Khóa luận: Điều chế và khảo sát một số dẫn xuất ester của Protocetraric Acid

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu điều chế một số dẫn xuất protocetraric acid, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải pháp cụ thể cho vấn đề .

• Trường học: Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Khóa Luận Điều Chế Một Số Dẫn Xuất Protocetraric Acid
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI NÓI ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Định nghĩa
• 1.2. Phản ứng ester hóa trên depsidone
• 1.3. PROTOCETRARIC ACID VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA NÓ
• 1.3.1. Tổng quát
• 1.3.2. Hoạt tính sinh học của protocetraric acid
• 1.3.3. Các phản ứng đã nghiên cứu trên protocetraric acid
• 1.3.3.1. Phản ứng tổng hợp protocetraric acid
• 1.3.3.2. Phản ứng điều chế các dẫn xuất của protocetraric acid
• 2. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
• 2.1. HÓA CHẤT
• 2.2. THIẾT BỊ
• 2.3. QUY TRÌNH ĐIỀU CHẾ CÁC DẪN XUẤT ESTER CỦA PROTOCETRARIC ACID
• 2.3.1. Phản ứng giữa protocetraric và benzoic acid
• 2.3.2. Phản ứng giữa protocetraric acid và trans-cinnamic acid
• 2.3.3. Phản ứng giữa prototocetraric acid và trans-4-methylcinnamic acid
• 2.3.4. Phản ứng giữa protocetraric acid và trans-4-methoxycinnamic acid
• 2.3.5. Phản ứng giữa protocetraric acid và (E)-α-methylcinnamic acid
• 2.3.6. Phản ứng giữa protocetraric acid và trans-4-nitrocinnamic acid
• 2.3.7. Phản ứng giữa protocetraric acid và gyrophoric acid
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. SẢN PHẨM CỦA PHẢN ỨNG GIỮA PROTOCETRARIC ACID VỚI BENZOIC ACID
• 3.1.1. Cấu trúc hóa học của sản phẩm Pr.B2
• 3.1.2. Cấu trúc hóa học sản phẩm Pr.B1
• 3.2. SẢN PHẨM CỦA PHẢN ỨNG GIỮA PROTOCETRARIC ACID VỚI TRANS-CINNAMIC ACID
• 3.2.1. Cấu trúc hóa học sản phẩm Pm.C3

Tóm tắt

I. Khám phá protocetraric acid Tiềm năng từ hợp chất thiên nhiên

Protocetraric acid là một depsidone, một dạng axit lichenic có cấu trúc phức tạp, được tìm thấy trong nhiều loài địa y, đặc biệt là chi Parmotrema. Hợp chất thiên nhiên này tồn tại ở dạng bột màu trắng, tan kém trong các dung môi thông thường nhưng tan tốt hơn trong dimethyl sulfoxide (DMSO). Về mặt khoa học, nó được định danh là 4-formyl-3,8-dihydroxy-9-hydroxymethyl-1,6-dimethyl-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-7-carboxylic acid. Tầm quan trọng của protocetraric acid không chỉ nằm ở cấu trúc độc đáo mà còn ở hoạt tính sinh học đa dạng của nó. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất depsidone, bao gồm protocetraric acid, sở hữu nhiều đặc tính y dược quý giá. Chúng có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và thậm chí ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Những đặc tính này mở ra triển vọng lớn trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, biến protocetraric acid thành một khung sườn lý tưởng để phát triển các loại thuốc mới. Việc chiết xuất từ địa y Parmotrema sp. cho thấy đây là nguồn cung cấp dồi dào hợp chất này, tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu khoa học sâu hơn nhằm khai thác tối đa tiềm năng của nó.

1.1. Nguồn gốc và đặc điểm của loại axit lichenic này

Protocetraric acid là một thành phần hóa học quan trọng, được phân lập hợp chất từ nhiều loài địa y khác nhau như Parmotrema, Parmelia, và Ramalina. Trong đó, loài Parmotrema sp. được xác định là nguồn cung cấp chính cho các nghiên cứu trong khóa luận này. Cấu trúc của protocetraric acid thuộc nhóm depsidone, đặc trưng bởi hai vòng phenol liên kết với nhau qua một cầu nối ester và một cầu nối ether. Đặc điểm này tạo nên một khung hóa học bền vững nhưng cũng đủ linh hoạt cho các phản ứng biến đổi cấu trúc hóa học. Hợp chất này có dạng bột trắng và khả năng hòa tan hạn chế, đặt ra những thách thức nhất định trong quá trình xử lý và thực hiện phản ứng hóa học.

1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học và tiềm năng dược liệu

Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh hoạt tính sinh học đáng kể của protocetraric acid. Theo bảng 1.1 trong tài liệu gốc, hợp chất này có khả năng kháng 6 dòng nấm (ví dụ: Aspergillus fumigatus, Candida albicans) và 6 dòng vi khuẩn khác nhau. Đáng chú ý, các dẫn xuất của nó như fumarprotocetraric acid lại thể hiện phổ kháng khuẩn rộng hơn, cho thấy việc biến đổi cấu trúc có thể nâng cao hiệu quả sinh học. Ví dụ, fumarprotocetraric acid có thể ức chế Streptococcus faecalis trong khi protocetraric acid thì không [16]. Điều này củng cố giả thuyết rằng việc điều chế các dẫn xuất ester mới có thể tạo ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và tiềm năng chống oxy hóa vượt trội, mở đường cho các ứng dụng dược liệu mới.

II. Thách thức trong việc điều chế dẫn xuất protocetraric acid

Việc điều chế và phát triển các dẫn xuất của protocetraric acid đối mặt với nhiều thách thức đáng kể, bắt nguồn từ cả nguồn gốc tự nhiên và tính chất hóa học của nó. Mặc dù là một hợp chất thiên nhiên đầy hứa hẹn, nguồn cung protocetraric acid vẫn còn hạn chế và phụ thuộc hoàn toàn vào quá trình chiết xuất từ địa y. Quá trình này không chỉ tốn thời gian mà hiệu suất thu được cũng không ổn định, ảnh hưởng trực tiếp đến quy mô nghiên cứu và sản xuất. Hơn nữa, cấu trúc hóa học phức tạp của protocetraric acid, với nhiều nhóm chức nhạy cảm như carboxylic acid, phenol, và aldehyde, đòi hỏi các điều kiện phản ứng phải được kiểm soát chặt chẽ để tránh các phản ứng phụ không mong muốn. Sự cạnh tranh giữa các nhóm chức trong các phản ứng như phản ứng ester hóa có thể dẫn đến hiệu suất thấp và tạo ra hỗn hợp sản phẩm khó tách biệt. Những khó khăn này giải thích tại sao các nghiên cứu về dẫn xuất ester của protocetraric acid còn khá ít ỏi, và việc tìm ra một quy trình tổng hợp hữu cơ hiệu quả vẫn là một mục tiêu quan trọng trong các luận văn hóa học hiện nay.

2.1. Hạn chế về nguồn cung từ quá trình chiết xuất địa y

Nguồn cung protocetraric acid chủ yếu đến từ việc phân lập hợp chất từ địa y Parmotrema sp. Quá trình này đòi hỏi kỹ thuật chiết xuất và tinh chế phức tạp. Sản lượng hợp chất thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mùa vụ, điều kiện sinh trưởng của địa y và hiệu quả của phương pháp chiết. Sự không ổn định này gây khó khăn cho việc tiến hành các nghiên cứu quy mô lớn. Việc tìm kiếm các phương pháp tổng hợp toàn phần protocetraric acid, như quy trình của Tony Sala và Melvyn V. Sargent [21], là một hướng đi tiềm năng nhưng lại quá phức tạp với 13 giai đoạn, không phù hợp cho sản xuất đại trà.

2.2. Sự phức tạp trong biến đổi cấu trúc hóa học

Cấu trúc của protocetraric acid chứa nhiều nhóm chức có khả năng phản ứng, bao gồm nhóm carboxylic acid (-COOH), hai nhóm phenol-hydroxyl (-OH), một nhóm alcohol bậc một (-CH2OH) và một nhóm aldehyde (-CHO). Sự đa dạng này làm cho việc biến đổi cấu trúc hóa học một cách chọn lọc trở nên vô cùng khó khăn. Khi thực hiện phản ứng ester hóa tại nhóm -CH2OH, các nhóm chức khác có thể tham gia vào phản ứng phụ, làm giảm hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm mong muốn. Việc bảo vệ các nhóm chức không tham gia phản ứng là cần thiết nhưng lại làm tăng số bước tổng hợp, khiến quy trình trở nên cồng kềnh và tốn kém.

III. Phương pháp ester hóa điều chế dẫn xuất protocetraric acid

Để vượt qua các thách thức và tạo ra các dẫn xuất mới, nghiên cứu khoa học này tập trung vào phản ứng ester hóa trên nhóm alcohol bậc một của protocetraric acid. Quy trình được xây dựng dựa trên việc sử dụng các acid carboxylic đơn chức khác nhau (benzoic acid, trans-cinnamic acid và các dẫn xuất của nó) làm tác chất, với sự hiện diện của xúc tác acid Lewis là AlCl₃ trong dung môi DMSO. Việc lựa chọn DMSO làm dung môi rất quan trọng vì khả năng hòa tan tốt protocetraric acid. Quá trình tổng hợp hữu cơ được thực hiện trong bình cầu, nơi các yếu tố như nhiệt độ, thời gian phản ứng, và lượng xúc tác được khảo sát và tối ưu hóa để đạt hiệu suất cao nhất. Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sản phẩm thô được xử lý qua quá trình chiết lỏng-lỏng với ethyl acetate để loại bỏ DMSO. Bước cuối cùng và quan trọng nhất là tinh chế sản phẩm bằng phương pháp sắc ký cột, cho phép phân lập hợp chất tinh khiết từ hỗn hợp phản ứng. Quy trình này đã được áp dụng thành công để điều chế một loạt các dẫn xuất ester mới, mở ra một hướng đi hiệu quả cho việc biến đổi cấu trúc hóa học của protocetraric acid.

3.1. Quy trình tổng hợp hữu cơ với xúc tác AlCl3

Quy trình thực nghiệm được tiến hành bằng cách cho 0.0267 mmol protocetraric acid phản ứng với 1.23 mmol acid carboxylic (tỉ lệ 1:46) trong dung môi DMSO và một lượng nhỏ xúc tác AlCl₃. Hỗn hợp được đun nóng và khuấy từ trong các điều kiện nhiệt độ (từ 70°C đến 120°C) và thời gian (từ 0.25 giờ đến 6 giờ) khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu. Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng để xác định thời điểm kết thúc. Phương pháp này cho phép khảo sát một cách hệ thống ảnh hưởng của các yếu tố phản ứng đến hiệu suất tạo thành dẫn xuất ester của protocetraric acid.

3.2. Vai trò của sắc ký cột trong phân lập hợp chất tinh khiết

Sau khi phản ứng kết thúc và loại bỏ dung môi, sản phẩm thô là một hỗn hợp phức tạp chứa sản phẩm chính, tác chất dư và các sản phẩm phụ. Sắc ký cột đóng vai trò quyết định trong việc tinh chế. Bằng cách sử dụng hệ dung môi n-hexane:EtOAc:acetone:AcOH (10:1:0.2), các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp được tách ra dựa trên sự khác biệt về độ phân cực. Quá trình này cho phép phân lập hợp chất mong muốn với độ tinh khiết cao. Sản phẩm sau khi tinh chế được cân để tính hiệu suất cô lập và chuẩn bị cho các bước phân tích cấu trúc tiếp theo.

IV. Cách xác định cấu trúc dẫn xuất bằng phương pháp phổ NMR

Việc xác định cấu trúc của các dẫn xuất protocetraric acid mới tổng hợp được là một bước quan trọng, khẳng định sự thành công của quá trình điều chế. Phương pháp phổ NMR (Cộng hưởng từ hạt nhân) là công cụ chính được sử dụng trong luận văn hóa học này. Cụ thể, phổ ¹H-NMR và ¹³C-NMR cung cấp những thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử. Phổ ¹H-NMR cho biết số lượng và loại proton, cũng như mối quan hệ không gian giữa chúng, trong khi phổ ¹³C-NMR xác định các nguyên tử carbon trong khung phân tử. Bằng cách so sánh dữ liệu phổ của sản phẩm với dữ liệu của protocetraric acid ban đầu, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác vị trí diễn ra phản ứng ester hóa. Sự xuất hiện của các tín hiệu mới đặc trưng cho gốc acid carboxylic đã phản ứng (ví dụ, các proton thơm của gốc benzoyl) và sự dịch chuyển hóa học của các proton gần vị trí phản ứng (ví dụ, nhóm -CH₂OH trở thành -CH₂O-ester) là những bằng chứng không thể chối cãi. Ngoài ra, các kỹ thuật phổ hai chiều như HMBC và HSQC cũng được sử dụng để củng cố các kết luận về cấu trúc.

4.1. Phân tích dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR

Dữ liệu từ phương pháp phổ NMR được phân tích kỹ lưỡng. Ví dụ, trong trường hợp của sản phẩm Pr.B2 (dẫn xuất với benzoic acid), phổ ¹H-NMR cho thấy sự xuất hiện của 5 proton mới trong vùng tín hiệu của vòng thơm (δΗ 7.5-8.0 ppm), tương ứng với gốc benzoyl. Đồng thời, tín hiệu của nhóm methylene H-8' dịch chuyển xuống vùng từ trường thấp hơn (từ δΗ 4.79 sang δΗ 5.60), xác nhận rằng phản ứng ester đã xảy ra tại vị trí này. Dữ liệu phổ ¹³C-NMR cũng củng cố điều này với sự xuất hiện của các tín hiệu carbon mới từ gốc benzoyl và sự dịch chuyển của C-8'.

4.2. Biện luận cấu trúc và phát hiện các hợp chất mới

Dựa trên các dữ liệu phổ nghiệm, cấu trúc của các sản phẩm mới đã được biện luận và xác định. Toàn bộ các hợp chất ester điều chế được trong khóa luận này đều là những hợp chất mới, chưa từng được công bố trước đây. Quá trình biện luận không chỉ xác nhận sự hình thành liên kết ester mà còn phát hiện ra những biến đổi cấu trúc bất ngờ khác. Ví dụ, việc phân tích phổ của sản phẩm từ phản ứng với trans-cinnamic acid đã dẫn đến việc phát hiện ra sự chuyển vị khung depsidone, một phát hiện khoa học quan trọng được trình bày chi tiết ở phần sau.

V. Khám phá bất ngờ Chuyển vị từ protocetraric acid

Một trong những kết quả đột phá và bất ngờ nhất của nghiên cứu khoa học này là sự phát hiện ra hiện tượng chuyển vị cấu trúc của protocetraric acid trong điều kiện phản ứng. Dưới tác dụng của xúc tác AlCl₃ và nhiệt độ, protocetraric acid, một para-depsidone, đã chuyển hóa thành parmosidone A, một meta-depsidone. Đây là một sự biến đổi cấu trúc hóa học quan trọng, chưa từng được ghi nhận trước đây trong các phản ứng ester hóa của hợp chất này. Cơ chế đề nghị cho sự chuyển vị này bao gồm hai giai đoạn: đầu tiên là sự thủy phân liên kết ester nội phân tử của vòng depsidone, sau đó là phản ứng thế nucleophile nội phân tử vào một vị trí khác trên vòng thơm để tạo thành cấu trúc meta-depsidone mới. Phát hiện này không chỉ làm phong phú thêm kiến thức về hóa học của các axit lichenic mà còn mở ra một hướng mới trong việc tổng hợp hữu cơ. Việc kiểm soát được sự chuyển vị này có thể cho phép các nhà khoa học tạo ra một loạt các khung depsidone mới từ một tiền chất duy nhất, làm đa dạng hóa nguồn hợp chất tiềm năng cho ngành tổng hợp hóa dược.

5.1. Cơ chế chuyển hóa từ para depsidone sang meta depsidone

Cơ chế đề nghị cho sự chuyển vị được giải thích trong Hình 3.4 của tài liệu. Xúc tác acid Lewis AlCl₃ tấn công vào nhóm carbonyl của liên kết ester trong vòng depsidone, làm cho liên kết này dễ bị thủy phân hơn. Sau khi vòng bị phá vỡ, phân tử tồn tại ở dạng diphenyl ether mạch hở. Tiếp theo, nhóm -OH phenol sẽ tấn công vào một vị trí khác trên vòng thơm còn lại (vị trí C-2), tạo ra một liên kết ester mới và hình thành cấu trúc meta-depsidone của parmosidone A. Quá trình này được hỗ trợ bởi sự hiện diện của các nhóm hút electron trên vòng thơm.

5.2. Ý nghĩa của phát hiện trong tổng hợp hóa dược

Phát hiện về sự chuyển vị khung depsidone có ý nghĩa to lớn. Nó chứng tỏ rằng từ một hợp chất thiên nhiên ban đầu, chúng ta có thể tạo ra các khung cấu trúc hoàn toàn khác biệt chỉ bằng cách thay đổi điều kiện phản ứng. Điều này làm tăng hiệu quả sử dụng nguồn dược liệu quý hiếm. Các hợp chất meta-depsidone như parmosidone A có thể sở hữu những hoạt tính sinh học khác biệt và tiềm năng hơn so với các para-depsidone ban đầu. Do đó, khám phá này cung cấp một công cụ mạnh mẽ cho các nhà hóa học trong việc thiết kế và tổng hợp hóa dược, tạo ra các phân tử mới để sàng lọc hoạt tính chống ung thư, hoạt tính kháng khuẩn và tiềm năng chống oxy hóa.

