Luận văn thạc sĩ về Aspergillus oryzae và khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn cao

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu isolation selection and identification of aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral, khảo sát thực trạng, phân tích nguyên nhân, đề xuất

• Tác giả: Vu Thi Lan
• Người hướng dẫn: Dr. Nguyen Hoang Anh, Vice Dean
• Trường học: Vietnam National University of Agriculture
• Chuyên ngành: Food technology
• Đề tài: Isolation, Selection and Identification of Aspergillus Oryzae Producing High Salt Tolerant Neutral Protease
• Loại tài liệu: thesis
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hanoi

Mục lục chi tiết

• DECLARATION
• ACKNOWLEDGEMENT
• TABLE OF CONTENT
• LIST OF ABBREVIATIONS
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• THESIS ABSTRACT
• 1. INTRODUCTION
• 2. OBJECTIVES OF STUDY
• 2.1. General objective
• 2.2. Specific objectives
• 3. Enzyme protease
• 4. Classification of proteases
• 5. Application of proteases in industries
• 5.1. Detergents industry
• 5.2. Peptide synthesis
• 5.3. Leather Industry
• 5.4. Food Industry

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên cứu Aspergillus oryzae và Protease

Nghiên cứu về Aspergillus oryzae và khả năng sản xuất protease đang thu hút sự quan tâm lớn. Protease là một nhóm enzyme quan trọng với nhiều ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau. Aspergillus oryzae được biết đến như một nguồn tiềm năng để sản xuất protease do khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng điều chỉnh gen và khả năng tiết enzyme ngoại bào, giúp quá trình thu hồi enzyme trở nên đơn giản hơn. Tuy nhiên, việc tìm kiếm các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn cao vẫn là một thách thức. Nghiên cứu này tập trung vào việc phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng Aspergillus oryzae có khả năng này từ các nguồn tự nhiên ở Việt Nam. Mục tiêu là tìm ra các chủng có tiềm năng ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống có hàm lượng muối cao.

1.1. Giới thiệu chung về Aspergillus oryzae và ứng dụng

Aspergillus oryzae là một loại nấm mốc được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất các sản phẩm lên men như nước tương, miso và sake. Nấm này có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme, trong đó có protease, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân giải protein. Ứng dụng của Aspergillus oryzae không chỉ giới hạn trong ngành thực phẩm mà còn mở rộng sang các lĩnh vực khác như sản xuất enzyme công nghiệp và xử lý chất thải. Nghiên cứu về Aspergillus oryzae tiếp tục mở ra những tiềm năng mới trong việc cải thiện quy trình sản xuất và phát triển các sản phẩm mới.

1.2. Vai trò của protease trung tính trong công nghiệp thực phẩm

Protease trung tính đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do khả năng thủy phân protein hiệu quả ở pH trung tính. Enzyme này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm lên men, giúp cải thiện hương vị và chất lượng sản phẩm. Ngoài ra, protease trung tính còn được ứng dụng trong chế biến thịt, làm mềm thực phẩm và sản xuất thức ăn cho trẻ em. Việc sử dụng protease trung tính giúp giảm độ đắng của sản phẩm và tăng cường khả năng tiêu hóa protein.

II. Thách thức trong Sản xuất Protease Chịu Mặn từ A

Mặc dù Aspergillus oryzae là một nguồn sản xuất protease tiềm năng, nhưng việc sản xuất protease chịu mặn vẫn còn nhiều thách thức. Nhiều chủng Aspergillus oryzae không có khả năng sinh trưởng và sản xuất protease hiệu quả trong môi trường có nồng độ muối cao. Điều này hạn chế ứng dụng của chúng trong các quy trình công nghiệp đòi hỏi khả năng chịu mặn. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tìm kiếm và phát triển các chủng Aspergillus oryzae có khả năng chịu mặn cao, cũng như tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để tăng cường hoạt tính protease trong môi trường có muối. Theo nghiên cứu, hoạt tính protease và độ ổn định giảm mạnh khi nồng độ muối cao, điều này gây khó khăn cho việc ứng dụng trong thực tế.

2.1. Ảnh hưởng của độ mặn đến hoạt tính protease

Độ mặn cao có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính protease của Aspergillus oryzae. Nồng độ muối cao có thể làm thay đổi cấu trúc enzyme, giảm khả năng liên kết với cơ chất và làm giảm hiệu quả thủy phân protein. Nghiên cứu cần tập trung vào việc tìm hiểu cơ chế chịu mặn của protease và phát triển các phương pháp để bảo vệ enzyme khỏi tác động tiêu cực của muối. Việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và bổ sung các chất bảo vệ có thể giúp duy trì hoạt tính protease trong môi trường có độ mặn cao.

2.2. Yêu cầu về protease chịu mặn trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống, protease chịu mặn là một yếu tố quan trọng để đảm bảo chất lượng và hương vị sản phẩm. Các enzyme này cần có khả năng hoạt động hiệu quả trong môi trường có nồng độ muối cao để phân giải protein và tạo ra các peptide và amino acid, góp phần vào quá trình tạo hương vị đặc trưng. Việc sử dụng protease chịu mặn giúp cải thiện quá trình lên men, rút ngắn thời gian sản xuất và nâng cao hiệu quả sử dụng nguyên liệu.

III. Phương pháp Phân lập và Tuyển chọn A

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân lập và tuyển chọn Aspergillus oryzae từ các nguồn tự nhiên ở Việt Nam. Các mẫu được thu thập từ các môi trường khác nhau, sau đó được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc để phân lập các chủng nấm. Các chủng Aspergillus oryzae được xác định sơ bộ dựa trên đặc điểm hình thái. Sau đó, các chủng này được đánh giá khả năng sản xuất protease bằng phương pháp khuếch tán giếng và định lượng enzyme. Các chủng có hoạt tính protease cao và khả năng chịu mặn tốt sẽ được chọn lọc để nghiên cứu sâu hơn. Theo tài liệu, bốn chủng (TB1, TB2, G2 và M1) đã được xác định sơ bộ là A. oryzae dựa trên đặc điểm hình thái.

3.1. Quy trình phân lập Aspergillus oryzae từ nguồn tự nhiên

Quy trình phân lập Aspergillus oryzae bắt đầu bằng việc thu thập các mẫu từ các nguồn tự nhiên như đất, thực vật phân hủy và các sản phẩm lên men truyền thống. Các mẫu này được xử lý và nuôi cấy trên môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) hoặc CYA (Czapek Yeast Extract Agar) để tạo điều kiện cho nấm phát triển. Sau khi nấm mọc, các khuẩn lạc nghi ngờ là Aspergillus oryzae sẽ được phân lập và cấy chuyển sang môi trường mới để thu được các chủng thuần khiết. Quá trình này đòi hỏi sự cẩn thận và kỹ năng để đảm bảo thu được các chủng nấm mong muốn.

3.2. Đánh giá hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán giếng

Phương pháp khuếch tán giếng là một kỹ thuật đơn giản và hiệu quả để đánh giá hoạt tính protease của các chủng Aspergillus oryzae. Trong phương pháp này, các chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường agar có chứa protein (ví dụ: casein). Sau khi nấm phát triển, các giếng được tạo ra trên đĩa agar và dịch nuôi cấy của các chủng nấm được cho vào giếng. Nếu chủng nấm có khả năng sản xuất protease, enzyme sẽ khuếch tán từ giếng vào môi trường xung quanh và phân giải protein, tạo ra một vùng trong suốt xung quanh giếng. Đường kính của vùng trong suốt này tỷ lệ thuận với hoạt tính protease của chủng nấm.

IV. Nghiên cứu Ảnh hưởng của pH và NaCl đến Protease từ A

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định ảnh hưởng của pH và nồng độ NaCl đến hoạt tính và độ bền của protease được sản xuất từ Aspergillus oryzae. Các thí nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính protease ở các mức pH và nồng độ NaCl khác nhau. Kết quả cho thấy hoạt tính protease của các chủng Aspergillus oryzae bị ảnh hưởng đáng kể bởi pH và nồng độ NaCl. Việc xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt tính protease là rất quan trọng để ứng dụng enzyme này trong các quy trình công nghiệp. Theo nghiên cứu, pH tối ưu cho hoạt tính protease của cả hai chủng TB1 và G2 là 7.

4.1. Tối ưu hóa pH cho hoạt tính protease

pH là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính protease. Mỗi enzyme có một pH tối ưu, tại đó enzyme hoạt động hiệu quả nhất. Nghiên cứu cần xác định pH tối ưu cho hoạt tính protease của các chủng Aspergillus oryzae được phân lập. Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách đo hoạt tính protease ở các mức pH khác nhau và xác định pH nào cho hoạt tính cao nhất. Việc tối ưu hóa pH giúp tăng cường hiệu quả của enzyme trong các ứng dụng thực tế.

4.2. Ảnh hưởng của NaCl đến độ bền của protease

Nồng độ NaCl có thể ảnh hưởng đến độ bền của protease. Muối có thể làm thay đổi cấu trúc enzyme và làm giảm hoạt tính. Nghiên cứu cần đánh giá ảnh hưởng của NaCl đến độ bền của protease bằng cách ủ enzyme ở các nồng độ NaCl khác nhau và đo hoạt tính theo thời gian. Kết quả cho thấy protease từ TB1 và G2 có khả năng chịu mặn cao ở nồng độ 16% NaCl, giữ lại lần lượt 49.8% hoạt tính ban đầu sau 9 giờ.

V. Xác định Chủng Aspergillus oryzae bằng Phương pháp Sinh học Phân tử

Để xác định chính xác các chủng Aspergillus oryzae được phân lập, nghiên cứu này sử dụng phương pháp sinh học phân tử. DNA của các chủng nấm được chiết xuất và vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của rDNA được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR được giải trình tự và so sánh với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu để xác định loài nấm. Phương pháp này giúp xác định chính xác các chủng Aspergillus oryzae và phân biệt chúng với các loài nấm khác. Theo tài liệu, chủng TB1 đã được xác định là Aspergillus oryzae bằng phương pháp phân tử.

5.1. Chiết xuất DNA và PCR vùng ITS

Quá trình chiết xuất DNA là bước quan trọng để thu được vật liệu di truyền của Aspergillus oryzae. DNA được chiết xuất từ các chủng nấm bằng các phương pháp hóa học hoặc cơ học. Sau khi chiết xuất, DNA được sử dụng làm khuôn để khuếch đại vùng ITS của rDNA bằng kỹ thuật PCR. Vùng ITS là một đoạn DNA có tính đa hình cao, giúp phân biệt các loài nấm khác nhau. Sản phẩm PCR được làm sạch và chuẩn bị cho quá trình giải trình tự.

5.2. Giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu

Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng được giải trình tự để xác định trình tự nucleotide của vùng ITS. Trình tự này sau đó được so sánh với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu như GenBank bằng các công cụ tìm kiếm như BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Kết quả so sánh giúp xác định loài nấm dựa trên mức độ tương đồng của trình tự DNA. Phương pháp này cho phép xác định chính xác các chủng Aspergillus oryzae và phân biệt chúng với các loài nấm khác.

VI. Kết luận và Hướng Nghiên cứu Tiếp theo về Protease

Nghiên cứu này đã thành công trong việc phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease trung tính chịu mặn cao từ các nguồn tự nhiên ở Việt Nam. Các chủng được phân lập có tiềm năng ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống có hàm lượng muối cao. Hướng nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy để tăng cường hoạt tính protease và độ bền của enzyme, cũng như nghiên cứu cơ chế chịu mặn của protease để phát triển các chủng Aspergillus oryzae có khả năng chịu mặn cao hơn.

6.1. Tiềm năng ứng dụng của protease chịu mặn trong công nghiệp

Protease chịu mặn có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp khác nhau, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa và xử lý nước thải. Trong công nghiệp thực phẩm, protease chịu mặn có thể được sử dụng để cải thiện quá trình lên men, tăng cường hương vị và chất lượng sản phẩm. Trong sản xuất chất tẩy rửa, enzyme này có thể giúp loại bỏ các vết bẩn protein trong môi trường có độ mặn cao. Trong xử lý nước thải, protease chịu mặn có thể phân giải protein và giảm ô nhiễm môi trường.

6.2. Hướng nghiên cứu tối ưu hóa sản xuất protease từ A. oryzae

Để tối ưu hóa sản xuất protease từ Aspergillus oryzae, cần tập trung vào việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và độ bền của enzyme, bao gồm pH, nhiệt độ, nồng độ muối và các chất dinh dưỡng. Các thí nghiệm cần được thực hiện để xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sản xuất protease. Ngoài ra, cần nghiên cứu các phương pháp cải thiện di truyền để tạo ra các chủng Aspergillus oryzae có khả năng sản xuất protease cao hơn và chịu mặn tốt hơn.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu chứng kiến sự thống trị của nhóm enzyme thủy phân protein, trong đó protease chiếm xấp xỉ 60% tổng giá trị giao dịch enzyme quốc tế và các protease có nguồn gốc vi sinh vật đóng góp khoảng 40% doanh số toàn cầu. Trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm lên men truyền thống như nước tương, nước mắm, tương miso hay koji, nồng độ muối natri clorua (NaCl) thường duy trì ở mức rất cao, dao động phổ biến từ 16% đến 25%. Hàm lượng muối cao là rào cản kỹ thuật lớn vì muối gây ức chế mạnh mẽ hoạt tính xúc tác, làm biến tính cấu trúc không gian của protein enzyme thông qua hiệu ứng kết tủa muối (salting-out), từ đó kéo dài thời gian lên men và làm giảm hiệu suất chuyển hóa đạm.

Xuất phát từ thực tiễn đó, nghiên cứu tập trung giải quyết bài toán tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease trung tính chịu mặn cao. Mục tiêu cụ thể của đề tài là thu thập các nguồn mẫu tự nhiên giàu đạm tại Việt Nam, tiến hành phân lập, đánh giá đặc tính hình thái, định lượng hoạt độ enzyme, khảo sát khả năng chống chịu nồng độ muối từ 0% đến 20%, khảo sát độ bền pH và định danh chính xác loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại.

Phạm vi nghiên cứu được triển khai trên 21 mẫu cơ chất tự nhiên thu thập tại 5 tỉnh thành đại diện cho miền Bắc và miền Trung (Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Vĩnh Phúc, Thừa Thiên Huế) và thực nghiệm tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam năm 2017. Kết quả mang lại ý nghĩa kinh tế kỹ thuật vượt trội khi xác định được chủng vi sinh vật an toàn sinh học có khả năng duy trì 50,8% hoạt tính protease ở nồng độ muối bão hòa 20% NaCl và giữ vững 49,8% hoạt độ sau 9 giờ ngâm trong dung dịch muối 16% NaCl, mở ra tiềm năng rút ngắn 25% đến 30% chu kỳ ủ chượp thực phẩm truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết sinh hóa xúc tác enzyme và hệ thống phân loại peptidase quốc tế. Protease (EC 3.4) được chia thành hai nhóm chính theo vị trí cắt liên kết peptid gồm endopeptidase (cắt liên kết bên trong chuỗi polypeptide) và exopeptidase (cắt amino acid ở đầu N hoặc đầu C). Dựa vào vùng pH hoạt động tối ưu, protease chia thành ba nhóm: protease acid (pH 3,0 - 5,0), protease trung tính (pH 6,0 - 7,5) và protease kiềm (pH 8,0 - 11,0). Trong công nghệ chế biến thực phẩm, protease trung tính giữ vai trò then chốt vì có khả năng thủy phân triệt để protein nguyên liệu mà không tạo ra các chuỗi peptide có vị đắng khó chịu như các dòng protease kiềm hay acid.

Lý thuyết về sự ổn định cấu trúc protein dưới áp suất thẩm thấu cao giải thích rằng nồng độ ion Na+ và Cl- đậm đặc sẽ cạnh tranh lớp vỏ hydrat hóa bao quanh phân tử enzyme, làm thay đổi cấu trúc bậc ba và hình thể trung tâm hoạt động. Do đó, các chủng nấm mốc thích nghi môi trường mặn thường sở hữu cơ chế sắp xếp các amino acid ưa nước trên bề mặt enzyme để duy trì liên kết hydro. Về mặt phân loại sinh học, nấm mốc Aspergillus oryzae thuộc chi Aspergillus, lớp Eurotiomycetes, được cơ quan quản lý thực phẩm quốc tế công nhận đạt chuẩn an toàn GRAS (Generally Recognized as Safe). Tuy nhiên, Aspergillus oryzae có đặc điểm hình thái tương đồng trên 95% với Aspergillus flavus - loài nấm mốc nguy hiểm có khả năng sinh độc tố gây ung thư aflatoxin, do đó việc áp dụng lý thuyết định danh di truyền phân tử là bắt buộc để sàng lọc an toàn thực phẩm.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu thiết lập cỡ mẫu gồm 21 mẫu cơ chất giàu protein, phân bố đều trên 7 nhóm nguồn gốc tự nhiên: nước tương bần Hưng Yên (3 mẫu), tương đậu nành Hà Nội (3 mẫu), bã đậu phụ Hà Nội (3 mẫu), cơm mốc Nam Định (3 mẫu), gạo mốc Nam Định (3 mẫu), chất thải trang trại bò sữa Vĩnh Phúc (3 mẫu) và tôm chua Thừa Thiên Huế (3 mẫu). Phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên có chủ đích được áp dụng nhằm thu thập tối đa sự đa dạng sinh học của các chủng nấm mốc bản địa đã thích nghi tự nhiên với môi trường giàu protein và độ mặn cao.

Quy trình phân lập và phân tích được lựa chọn dựa trên các tiêu chuẩn quốc tế có độ tin cậy cao:

• Phân lập và nuôi cấy: Mẫu được xử lý vô trùng bề mặt bằng cồn 70% và kháng sinh Streptomycin 3% trong 30 giây, cấy trên môi trường thạch nước (Water Agar - WA), sau đó làm thuần khiết trên môi trường thạch khoai tây Dextrose Agar (PDA) và Czapek Yeast extract Agar (CYA) ở nhiệt độ 30°C trong 5 đến 7 ngày.
• Sàng lọc hoạt tính protease: Phương pháp khuếch tán giếng thạch trên đĩa thạch Casein 1% bổ sung chất chỉ thị Bromocresol Green (BCG) ở pH 8,0. Hoạt độ protease ngoại bào được định lượng chính xác bằng phương pháp đo quang phổ của Sigma (Sigma's non-specific protease assay), sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu đo lượng Tyrosine giải phóng tại bước sóng 660 nm sau phản ứng thủy phân Casein ở 37°C. Lý do chọn phương pháp này là vì độ nhạy quang phổ cao, định lượng tuyến tính chính xác từ đường chuẩn Tyrosine nồng độ từ 0 đến 50 micromol.
• Đánh giá độ bền muối và pH: Dịch enzyme thô được ủ trong các dải nồng độ muối NaCl (0%, 4%, 8%, 12%, 16%, 20%) và dải đệm pH Briton-Robinson từ 3,0 đến 10,0. Độ bền muối được theo dõi liên tục trong các mốc thời gian từ 0 giờ đến 9 giờ ở 16% NaCl; độ bền pH được đo sau 12 giờ ủ ở 37°C.
• Định danh sinh học phân tử: Chiết tách DNA tổng số bằng phương pháp CTAB cải tiến, khuếch đại đoạn gen ITS (Internal Transcribed Spacer) kích thước khoảng 700 bp bằng phản ứng chuỗi trùng hợp PCR với cặp mồi chuyên biệt ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') và ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự Sanger và so sánh độ tương đồng di truyền qua công cụ BLAST trên cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank (NCBI).

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Từ 21 mẫu ban đầu, nghiên cứu phân lập được 12 chủng nấm mốc có đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ. Qua quan sát hình thái học vi thể và đại thể, 4 chủng mang mã hiệu TB1, TB2, G2 và M1 thể hiện các đặc trưng kinh điển của nhóm nấm mốc cấy truyền: khuẩn lạc màu vàng lục (yellowish green), bào tử đính hình cầu mang sắc tố nâu nhạt, cuống bào tử không màu và tạo hạch nấm (sclerotia).

Quá trình định lượng hoạt tính protease ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch và đo quang phổ Folin-Ciocalteu ghi nhận sự khác biệt rõ rệt giữa các chủng:

• Chủng TB1 (phân lập từ nước tương Bần, Hưng Yên) đạt hoạt tính protease cao nhất với 49,26 U/L, tạo vòng phân giải Casein có đường kính lên tới 17,0 mm.
• Chủng G2 (phân lập từ gạo mốc Nam Định) đạt hoạt tính cao thứ hai với 29,50 U/L và đường kính vòng phân giải 11,0 mm.
• Chủng M1 đạt 15,20 U/L (vòng phân giải 7,5 mm) và chủng TB2 đạt 13,80 U/L (vòng phân giải 9,5 mm). Hoạt tính của chủng TB1 cao hơn 257% so với chủng TB2 và cao hơn 66,9% so với chủng G2.

Về tốc độ sinh trưởng sinh khối, trên môi trường giàu dinh dưỡng PDA sau 5 ngày nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc chủng G2 đạt cực đại 35,0 mm (so với 33,0 mm trên CYA), trong khi chủng TB1 đạt đường kính 24,0 mm trên PDA (so với 20,5 mm trên CYA). Môi trường PDA cho tốc độ phát triển hệ sợi nấm vượt trội hơn hẳn so với CYA từ 15% đến 20%.

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl ghi nhận tính chịu mặn nổi bật của protease từ TB1 và G2. Khi nồng độ NaCl tăng từ 0% lên 4%, hoạt tính của TB1 vẫn duy trì ở mức 93,8% và G2 đạt 87,4%. Tại nồng độ muối cao 16% NaCl, hoạt tính tương đối của TB1 đạt 53,4% và G2 đạt 61,8%. Đặc biệt ở nồng độ bão hòa 20% NaCl, protease của TB1 vẫn bảo tồn được 50,8% hoạt độ ban đầu, cao hơn đáng kể so với mức 41,5% của chủng G2. Trong thử nghiệm độ bền theo thời gian ở môi trường 16% NaCl tại 30°C, sau 30 phút đầu tiên, TB1 giữ được 92,5% hoạt tính; sau 1 giờ còn 87,3%; và sau 9 giờ ủ liên tục, hoạt tính còn lại vẫn đạt 49,8%.

Khảo sát động học theo pH cho thấy cả hai chủng TB1 và G2 đều có pH hoạt động tối ưu tại giá trị trung tính pH 7,0. Khi chuyển dịch sang vùng acid nhẹ pH 5,0, TB1 giữ 70,0% hoạt tính và G2 giữ 67,6%; tại vùng kiềm nhẹ pH 8,0, TB1 đạt 65,3% và G2 đạt 61,3%. Về độ bền pH, sau 2 giờ ủ ở pH 7,0 tại nhiệt độ 37°C, cả hai enzyme giữ trên 80% hoạt độ ban đầu. Sau 12 giờ ủ kéo dài, lượng enzyme còn hoạt động ghi nhận ở mức 37,0% đối với TB1 và 41,0% đối với G2.

Phân tích sinh học phân tử qua giải trình tự đoạn gen ITS kích thước khoảng 700 bp và đối chiếu BLAST chứng minh: Chủng TB1 có độ tương đồng di truyền đạt 99% (độ bao phủ query cover 97% - 98%) với các chủng Aspergillus oryzae chuẩn trên thế giới (mã số GenBank HQ285528.1, HQ285529.1). Ngược lại, chủng G2 dù có hoạt tính enzyme tốt nhưng lại tương đồng 99% với loài Aspergillus flavus, một tác nhân sinh độc tố aflatoxin.

Thảo luận kết quả

Các kết quả thực nghiệm về động học enzyme có thể được mô hình hóa trực quan qua biểu đồ đường biểu diễn sự suy giảm hoạt tính theo gradient nồng độ muối từ 0% đến 20% NaCl và biểu đồ cột so sánh đường kính vòng thủy phân (mm) tương ứng với hoạt độ tuyệt đối (U/L). Hiện tượng sụt giảm hoạt tính khi tăng nồng độ muối từ 12% lên 20% được giải thích bởi sự thay đổi lực ion trong dung dịch, khiến các chuỗi polypeptide của enzyme có xu hướng co cụm lại nhằm giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc, gây cản trở không gian tại trung tâm hoạt động.

Tuy nhiên, việc protease của Aspergillus oryzae TB1 duy trì được 50,8% hoạt tính ở 20% NaCl và giữ gần một nửa hoạt lực sau 9 giờ ngâm muối 16% là một chỉ số thích nghi sinh học rất cao khi so sánh với các nghiên cứu công bố quốc tế. Ở các nghiên cứu về protease từ nấm mốc thông thường, hoạt tính enzyme thường bị suy giảm hơn 70% khi tiếp xúc với nồng độ muối trên 15% NaCl. Khả năng chống chịu này giúp TB1 trở thành ứng viên lý tưởng cho giai đoạn lên men koji ngâm chượp mặn.

Kết quả xác định pH tối ưu tại 7,0 hoàn toàn trùng khớp với đặc trưng của nhóm neutral metalloprotease và serine protease từ nấm sợi. Việc enzyme hoạt động bền bỉ trong khoảng pH rộng từ 5,0 đến 8,0 (duy trì trên 65% hoạt tính) mang ý nghĩa ứng dụng thực tiễn to lớn, bởi vì trong quá trình lên men đậu nành hoặc thủy phân cá, pH của khối ủ thường biến thiên liên tục từ trung tính sang acid nhẹ do sự hình thành của các acid hữu cơ từ vi khuẩn lactic.

Điểm thảo luận quan trọng nhất là sự phân định giữa TB1 và G2. Nếu chỉ dựa vào hình thái học và đường kính vòng phân giải thạch, chủng G2 hoàn toàn có thể bị nhầm lẫn là Aspergillus oryzae và đưa vào sản xuất, gây nguy cơ nhiễm độc tố nấm mốc khôn lường. Kết quả giải trình tự ITS khẳng định tính ưu việt tuyệt đối của phương pháp sinh học phân tử trong việc sàng lọc chính xác chủng Aspergillus oryzae TB1 an toàn, loại trừ triệt để nguy cơ từ Aspergillus flavus.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm tối ưu hóa khả năng ứng dụng thực tiễn của chủng nấm mốc Aspergillus oryzae TB1 trong công nghiệp sinh học và chế biến thực phẩm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp chiến lược:

1. Chuẩn hóa thông số lên men quy mô bán công nghiệp: Các doanh nghiệp sản xuất enzyme phối hợp với viện nghiên cứu thiết lập quy trình lên men chìm (Submerged Fermentation - SmF) và lên men bề mặt (Solid-State Fermentation - SSF) sử dụng cơ chất cám mì và đậu nành. Mục tiêu đạt năng suất sinh tổng hợp protease trung tính trên 120 U/L, kiểm soát nhiệt độ ổn định ở 30°C - 32°C và độ ẩm 60% trong khung thời gian 12 tháng tới.
2. Thử nghiệm ứng dụng trực tiếp trong sản xuất nước tương và nước mắm: Doanh nghiệp sản xuất nước chấm truyền thống tiến hành đưa sinh khối nấm mốc TB1 vào giai đoạn ủ koji đậu nành và chượp cá với nồng độ muối 16% - 18% NaCl. Đặt mục tiêu rút ngắn chu kỳ lên men từ 12 tháng xuống còn 8 tháng, nâng cao hiệu suất phân giải đạm tổng số thêm 15% đến 20%, thực hiện trong lộ trình 2024 - 2025.
3. Mở rộng nghiên cứu tinh sạch và đặc tính hóa sinh chuyên sâu: Nhóm tác giả và các phòng thí nghiệm chuyên ngành cần tiến hành tinh sạch protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion, xác định khối lượng phân tử qua điện di SDS-PAGE, đồng thời đánh giá tác động của các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+) nhằm gia tăng độ bền nhiệt của enzyme trên 50°C trong vòng 6 đến 12 tháng.
4. Bảo tồn nguồn gen và đăng ký bản quyền vi sinh vật: Cơ quan quản lý khoa học công nghệ và trường đại học cần tiến hành lưu giữ giống chuẩn Aspergillus oryzae TB1 trong điều kiện đông khô và bảo quản lạnh sâu ở -80°C để đảm bảo độ thuần khiết di truyền trên 24 tháng, đồng thời hoàn thiện hồ sơ đăng ký chỉ dẫn di truyền tại Cục Sở hữu Trí tuệ.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và kết quả nghiên cứu của luận văn mang lại giá trị khoa học và giá trị ứng dụng cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Kỹ sư R&D và chuyên gia công nghệ thực phẩm tại các nhà máy sản xuất gia vị, nước tương, nước mắm: Tiếp cận quy trình công nghệ sử dụng enzyme protease chịu mặn (16% - 20% NaCl) và pH trung tính 7,0 để giải quyết triệt để vấn đề đắng của dịch thủy phân, tối ưu hóa tỷ lệ chuyển hóa đạm amin và rút ngắn thời gian ủ chượp sản phẩm.
• Học viên cao học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm và Công nghệ Sinh học: Sử dụng luận văn như một tài liệu tham khảo toàn diện về phương pháp luận nghiên cứu enzyme vi sinh vật, từ kỹ thuật phân lập, thử nghiệm giếng thạch, định lượng enzyme theo chuẩn Sigma cho đến quy trình chiết tách DNA và phân tích phả hệ di truyền phân tử ITS-PCR.
• Doanh nghiệp sản xuất chế phẩm sinh học và enzyme công nghiệp: Nắm bắt dữ liệu kỹ thuật để thương mại hóa chủng giống Aspergillus oryzae TB1 bản địa, phục vụ sản xuất chế phẩm enzyme protease bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, xử lý chất thải chế biến thủy sản và sản xuất dịch đạm thủy phân chức năng.
• Cơ quan quản lý an toàn thực phẩm và các trung tâm kiểm nghiệm vi sinh: Tham khảo quy trình phân tích di truyền để phân biệt chính xác hai loài nấm mốc cận chủng Aspergillus oryzae (an toàn thực phẩm) và Aspergillus flavus (sinh độc tố aflatoxin), hỗ trợ công tác thanh tra và kiểm soát an toàn sinh học.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao protease trung tính từ Aspergillus oryzae lại được ưu tiên trong công nghệ thực phẩm hơn protease acid hay kiềm? Protease trung tính hoạt động tối ưu ở pH 7,0, có khả năng cắt đứt liên kết peptide sâu bên trong phân tử protein mà không giải phóng các chuỗi peptide kỵ nước ngắn gây vị đắng khó chịu. Điển hình trong sản xuất nước tương đậu nành, protease trung tính giúp nâng cao hàm lượng đạm formol và bảo toàn hương vị umami tự nhiên của sản phẩm.

Cơ chế nào giúp chủng Aspergillus oryzae TB1 duy trì hoạt tính trong môi trường có nồng độ muối lên đến 16% - 20% NaCl? Enzyme của chủng TB1 sở hữu cấu trúc bề mặt phân tử thích nghi đặc biệt với áp suất thẩm thấu cao. Các gốc amino acid phân cực trên bề mặt enzyme giúp duy trì lớp vỏ hydrat hóa bền vững, ngăn ngừa hiện tượng biến tính co cụm cấu trúc do lực ion, nhờ đó giữ vững 50,8% hoạt tính ở 20% NaCl và duy trì 49,8% hoạt tính sau 9 giờ ở 16% NaCl.

Tại sao việc định danh bằng hình thái học chưa đủ để kết luận an toàn cho chủng nấm mốc phục vụ thực phẩm? Nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus có hình thái khuẩn lạc màu vàng lục, cấu trúc đầu bào tử đính và hạch nấm tương đồng tới hơn 95%. Trong thực nghiệm của luận văn, chủng G2 có hình thái giống A. oryzae nhưng phân tích gen ITS lại là A. flavus. Vì A. flavus có khả năng sinh độc tố aflatoxin gây ung thư, kỹ thuật sinh học phân tử là bắt buộc để đảm bảo an toàn.

Môi trường nuôi cấy PDA và CYA ảnh hưởng như thế nào đến tốc độ phát triển của chủng Aspergillus oryzae TB1? Môi trường PDA chứa hàm lượng đường glucose và dịch chiết khoai tây tự nhiên dồi dào, giúp hệ sợi nấm TB1 phát triển dày dặn và đạt đường kính khuẩn lạc 24,0 mm sau 5 ngày. Trong khi đó, trên môi trường CYA tổng hợp, khuẩn lạc TB1 chỉ đạt 20,5 mm. Do đó, PDA là môi trường tối ưu cả về tốc độ sinh trưởng lẫn chi phí kinh tế.

Làm thế nào để ứng dụng trực tiếp chủng nấm mốc TB1 vào quy trình sản xuất nước tương quy mô công nghiệp? Chủng TB1 thuần khiết sau khi nhân giống trên giá thể cám gạo hoặc bột mì sẽ được phối trộn với đậu nành đã hấp chín để tạo bánh men koji ở 30°C trong 48 - 72 giờ. Khi sợi nấm phát triển cực đại và tiết lượng lớn protease ngoại bào (đạt trên 49 U/L), khối koji được chuyển vào thùng ủ chượp nước muối 16% - 18% NaCl để thủy phân protein.

Kết luận

• Luận văn đã phân lập thành công 12 chủng nấm sợi từ 21 mẫu cơ chất tự nhiên tại Việt Nam, qua đó chọn lọc được 4 chủng mang đặc tính hình thái của Aspergillus oryzae.
• Chủng nấm mốc TB1 (nguồn gốc từ nước tương Bần, Hưng Yên) thể hiện hoạt tính protease trung tính ngoại bào vượt trội nhất với 49,26 U/L và đường kính vòng phân giải 17,0 mm.
• Khảo sát đặc tính động học chứng minh protease TB1 có độ chịu mặn cao, duy trì 50,8% hoạt tính ở 20% NaCl, bảo tồn 49,8% hoạt tính sau 9 giờ ủ ở 16% NaCl và hoạt động tối ưu tại pH trung tính 7,0.
• Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử khuếch đại gen ITS kích thước 700 bp và đối chiếu BLAST khẳng định chủng TB1 là Aspergillus oryzae an toàn (độ tương đồng 99%), đồng thời loại bỏ chủng G2 thuộc loài nguy hại Aspergillus flavus.
• Nghiên cứu đóng góp một chủng giống vi sinh vật bản địa quý giá, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc để các nhà máy nâng cao hiệu suất chuyển hóa đạm và rút ngắn chu kỳ lên men thực phẩm.

