I. HILIC Tổng quan phương pháp phân tích acid amin hiệu quả
Sắc ký lỏng tương tác thân nước, hay phương pháp HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), là một kỹ thuật phân tích hiện đại, được định nghĩa lần đầu bởi Alpert [14]. Kỹ thuật này sử dụng một pha tĩnh phân cực kết hợp với một pha động cũng có bản chất phân cực, tạo ra khả năng lưu giữ vượt trội cho các hợp chất có độ phân cực cao, điển hình là acid amin. Đây là một giải pháp khắc phục những nhược điểm cố hữu của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo cơ chế pha đảo. Luận án tiến sĩ "Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước" của tác giả Vũ Ngân Bình đã đi sâu nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật này, mở ra hướng đi mới cho ngành kiểm nghiệm tại Việt Nam. Acid amin là đơn vị cấu tạo cơ bản của protein, đóng vai trò sống còn trong việc hình thành, duy trì cấu trúc và chức năng của cơ thể [88]. Do đó, việc định lượng acid amin một cách chính xác trong các chế phẩm dược, mẫu thực phẩm chức năng và dịch sinh học có ý nghĩa cực kỳ quan trọng. Việc này không chỉ giúp đảm bảo chất lượng sản phẩm mà còn hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý liên quan đến rối loạn chuyển hóa. Phương pháp HILIC thể hiện ưu thế khi pha động chứa tỷ lệ dung môi hữu cơ cao, giúp tăng độ nhạy khi kết nối với đầu dò khối phổ (MS detector). Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng phương pháp phân tích toàn diện, từ các chế phẩm đa thành phần cho đến phân tích trong nền mẫu phức tạp như mẫu huyết tương, nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của y học và dược học hiện đại.
1.1. Giới thiệu kỹ thuật sắc ký lỏng tương tác thân nước HILIC
HILIC là một biến thể của sắc ký lỏng pha thuận, sử dụng pha động gồm dung môi hữu cơ có thể trộn lẫn với nước (như acetonitril) và một lượng nhỏ nước hoặc dung dịch đệm. Cơ chế tách chính trong HILIC là sự phân bố của chất phân tích vào lớp nước giàu được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh phân cực [14]. Cơ chế này đặc biệt hiệu quả cho các phân tử phân cực, giúp tăng cường khả năng lưu giữ mà sắc ký pha đảo (Reversed-Phase LC) thường không làm được. Các pha tĩnh sử dụng rất đa dạng, bao gồm silica trần, pha liên kết diol, amid, amino và đặc biệt là pha tĩnh zwitterionic, mang lại độ chọn lọc khác nhau cho từng ứng dụng cụ thể.
1.2. Tầm quan trọng của việc định lượng acid amin chính xác
Acid amin không chỉ là thành phần cấu tạo protein mà còn là tiền chất của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng. Sự mất cân bằng nồng độ acid amin trong cơ thể có thể là dấu hiệu của các bệnh lý nghiêm trọng, đặc biệt là các rối loạn chuyển hóa bẩm sinh [98]. Việc phát hiện sớm và theo dõi chính xác nồng độ các acid amin như Phenylalanin, Tyrosin trong mẫu huyết tương là yếu tố quyết định để cải thiện tiên lượng cho bệnh nhân. Trong ngành dược, việc định lượng chính xác các acid amin trong chế phẩm tiêm truyền hoặc thực phẩm bổ sung đảm bảo hiệu quả điều trị và an toàn cho người sử dụng, đòi hỏi một quy trình phân tích chuẩn xác và đáng tin cậy.
II. Thách thức trong phân tích acid amin bằng sắc ký pha đảo
Việc phân tích acid amin luôn là một bài toán khó trong ngành hóa phân tích. Các phương pháp truyền thống như sắc ký pha đảo (Reversed-Phase LC) gặp phải nhiều thách thức đáng kể. Trở ngại lớn nhất là do đặc tính phân cực cao của acid amin, khiến chúng có ái lực yếu với các pha tĩnh kỵ nước (như C18, C8), dẫn đến thời gian lưu giữ rất ngắn và khả năng tách kém. Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học thường phải sử dụng đến kỹ thuật dẫn xuất hóa acid amin. Quá trình này biến đổi các acid amin thành các dẫn xuất kém phân cực hơn, đồng thời gắn thêm các nhóm chức có khả năng hấp thụ tia UV hoặc phát huỳnh quang mạnh, giúp tăng khả năng lưu giữ và cải thiện độ nhạy phát hiện. Tuy nhiên, quy trình dẫn xuất hóa thường phức tạp, tốn thời gian, yêu cầu thuốc thử đắt tiền và có thể phát sinh các sản phẩm phụ không mong muốn, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Một thách thức khác là việc phân tích trong nền mẫu phức tạp như huyết tương, nước tiểu. Các mẫu sinh học chứa vô số thành phần khác nhau (protein, muối, lipid...) có thể gây nhiễu, ảnh hưởng đến hiệu quả tách và làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký. Việc xử lý mẫu, đặc biệt là chiết tách mẫu, đòi hỏi quy trình nhiều bước để loại bỏ các yếu tố gây cản trở trước khi đưa vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), làm tăng nguy cơ sai số và mất mát mẫu.
2.1. Hạn chế của phương pháp sắc ký pha đảo Reversed Phase LC
Trong RPLC, pha tĩnh có tính kỵ nước trong khi pha động lại phân cực. Các acid amin, với bản chất là các hợp chất phân cực mạnh, tan tốt trong pha động và tương tác rất yếu với pha tĩnh. Kết quả là chúng bị rửa giải ra khỏi cột gần như ngay lập tức, thường xuất hiện cùng với pic dung môi ở thời gian chết (dead time). Điều này khiến việc tách các acid amin ra khỏi nhau và ra khỏi các tạp chất phân cực khác trở nên gần như bất khả thi nếu không có các biện pháp hỗ trợ như dẫn xuất hóa hoặc sử dụng tác nhân tạo cặp ion.
2.2. Sự cần thiết của kỹ thuật dẫn xuất hóa acid amin phức tạp
Để tăng khả năng lưu giữ trên cột pha đảo, dẫn xuất hóa acid amin là giải pháp phổ biến. Các tác nhân như PITC, OPA hay AQC được sử dụng để phản ứng với nhóm amin của acid amin [76]. Quá trình này không chỉ làm giảm độ phân cực mà còn giúp tăng độ nhạy phát hiện. Tuy nhiên, mỗi tác nhân lại có những yêu cầu riêng về pH, nhiệt độ và thời gian phản ứng. Hơn nữa, độ ổn định của sản phẩm dẫn xuất cũng là một yếu tố cần kiểm soát chặt chẽ. Việc loại bỏ thuốc thử dư thừa sau phản ứng cũng là một bước cần thiết để tránh gây nhiễu cho sắc ký đồ, làm cho toàn bộ quy trình phân tích trở nên cồng kềnh.
2.3. Vấn đề phân tích trong nền mẫu phức tạp như huyết tương
Nền mẫu huyết tương là một trong những nền mẫu thách thức nhất. Nồng độ protein cao đòi hỏi phải có bước loại tủa hiệu quả bằng các tác nhân như acid (SSA, TCA) hoặc dung môi hữu cơ (acetonitril, methanol) [35]. Quá trình này có thể dẫn đến hiện tượng kết tủa đồng thời và làm mất một phần chất phân tích, ảnh hưởng đến độ thu hồi. Các ion muối và lipid có trong mẫu cũng có thể gây ra hiệu ứng nền (matrix effect) khi phân tích bằng khối phổ, làm suy giảm hoặc tăng cường tín hiệu của chất phân tích một cách khó lường, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý mẫu và nội chuẩn phù hợp để đảm bảo độ chính xác.
III. Hướng dẫn xây dựng phương pháp HILIC DAD cho chế phẩm
Luận án đã trình bày chi tiết quá trình xây dựng phương pháp phân tích acid amin trong các chế phẩm dược phẩm bằng kỹ thuật HILIC kết hợp với detector mảng diod (DAD). Mục tiêu chính là phát triển một quy trình phân tích duy nhất có khả năng định lượng đồng thời cả acid amin và các hoạt chất khác có độ phân cực khác nhau trong cùng một chế phẩm, điều mà các phương pháp truyền thống thường phải dùng nhiều quy trình riêng biệt. Quá trình nghiên cứu bắt đầu bằng việc khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký tối ưu. Các yếu tố như loại pha tĩnh (silica, amino, amid, pha tĩnh zwitterionic), thành phần và pH của pha động, nồng độ đệm và nhiệt độ cột đều được xem xét kỹ lưỡng để đạt được khả năng tách tốt nhất và hình dạng pic đối xứng. Ví dụ, nghiên cứu cho thấy nồng độ đệm amoni acetat ảnh hưởng đáng kể đến thời gian lưu và độ phân giải giữa Tryptophan và Phenylalanin trên cột Inertsil Amide (Bảng 3.3). Sau khi tìm được điều kiện tối ưu, bước tiếp theo là thẩm định phương pháp phân tích một cách toàn diện theo các tiêu chuẩn quốc tế. Các chỉ tiêu như độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian) và độ đúng đều được đánh giá nghiêm ngặt. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp HILIC-DAD được xây dựng có độ tin cậy cao, phù hợp để ứng dụng trong kiểm soát chất lượng dược phẩm, ví dụ như định lượng đồng thời Paracetamol và Methionin trong chế phẩm Pasafe.
3.1. Quy trình phân tích đồng thời acid amin và hoạt chất khác
Một trong những đóng góp quan trọng của nghiên cứu là khả năng phân tích đồng thời các thành phần có bản chất hóa học khác nhau. Ví dụ, với chế phẩm Amiphargen chứa amoni glycyrrhizinat (AG), cystein (Cys) và glycin (Gly), thay vì phải sử dụng ba phương pháp riêng biệt như tiêu chuẩn cơ sở, phương pháp HILIC được phát triển cho phép định lượng cả ba chất trong một lần chạy. Tương tự, phương pháp này cũng đã định lượng thành công cystin và vitamin B6 trong viên nén Cystine B6 Bailleul, giúp tiết kiệm thời gian, chi phí và dung môi, tối ưu hóa quy trình kiểm nghiệm.
3.2. Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách HILIC
Việc tối ưu hóa điều kiện sắc ký là chìa khóa thành công. Luận án đã khảo sát chi tiết ảnh hưởng của pH pha động đến sự lưu giữ của 19 acid amin trên cột Zorbax Rx-Sil (Hình 3.3), cho thấy pH là yếu tố quyết định trạng thái ion hóa và tương tác của chất phân tích với pha tĩnh. Tỷ lệ dung môi hữu cơ (acetonitril) và nồng độ muối đệm cũng được tinh chỉnh để cân bằng giữa thời gian lưu và độ phân giải. Việc lựa chọn dung môi pha mẫu cũng được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến hình dạng pic, trong đó dung môi có thành phần tương tự pha động cho kết quả tốt nhất.
3.3. Các bước thẩm định phương pháp phân tích theo quy chuẩn
Mọi phương pháp phân tích mới cần được thẩm định để đảm bảo độ tin cậy. Quá trình thẩm định phương pháp phân tích trong luận án bao gồm: kiểm tra độ phù hợp hệ thống (SST), đánh giá độ chọn lọc để chắc chắn không có sự can nhiễu từ tá dược, xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn. Độ chính xác được đánh giá ở các mức nồng độ khác nhau trong cùng một ngày và khác ngày, trong khi độ đúng được kiểm tra bằng phương pháp thêm chuẩn. Tất cả các kết quả đều đáp ứng yêu cầu, khẳng định tính hợp lệ của phương pháp đã xây dựng.
