có từ 7 đến 8 răng và phía dƣới chủy có 3 răng. Ở tôm sú, mũi khứu giác và râu là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. Trong khi đó 3 cặp chân hàm của tôm có tác dụng lấy thức ăn và và giúp cho việc bơi lội thì 5 cặp chân ngực ngoài tác dụng để lấy thức ăn chúng còn đƣợc tôm sử dụng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.vn c khi chúng bò.

Ngoài ra một cặp chân bụng khác cũng đƣợc dùng để bơi. Phần đuôi của tôm sú có 1 cặp chân đuôi để tôm có thể nhảy xa và điều chỉnh lên cao hay xuống thấp khi bơi. Bộ phận sinh dục của tôm sú thì nằm ở dƣới bụng. Tôm sú thuộc loại dị hình.

Tôm cái có kích thƣớc to hơn tôm đực. Khi tôm trƣởng thành, sự khác biệt giữa tôm đực và tôm cái rất rõ rang thông qua sự khác biệt của cơ quan sinh dục bên ngoài.Ở con đực, cơ quan sinh dục chính nẳm ở phía trong phần đầu ngực. Bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2. Lỗ sinh dục đực mở ra hốc hang đôi chân ngực thứ 5.

Tinh trùng của loài này thƣợng đƣợc chứa trong túi. Ở tôm cái, buồng trứng nằm dọc theo mặt lƣng phía trên với hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp hang đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dƣới bụng tôm. Phân bố Tôm sú có phạm vi phân bố rộng, từ ấn Độ Dƣơng qua hƣớng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955, Holthuis và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nƣớc vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam.

Riêng ở Việt Nam Tôm Sú phân bố rộng từ Bắc tới Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m. Tròn đó vùng phân bố chính là vùng biển miền Trung. Tôm bột , tôm giống (Juvenile) và tôm gần trƣởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Tuy nhiên, khi tôm trƣởng thành di chuyển xa bờ vì những vùng nƣớc sâu là nơi sống ƣa thích của chúng.

Sự phân bố của Tôm Sú phụ thuộc vào giai đoạn phát triển 2. Chu kỳ sống của Tôm Sú Ấu trùng tôm sú (Nauplli) đƣợc biến đổi theo 5 giai đoạn trong vòng từ 36 đến 51 giờ. Các ấu trùng tôm này thƣờng bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ. Đối với giai đoạn này, ngƣời ta không cần cung cấp thức ăn vì chúng tự sống bằng noãn hoàng.

Chúng lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ. Về kích thƣớc, nauplli 1 dài Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.20mm; nauplli 2 dài khoảng 0.20mm; nauplli 3 dài khoảng 0.20mm; nauplli 4 dài khoảng 0.20mm; nauplli 5 dài khoảng 0.20mm; Zoea đƣợc chia thành 3 giai đoạn diễn ra trong vòng từ 105 đến 120 giờ. Ở gian đoạn này, các Zoea bơi liên tục gần mặt nƣớc và lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phù du. Về kích thƣớc, zoea 1dài khoảng 1mm, dày 0.

Vào thời điểm này zoea xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt. Zoea 2 dài khoảng 1.9mm với sự xuất hiện mặt và chủy trong khi đó zoea 3 dài khoảng 2.7mm với gai trên bụng. Mysis cũng đƣợc chia ra làm 3 giai đoạn, diễn ra trong vòng 72 giờ. Các mysis bơi hƣớng xuống sâu và đuôi đi trƣớc, đầu đi sau.

Về kích thƣớc, mysis 1 dài khoảng 3.4mm, có hình dạng của tôm trƣởng thành. Ở giai đoạn này, tôm xuất hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi. Các gai bụng đƣợc thu nhỏ lại. Mysis 2: dài khoảng 4.0mm và mysis 3 dài khoảng 4.4mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy.

Tôm phải trải qua giai đoạn postlarvae là giai đoạn gần trƣởng thành, trƣớc khi phát triển thành tôm trƣởng thành. Tuổi thành thục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi.