Đặt vấn đề Escheriachia coli (E. coli) là một trong những tác nhân phổ biến gây ô nhiễm trong nguồn nước và thực phẩm. coli đặc biệt gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm về đường ruột bao gồm tiêu chảy, kiết lị và các bệnh nhiễm trùng ngoài đường ruột khác như viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm phúc mạc tiên phát [1]. Trong đó theo WHO, bệnh tiêu chảy là một trong ba nguyên nhân hàng đầu gây tử vong ở trẻ em từ 1-59 tháng tuổi.
Mỗi năm có khoảng 443 832 trẻ em dưới năm tuổi và 50 851 trẻ em từ 5 đến 9 tuổi tử vong do bệnh tiêu chảy, đồng thời số ca nhiễm bệnh tiêu chảy trên toàn cầu lên đến 1,7 tỉ [2]. Chỉ riêng tiêu chảy và bệnh viêm phổi chiếm 29% tổng số ca tử vong ở trẻ em trên toàn thế giới, ước tính lên đến hơn 2 triệu trẻ em tử vong mỗi năm [3]. Tại Việt Nam có khoảng 500 000 đến 700 000 trường hợp tiêu chảy cấp mỗi năm được báo cáo. Đợt dịch gần đây nhất xảy ra vào cuối năm 2007-2008 với hàng ngàn trường hợp bệnh được báo cáo từ 19 tỉnh thành phía Bắc [4].
Trước đây, E. coli thường được phát hiện và đánh giá thông qua thông qua một hoặc nhiều phương pháp truyền thống kết hợp với nhau như nuôi cấy, đếm đĩa, lên men nhiều ống, màng lọc, nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi. Theo Quy Chuẩn Việt Nam (QCVN) về quy định nước uống, yêu cầu chỉ tiêu của E. coli là bằng không.
Chỉ tiêu đánh giá E. coli được thực hiện thông qua phương pháp lọc màng và phương pháp nhiều ống theo Tiêu Chuẩn Quốc Gia - TCVN 6187 (ISO 9308) [6]. Các phương pháp này khá đơn giản, chi phí thực hiện thấp. Tuy nhiên, các phương pháp này mất nhiều thời gian, và không thể đáp ứng được nhu cầu liên tục của các quá trình công nghiệp.
Từ đó, thế hệ tiếp theo của phương pháp phát hiện E. coli - các phương pháp sinh học phân tử như ELISA, FISH và PCR - ra đời nhằm rút ngắn thời gian, giảm thời gian chờ từ vài ngày xuống còn vài giờ. Dù vậy, các phương pháp này đòi hỏi các thiết 1 bị đắt tiền, người thực hiện có kỹ thuật và trình độ cao, đồng thời nắm vững các thao tác tiến hành phân tích. Bước nhảy vọt trong phát hiện E.
coli diễn ra khi công nghệ cảm biến ra đời, công nghệ này giúp thu ngắn thời gian, giảm chi phí và quá trình thực hiện đơn giản. Trong những năm gần đây, đã có hàng loạt cảm biến với đa dạng đầu dò ra đời nhằm phục vụ cho nhu cầu phát triển của thế giới. Phần lớn các công trình này vẫn đang dừng lại ở mức nghiên cứu và chỉ một số lượng rất ít được đưa ra thương mại. Dù vậy không thể phủ nhận tiềm năng to lớn của các cảm biến sinh học mở ra trong tương lai, khi những viễn cảnh robot cảm biến có thể thay thế con người giám sát ở các vị trí hiểm trở khác nhau.
Từ số liệu tử vong, cũng như số ca nhiễm bệnh đường ruột do E. coli gây ra chứng tỏ tính cần thiết và quan trọng của việc phát hiện E. coli trong các mẫu thực phẩm, nước uống và môi trường. Hiện nay, các phương pháp phát hiện và đánh giá vẫn dừng lại ở các kỹ thuật tiêu chuẩn, tiêu tốn nhiều thời gian.
Các cảm bến sinh học mang nhiều ưu điểm, dù vậy, chỉ dừng lại ờ bước nghiên cứu và chưa được thương mại hóa rộng rãi. Riêng tại Việt Nam cảm biến sinh học phát hiện vi khuẩn vẫn còn là lĩnh vực mới và hầu như có rất ít tài liệu về lĩnh vực này. Đây cũng chính là những lý do đề tài được lựa chọn: “Nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện Escherichia coli ứng dụng trong giám sát môi trường” 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế, chế tạo cảm biến để phát hiện Escherichia coli từ DNA tổng số bằng phương pháp tia Raman nhằm ứng dụng trong quan trắc môi trường.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chính của luận văn này là vi khuẩn E. coli và cảm biến sinh học phát hiện ra E. 2 Phạm vi nghiên cứu Chủng vi khuẩn tiến hành thử nghiệm trong luận văn này là chủng Escherichia coli (VTCC12272) trong môi trường nước, chủng giống gốc được cung cấp bởi Trung Tâm Nguồn Gen Vi Sinh Vật Quốc Gia. Các giá thể lựa chọn để xây dựng đế cảm biến bao gồm thủy tinh, giấy cellulose acetate và giấy cellulose nitrate.
Hai loại hạt nano được tiến hành nghiên cứu phủ lên đế cảm biến gồm có nano bạc (AgNPs) và nano bạc trên khung ZIF-8 (AgNPs/ZIF-8) Xác nhận tín hiệu bằng các kỹ thuật quang học UV-vis, SEM, EDS và Raman. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Tổng hợp các hạt nano AgNPs và AgNPs/ZIF8. - Nội dung 2: Xác định giá thể phù hợp cho cảm biến sinh học. - Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả phủ các hạt nano lên giá thể đã chọn.
- Nội dung 4: Gắn đầu dò DNA lên đế cảm biến. - Nội dung 5: Phát hiện DNA của E.coli bằng cảm biến đã chế tạo. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Đặc điểm sinh học Vi khuẩn Escherichia coli thường sống trong ruột của người và động vật máu nóng. Hầu hết vi khuẩn E.
coli là vô hại và là một phần thực sự quan trọng trong đường ruột của con người. Tuy nhiên, một số vi khuẩn E. coli có khả năng gây bệnh và được biết đến nhiều nhất cũng như phổ biến nhất là bệnh tiêu chảy. coli gây bệnh có thể lây truyền thông qua nước uống hoặc thức ăn, hoặc thông qua quá trình tiếp xúc giữa người với động vật hoặc giữa người và người.
Vào năm 1885, Theodor Escherich lần đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn E. coli từ mẫu phân của trẻ sơ sinh. Một thời gian sau đó được thay tên là Escherichia coli và trong rất nhiều năm, vi khuẩn này chỉ đơn giản được coi là vi khuẩn sống trong ruột già. Mãi đến năm 1935, một chủng của E.
coli mới được chứng minh là nguyên nhân gây ra đợt bùng phát bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh [7]. Đặc điểm hình thái và cấu tạo Về đặc điểm sinh lý, E. coli rất linh hoạt, thích nghi tốt với môi trường sống và có thể phát triển trong môi trường chỉ có glucose là thành phần hữu cơ duy nhất. Về hình thái, E.
coli là trực khuẩn gram âm, sinh trưởng hiếu khí và kị khí. Chúng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở 37oC. Chủng vi khuẩn này không tạo bào tử, do đó có thể dễ dàng bị loại bỏ thông qua quá trình đun sôi hoặc khử trùng cơ bản [8]. Tương tự các tế bào prokaryote khác, tế bào của vi khuẩn E.
coli có màng nguyên sinh chất (màng tế bào) bao bọc, nhân không có màng hay còn được biết đến là vùng nhân, nguyên sinh chất (tế bào chất), ribosome, ngoài ra còn có vách tế bào, lông và roi (Hình 1. Kích thước tế bào của E. coli rơi vào khoảng 0.1 Cấu tạo cơ bản của E.2 Đặc điểm bệnh học Phần lớn các chủng E. coli không gây bệnh và thậm chí còn là một phần quan trọng trong đường ruột của động vật máu nóng.