IV. Cách phân tích acid amin thơm trong huyết tương bằng LC MS MS
Để giải quyết nhu cầu chẩn đoán và theo dõi các bệnh rối loạn chuyển hóa, luận án đã phát triển một phương pháp phân tích hiệu quả sử dụng kỹ thuật HILIC kết hợp khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Phương pháp này tập trung vào việc định lượng acid amin thơm gồm Phenylalanin (Phe), Tryptophan (Trp), và Tyrosin (Tyr) trong mẫu huyết tương. Ưu điểm vượt trội của phân tích LC-MS/MS là độ nhạy và độ chọn lọc cực cao, cho phép phát hiện các chất ở nồng độ rất thấp ngay cả trong nền mẫu phức tạp. Một trong những bước quan trọng nhất là quy trình chiết tách mẫu. Nghiên cứu đã tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng cách sử dụng acetonitril để tủa protein, kết hợp ly tâm để thu dịch trong. Tỷ lệ giữa huyết tương và dung môi tủa được khảo sát cẩn thận để đạt hiệu suất thu hồi cao nhất và giảm thiểu hiệu ứng nền (Hình 3.42). Việc xây dựng phương pháp sắc ký tập trung vào việc lựa chọn cột HILIC và thành phần pha động phù hợp với đầu dò khối phổ. Pha động sử dụng đệm bay hơi như amoni acetat giúp tăng cường quá trình ion hóa và đảm bảo tín hiệu ổn định. Các thông số khối phổ, bao gồm các cặp ion mẹ-con (MRM transitions), năng lượng va chạm, được tối ưu hóa cho từng acid amin để đạt được độ nhạy tối đa. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ chính xác, độ đúng cao và giới hạn định lượng thấp, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phân tích lâm sàng.
4.1. Tối ưu quy trình chiết tách mẫu huyết tương hiệu quả
Quy trình xử lý mẫu được thiết kế đơn giản nhưng hiệu quả. Bằng cách sử dụng acetonitril lạnh để kết tủa protein, quy trình không chỉ loại bỏ các đại phân tử gây nhiễu mà còn giúp chiết tách mẫu acid amin mong muốn. Các yếu tố như tỷ lệ dung môi, thời gian và tốc độ ly tâm đều được chuẩn hóa để đảm bảo độ lặp lại. Việc sử dụng chuẩn nội đồng vị (Phe-d5) được thêm vào ngay từ đầu quy trình giúp kiểm soát và hiệu chỉnh các sai số có thể xảy ra trong quá trình xử lý mẫu và tiêm mẫu, từ đó tăng độ chính xác của việc định lượng.
4.2. Xây dựng phương pháp phân tích LC MS MS độ nhạy cao
Hệ thống phân tích LC-MS/MS được tối ưu hóa cẩn thận. Chế độ ghi phổ Multiple Reaction Monitoring (MRM) được sử dụng để tăng độ chọn lọc, chỉ theo dõi các mảnh ion đặc trưng của Phe, Trp, và Tyr (Hình 3.37). Việc lựa chọn pha động chứa tỷ lệ acetonitril cao (trên 80%) không chỉ giúp lưu giữ tốt các acid amin trên cột HILIC mà còn thúc đẩy quá trình ion hóa phun điện tử (ESI), làm tăng đáng kể cường độ tín hiệu. Điều này cho phép phương pháp đạt được giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LLOQ) rất thấp, phù hợp cho việc theo dõi nồng độ acid amin ở ngưỡng sinh lý.
4.3. Đánh giá và khắc phục ảnh hưởng nền mẫu trong phân tích
Hiệu ứng nền là một vấn đề cố hữu trong phân tích trong nền mẫu phức tạp. Luận án đã đánh giá hiệu ứng này bằng cách so sánh đáp ứng tín hiệu của chất phân tích trong dung môi tinh khiết và trong dịch chiết từ mẫu huyết tương trắng. Kết quả cho thấy có sự suy giảm tín hiệu do ảnh hưởng của nền. Để khắc phục, phương pháp xây dựng đường chuẩn trong nền (matrix-matched calibration) đã được áp dụng. Bằng cách pha các dung dịch chuẩn trong chính nền mẫu đã được xử lý, ảnh hưởng của các thành phần gây nhiễu được bù trừ, đảm bảo kết quả định lượng acid amin là chính xác và đáng tin cậy.