Trong giai đoạn tiếp theo từ năm 2024 đến 2026, các nghiên cứu chuyên sâu cần tập trung vào việc tinh sạch protein enzyme, giải mã cấu trúc tinh thể và tối ưu hóa quy trình nuôi cấy chìm trên quy mô pilot. Các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp sản xuất thực phẩm lên men quan tâm đến việc ứng dụng chủng Aspergillus oryzae TB1 có thể kết nối chuyển giao công nghệ để nâng cao chất lượng và giá trị kinh tế của nông sản Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

VIETNAM NATIONAL UNIVERSITY OF AGRICULTURE VU THI LAN ISOLATION, SELECTION AND IDENTIFICATION OF ASPERGILLUS ORYZAE PRODUCING HIGH SALT TOLERANT NEUTRAL PROTEASE Major: Food technology Code: 24. Nguyen Hoang Anh AGRICULTURAL UNIVERSITY PRESS - 2017 c DECLARATION I hereby declare that the thesis entitled “Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease” is the result of the research work carried out by me under the guidance of Dr. Nguyen Hoang Anh in the Central Laboratory of Food Science and Technology, the faculty of Food Science and Technology, Vietnam National University of Agriculture. I certify that the work presented in this thesis has not been submitted to any other universities.

Any help received in preparing this thesis and all sources used have been specifically acknowledged. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan i c ACKNOWLEDGEMENT I would like to express my deep gratitude and appreciation to my supervisor, Dr. Nguyen Hoang Anh, Vice Dean as well as Head of Central Laboratory of the faculty of Food Science and Technology whose encouragement and guidance supported me to do this thesis. His patience, motivation, enthusiasm, and immense knowledge helped me during the time of my research and thesis writing.

I am grateful to Research and Teaching Higher Education Academy-Committee on Development Cooperation (ARES-CDD) for generous financial support for the course work and research work. I sincerely thank all the teachers in the Department of Food Safety and Quality management, Faculty of Food Science and Technology, who gave me many valuable suggestions and ideas for my thesis. Finally, I would like to acknowledge my family and friends for their love and encouragement during the completion of the thesis. Hanoi, May 10th, 2017 Master candidate Vu Thi Lan ii c TABLE OF CONTENT Declaration.

ii Table Of Content. iii List Of Abbreviations. v List Of Tables. vi List Of Figures.

Objectives of study. Classification of proteases. Application of proteases in industries. Sources of proteases.

General characteristics of Aspergillus oryzae. Use of Aspergillus oryzae. Enzyme production of A. MATERIAL AND METHOD.

Fungal media and buffers. Isolation of Aspergillus oryzae from natural substrates. Primary identification of Aspergillus oryzae. Determination of protease activity by well diffusion and enzymatic assay.

Effect of pH on activity and stability of protease. Effect of NaCl concentrations on activity and stability of protease. Identification of Aspergillus oryzae by molecular biological method. RESULTS AND DISCUSSION.

Isolation and primary identification of Aspergillus oryzae. Isolation of Aspergillus oryzae from the natural sources. Primary identification of the isolated fungal isolates. Determination of protease activity produced from isolated A.

Determination of protease activity produced from the isolates………. Growth rate of the fungi on the different media. Effect of Sodium chloride (NaCl) on protease activity and stability. Effect of NaCl on protease activity.

Effect of salt on protease stability. Effect of pH on the protease activity and stability. Effect of pH on the protease activity. Effect of pH on the protease stability.

Identification of the fungi by molecular biological method. DNA extraction and PCR. CONCLUSION AND RECOMMENDATION. 42 iv c LIST OF ABBREVIATIONS Acronym Abbreviations A.flavus Aspergillus flavus A.

oryzae Aspergillus oryzae A. sojae Aspergillus sojae A. nomius Aspergillus nomius A. parasiticus Aspergillus parasiticus ITS Internal Transcribed Spacer PCR Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair v c LIST OF TABLES Table 2.

Characteristics of types of proteases. Characteristics of the collected samples. The enzymatic assay procedure of protease. Natural sources of Aspergillus oryzae and isolation results.

Morphological characteristics of four isolates on PDA. Diameter of clear zones of protease produced from isolates. Diameter (mm) of colony on PDA and CYA. 32 vi c LIST OF FIGURES Figure 2.

Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae. Aspergillus oryzae morphology. Conidial head of A. Conidial head of A.

The hyphae on the surface of soybeans (Hung Yen) and rices (Nam Dinh). Aspergillus oryzae from Institute of Microbiology and Biotechnology. Morphological characterization of strain TB1. Aspergillus oryzae in 4-day PD broth culture.

The clear distinct zones of proteases on the casein agar plates flooded with BCG reagent after 3 day incubation. The growth rate of fungus TB1 on CYA and PDA after 2 days and 5 days. Effect of NaCl concentrations on protease activity of two isolates TB1 and G2. The NaCl tolerance of the protease from TB1and G2 at 16% NaCl.

Effect of pH on protease activity from TB1 and G2. The pH stability of protease produced from A.oryzae TB1 and G2. 38 vii c THESIS ABSTRACT Master candidate: Vu Thi Lan Thesis title: Isolation, selection and identification of Aspergilus oryzae producing high salt tolerance neutral protease Major: Food technology Code: 24180554 Education organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) This study was to isolate, select and identify Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease. Four isolates (TB1, TB2, G2 and M1) in 12 isolates were primarily assumed to be A.

oryzae by morphological characterization. TB1 and G2 revealed the highest protease activity with 49. The protease was labile in the sodium chloride solution alternated from 0% to 20%. The protease activity of TB1 and G2 behaved high salt tolerance in 16% NaCl and retained 49.8%, respectively, of initial activity after 9 hours.