Tuy nhiên, một vài chủng E. coli gây ra các căn bệnh nghiêm trọng liên quan đến đường ruột như tả hoặc tiêu chảy, hoặc các bệnh ngoài đường ruột như viêm phổi, nhiễm trùng máu, viêm phúc mạc tiên phát [1] [9]. coli gây tiêu chảy chính bao gồm E. coli gây bệnh đường ruột (enteropathogenic E.
coli gây độc đường ruột (enterotoxigenic E. coli xâm lấn đường ruột (enteroinvasive E. coli gây xuất huyết đường ruột (enterohemorrhagic E. coli - EHEC) và E.
coli gây ngưng tập kết đường ruột (enteroaggregative E. Các nghiên cứu ở Brazil, Mexico, Nam Phi và Bangladesh đã chỉ ra rằng 30–40% trường hợp tiêu chảy ở 5 trẻ sơ sinh là do nhiễm EPEC và ước tính gây ra cái chết cho hàng ngàn trẻ em mỗi năm [10]. Đường ruột khi bị nhiễm EPEC sẽ bị các vi khuẩn nhóm này sẽ bám chặt vào thành ruột thông qua bó lông và chất kết dính, thay đổi cấu trúc khung các tế bào thành ruột và làm cho các nhung mao của tế bào bị bong tróc [12]. Dù dịch tiêu chảy hầu như đã dừng bùng phát các nước phát triển, nhưng nhóm EPEC đến hiện tại vẫn là nguyên nhân chính gây ra tử vong ở trẻ sơ sinh và trẻ em dưới 2 tuổi [11].
Một số chủng đặc trưng của nhóm EPEC gồm E. coli (ETEC) Vào năm 1960, tại Ấn Độ, Enterotoxigenic E. coli (ETEC) được phát hiện lần đầu tiên. Nhóm ETEC gây bệnh thông qua việc tiết ra các độc tố làm cho niêm mạc ruột mất cân bằng ion gây ra tiêu chảy [14].
ETEC là nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy cho người du lịch và là nguyên nhân chính gây ra dịch tiêu chảy ở các nước kém phát triển, đặc biệt là ở trẻ em. ETEC lây truyền qua thực phẩm hoặc nước bị nhiễm phân động vật máu nóng [9]. Đặc điểm chính của nhóm ETEC là sinh ra hai loại độc tính bền nhiệt và không bền nhiệt, đặc tính này hoàn toàn không xuất hiện ở các chủng E. coli gây bệnh khác [10].
Khi ETEC tiếp xúc và bám vào thụ thể của tế bào ruột, hai loại độc tố bền nhiệt và không bền nhiệt phosphoryl hóa kênh CTFR thông qua các con đường chuyển hóa, tạo nên sự bài tiết các chất điện giải, gây mất nước và dẫn đến tiêu chảy [14]. coli – EIEC lần đầu tiên được phát hiện vào khoảng 1950, là nhóm vi khuẩn gây bệnh có các đặc tính sinh hóa, di truyền và đặc tính bệnh học tương tự như Shigella, EIEC gây ra tiêu chảy hoặc bệnh kiết lỵ đặc trưng bởi các cơn co thắt bụng, phân lỏng, nôn mửa, sốt và ớn lạnh [13]. Độc tính của nhóm EIEC không chỉ gây ra bởi bộ gen mà còn được gây ra bởi một plasmid độc tố đặc trưng là pINV. Plasmid pINV khi tiếp xúc với tế bào chủ sinh ra VirF bám lên promoter và cho phép tổng hợp ra protein icsA và VirB.
Sau khi xâm nhập qua thành tế bào, EIEC nhân lên bằng cách sử 6 dụng tế bào chủ và nhờ vào VirB kích thích phiên mã toàn bộ gen và cả các gen cần thiết khác trên plasmid. Thành tế bào tiếp đến bị ly giải và EIEC lan ra các tế bào lân cận [14]. EIEC thường không khảo sát nhiều trong dịch tễ học do các biểu hiện lâm sàng ít nghiêm trọng hơn các chủng khác. Ngoài ra, các chủng EIEC có sự tương đồng về sinh hóa, di truyền và gây bệnh rất giống Shigella dẫn đến có thể bị phân loại sai.