V. Kết quả đột phá từ luận án Ứng dụng HILIC thực tiễn
Những kết quả đạt được trong luận án đã chứng minh tính ứng dụng cao và hiệu quả vượt trội của phương pháp HILIC trong phân tích acid amin. Nghiên cứu đã áp dụng thành công các quy trình được xây dựng để định lượng chính xác hoạt chất trong nhiều loại chế phẩm thương mại và mẫu sinh học. Đối với các mẫu thực phẩm chức năng và dược phẩm, phương pháp HILIC-DAD đã định lượng thành công đồng thời Paracetamol và Methionin trong chế phẩm Pasafe, cũng như Cystin và Vitamin B6 trong chế phẩm Cystine B6 Bailleul (Bảng 3.23). Đây là một bước tiến quan trọng, giúp đơn giản hóa quy trình kiểm nghiệm so với việc phải sử dụng nhiều phương pháp riêng lẻ. Đặc biệt, việc phân tích thành công các acid amin thơm trong các chế phẩm tiêm truyền đa thành phần như Kidmin và Nephosteril đã khẳng định độ tin cậy của phương pháp. Trong lĩnh vực phân tích sinh học, phương pháp HILIC-MS/MS đã chứng tỏ năng lực vượt trội khi định lượng acid amin thơm (Phenylalanin, Tryptophan, và Tyrosin) trong mẫu huyết tương tham chiếu (Bảng 3.53). Kết quả thu được hoàn toàn nằm trong giới hạn nồng độ tham chiếu, cho thấy phương pháp này có tiềm năng lớn để ứng dụng trong sàng lọc, chẩn đoán và theo dõi các bệnh nhân bị rối loạn chuyển hóa acid amin. Luận án cũng đã đưa ra những so sánh, bàn luận sâu sắc về ưu nhược điểm của từng kỹ thuật, cung cấp cơ sở khoa học vững chắc cho việc lựa chọn phương pháp phù hợp với từng mục tiêu phân tích cụ thể.
5.1. Định lượng thành công acid amin trong chế phẩm dược phẩm
Phương pháp HILIC-DAD đã được áp dụng để định lượng Trp, Phe và Tyr trong chế phẩm tiêm truyền Kidmin và Nephosteril. Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng các acid amin này phù hợp với nhãn công bố của nhà sản xuất (Bảng 3.14). Tương tự, việc định lượng đồng thời AG, Cys, Gly trong chế phẩm Amiphargen cũng cho kết quả chính xác. Những thành công này chứng tỏ HILIC là một công cụ mạnh mẽ, linh hoạt và kinh tế cho các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thuốc, giúp nâng cao hiệu quả và đảm bảo chất lượng sản phẩm.
5.2. Phân tích Phenylalanin Tryptophan Tyrosin trong huyết tương
Đối với mẫu huyết tương, phương pháp HILIC-MS/MS đã được xác nhận là có đủ độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác để định lượng nồng độ sinh lý của các acid amin thơm. Quy trình xử lý mẫu đơn giản và thời gian phân tích ngắn (khoảng 11 phút) làm cho phương pháp này trở nên lý tưởng cho các ứng dụng lâm sàng cần xử lý số lượng mẫu lớn. Kết quả phân tích trên mẫu huyết tương tham chiếu đã khẳng định tính khả thi của phương pháp trong việc hỗ trợ chẩn đoán các bệnh như Phenylketon niệu (PKU) hay Tyrosin huyết (TYR).