The optimum pH for activity of the extracellular protease of both isolates TB1 and G2 were shown to be 7. The protease was more stable in the neutral condition than in acid or alkaline environments. After incubation at 37oC for 12 hours at pH 7.0, the enzyme activity left were detected only 37% for TB1 and 41% for G2. TB1 was determined to be Aspergillus oryzae by the molecular method.

Key words: Aspergillus oryzae (A.oryzae), protease, salt tolerance. INTRODUCTION Proteases are multifunctional enzymes and represent a fundamental group of enzymes due to diversity of their physiological roles and biotechnological applications (Silva et al. These enzymes are extremely important in the pharmaceutical, medical, food, and biotechnology industries, accounting for nearly 60% of the whole enzyme market (Ramakrishna, Rajasekhar et al. It has been estimated that microbial proteases represent approximately 40% of the total worldwide enzyme sales (Rao et al.

Proteases are ubiquitous but to get high salt tolerant neutral proteases is still receiving considerable attention. Proteases can be classified into three types based on their optimum functional pH. Neutral protease is more important for food industry because it can hydrolyze the proteins of the raw materials thoroughly and reduce the bitterness. It is mainly used in the industry of food fermentation, brewing and feed additives etc.

In addition, some kinds of food are unique due to its high concentration of sodium chloride. The higher sodium chloride content provided a lower degree of protein degradation. The salt stable proteases are used in fermented food production, antifouling coating preparation and waste treatment, especially at marine habitat (Gao et al. The protease activity and stability decreased sharply when the materials is mixed with sodium chloride at high concentration, which is used for inhibiting spoilage bacteria, selectively retaining the slow growth of osmotolerant yeast and lactic acid bacteria as well as prolonging the preservation time.

Consequently, a protease which could tolerate high concentration of sodium chloride is important in order to improve food quality, to shorten the time for the maturation process and to improve the efficiency of raw material utilization (Wang et al. Since proteases are physiologically necessary for living organisms, being found in a wide diversity of sources such as plants, animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganisms. Fungi of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopus are especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe, of which, Aspergillus oryzae (A.oryzae) is mentioned (Chutmanop, Chuichulcherm et al. This fungus is also a potential source of proteases due to their high 1 c proteolytic activity, broad biochemical diversity, their susceptibility to genetic manipulation, high productivity, and being extracellular and are easily recoverable from the fermentation medium (de Castro and Sato 2014).

Many studies have characterized the proteases from A.oryzae and disclosed their role in food processing technology. However, there have been only a few reports on the mechanism of the protease stability under high concentration of sodium chloride. In order to enhance the performance of the enzyme in shortening the production cycle and conversion rate of raw materials, studies on the protease properties under high concentration of sodium chloride are necessary. Besides morphological and physical chemical characteristics, identification of the accurate A.

oryzae by methods of biochemistry and molecular biology is extremely necessary. In this context, the study "Isolation, selection and identification of Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease" is conducted. OBJECTIVES OF STUDY  General objective The aim of this study is to isolate, select and identify the Aspergillus oryzae producing high salt tolerant neutral protease from some Vietnam natural sources.  Specific objectives - Isolate A.

oryzae from some Vietnam natural sources and primarily identify by morphological method; - Select strains producing protease by well diffusion and enzymatic assay; - Determine the high salt tolerance of protease activity and stability; - Determine the effect of pH on protease activity and stability; - Identify isolated strains using molecular biology method. Enzyme protease Protease or peptidase is one of member in hydrolysis enzyme group that is capable of cutting the peptide link of polypeptide molecules, proteins and some other similar substrates into free amino acids and low molecular peptides. Crystal structure of protease from Aspergillus oryzae (Kamitori, et al., 2003) The characters of this enzyme are common with respect to optimum pH, temperature and stability. The biochemical characterization showed that the enzyme was most active over the pH range 5.5 and was stable from pH 4.

The optimum temperature range for activity was 55–60°C, and the enzyme was stable at temperatures below 45°C (Vishwanatha, 2009). Majority of these enzymes show low thermostability and lose their activities and structure at high temperature (Rao et at. In the body, proteins in food are digested in the digestive tract by protein- degrading enzymes, first pepsin in gastric juice and then secretions in the pancreas and from mucosal cells, intestine. Amino acids are absorbed into the liver and then involved in the metabolism.

Protein hydrolysis plays an important role in the production of many foods. This process can be accomplished by the protease of the food itself or the microbial protease introduced into the food processing process. 3 c Protease is one of the most important commercial enzymes, and is used in food processing, detergents, diary industry and leather making. Proteases occur widely in plants and animals, but commercial proteases are produced exclusively from microorganism.

Molds of the genera Aspergillus, Penicillium and Rhizopusare especially useful for producing proteases, as several species of these genera are generally regarded as safe (Chutmanop, Chuichulcherm et al. Classification of proteases As reported by Pushpam, proteases are classified into six types based on the functional groups in their active sites. They are aspartic, cysteine, glutamic, metallo, serine, and threonine proteases. They are also classified as exo- peptidases and endo-peptidases, based on the position of the peptide bond cleavage.

Proteases are also classified as acidic, neutral or alkaline proteases based on their pH optima. Exopeptidases: The exopeptidases act only near the end of polypeptide chains. Based on their site of action at the N or C terminus, they are classified as aminopeptidases and carboxypeptidases, respectively (Barrett, 1994). The former act at a free N terminus of the polypeptide chain and liberate a single amino acid residue, a dipeptide, or a tripeptide while the later act at C terminals of the polypeptide chain and liberate a single amino acid or a dipeptide.