5.3. So sánh ưu nhược điểm của phương pháp HILIC DAD và HILIC MS MS
Luận án đã chỉ ra rằng HILIC-DAD là phương pháp kinh tế, dễ tiếp cận, phù hợp cho việc phân tích các hoạt chất ở nồng độ tương đối cao trong các chế phẩm dược phẩm. Nhược điểm của nó là độ nhạy và độ chọn lọc thấp hơn. Ngược lại, phân tích LC-MS/MS mang lại độ nhạy và độ đặc hiệu vượt trội, là lựa chọn hàng đầu cho phân tích trong nền mẫu phức tạp và định lượng các chất ở nồng độ vết. Tuy nhiên, chi phí đầu tư và vận hành của hệ thống này cao hơn đáng kể. Việc lựa chọn kỹ thuật nào phụ thuộc vào yêu cầu phân tích, nồng độ chất cần đo và nguồn lực của phòng thí nghiệm.
VI. Tương lai của phương pháp HILIC trong ngành dược và y học
Công trình nghiên cứu "Phân tích một số acid amin bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước" không chỉ giải quyết các vấn đề phân tích cụ thể mà còn mở ra những định hướng phát triển quan trọng cho tương lai. Những đóng góp mới của luận án đã cung cấp một bộ công cụ phân tích mạnh mẽ, hiệu quả và đáng tin cậy, đặc biệt là trong bối cảnh kỹ thuật HILIC còn chưa được ứng dụng rộng rãi tại Việt Nam. Việc xây dựng phương pháp thành công trên cả hai hệ thống HILIC-DAD và HILIC-MS/MS đã chứng minh tính linh hoạt của kỹ thuật này. Nó có thể được điều chỉnh để phù hợp với nhiều mục đích khác nhau, từ kiểm soát chất lượng mẫu thực phẩm chức năng và dược phẩm đến các ứng dụng chẩn đoán y khoa chuyên sâu. Triển vọng ứng dụng HILIC trong chẩn đoán rối loạn chuyển hóa là rất lớn. Với khả năng định lượng acid amin chính xác trong mẫu huyết tương mà không cần dẫn xuất hóa acid amin, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian phân tích và tăng thông lượng mẫu, một yếu tố quan trọng trong sàng lọc sơ sinh và theo dõi điều trị. Hướng phát triển trong tương lai có thể bao gồm việc mở rộng phạm vi phân tích cho nhiều nhóm acid amin khác, cũng như các chất chuyển hóa phân cực khác. Việc tiếp tục nghiên cứu các loại pha tĩnh zwitterionic mới và tối ưu hóa quy trình phân tích sẽ giúp nâng cao hơn nữa hiệu năng của phương pháp, góp phần thúc đẩy sự phát triển của ngành hóa phân tích và y dược học tại Việt Nam.
6.1. Đóng góp mới của luận án cho ngành kiểm nghiệm tại Việt Nam
Luận án đã lần đầu tiên tại Việt Nam hệ thống hóa và xây dựng thành công các quy trình phân tích acid amin bằng HILIC. Công trình đã cung cấp hai phương pháp đã được thẩm định toàn diện: một phương pháp định lượng đồng thời acid amin và các hoạt chất khác trong chế phẩm dược, và một phương pháp định lượng các acid amin thơm trong huyết tương. Đây là những tài liệu khoa học quý giá, có thể được áp dụng trực tiếp tại các viện kiểm nghiệm, bệnh viện và công ty dược phẩm, góp phần nâng cao năng lực phân tích và đảm bảo chất lượng sản phẩm cũng như sức khỏe cộng đồng.
6.2. Triển vọng ứng dụng HILIC trong chẩn đoán rối loạn chuyển hóa
Với khả năng phân tích nhanh, chính xác và không cần dẫn xuất hóa, phương pháp HILIC-MS/MS là một công cụ đầy hứa hẹn cho lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng. Nó có thể được tích hợp vào các chương trình sàng lọc sơ sinh để phát hiện sớm các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh. Hơn nữa, phương pháp này cũng hỗ trợ đắc lực cho các bác sĩ trong việc theo dõi hiệu quả phác đồ điều trị thông qua việc giám sát chặt chẽ nồng độ các acid amin trong máu bệnh nhân, từ đó có những điều chỉnh kịp thời và phù hợp, cải thiện chất lượng cuộc sống cho người bệnh.