VI. Tương lai nghiên cứu các dẫn xuất protocetraric acid

Khóa luận này đã mở ra nhiều hướng đi mới cho việc nghiên cứu protocetraric acid và các dẫn xuất của nó. Mặc dù đã điều chế thành công một số hợp chất ester mới và phát hiện ra sự chuyển vị cấu trúc độc đáo, vẫn còn nhiều tiềm năng chưa được khai phá. Hướng đi tương lai nên tập trung vào việc tối ưu hóa hiệu suất của các phản ứng ester hóa đã được khảo sát, đồng thời xác định hiệu suất chính xác bằng các kỹ thuật phân tích hiện đại như HPLC. Quan trọng hơn cả, các dẫn xuất mới được tổng hợp cần được đưa đi thử nghiệm hoạt tính sinh học một cách toàn diện. Việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, tiềm năng chống oxy hóa và đặc biệt là khả năng ức chế tế bào ung thư sẽ xác định giá trị thực tiễn của những nghiên cứu khoa học này. Ngoài ra, việc khảo sát sâu hơn về cơ chế chuyển vị khung depsidone trên các depsidone khác như stictic acid cũng là một hướng nghiên cứu hấp dẫn, hứa hẹn mang lại nhiều kiến thức mới cho lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và hóa học các hợp chất thiên nhiên.

6.1. Hướng tối ưu hóa quy trình và thử nghiệm hoạt tính

Công việc tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện phản ứng (xúc tác, nhiệt độ, dung môi) để nâng cao hiệu suất cô lập sản phẩm. Việc xây dựng một quy trình tổng hợp hiệu quả và có khả năng tái lặp là rất quan trọng. Song song đó, việc gửi các mẫu hợp chất tinh khiết đi sàng lọc hoạt tính sinh học là ưu tiên hàng đầu. Kết quả từ các thử nghiệm này sẽ là cơ sở để định hướng cho các nghiên cứu biến đổi cấu trúc tiếp theo, nhằm tạo ra các hợp chất có hoạt tính mạnh nhất.

6.2. Khám phá tiềm năng chống oxy hóa và kháng khuẩn

Dựa trên hoạt tính đã biết của protocetraric acid, các dẫn xuất ester mới được kỳ vọng sẽ có tiềm năng chống oxy hóa và hoạt tính kháng khuẩn cải thiện. Cần tiến hành các thử nghiệm định lượng để xác định chỉ số IC50 (nồng độ ức chế 50%) hoặc MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) của các hợp chất này trên nhiều dòng vi khuẩn và gốc tự do khác nhau. Những dữ liệu này sẽ cung cấp bằng chứng khoa học vững chắc về tiềm năng ứng dụng của chúng trong y học và công nghệ thực phẩm, góp phần phát triển các loại dược liệu mới từ nguồn tài nguyên địa y của Việt Nam.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Khóa luận tốt nghiệp tập trung vào lĩnh vực hóa học hữu cơ và hóa học các hợp chất thiên nhiên, cụ thể là hướng nghiên cứu bán tổng hợp dẫn xuất từ nguồn hoạt chất thứ cấp của địa y. Bối cảnh thực tiễn được tác giả nêu rõ xuất phát từ tiềm năng dược lý của nhóm hợp chất depsidone. Trong những năm gần đây, depsidone thu hút sự quan tâm lớn nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng như khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, ức chế enzyme estrogen/aromatase và ngăn cản quá trình phân bào. Những đặc tính này mở ra triển vọng ứng dụng trong việc phát triển các dẫn xuất mới định hướng điều trị ung thư, đặc biệt là ung thư vú và ung thư buồng trứng.

Trong số các loài địa y, loài Parmotrema sp. chứa hàm lượng dồi dào hợp chất protocetraric acid. Mặc dù là một depsidone phong phú trong tự nhiên, các nghiên cứu biến đổi hóa học tạo dẫn xuất ester của protocetraric acid từ trước đến nay còn rất hạn chế do nguồn cung cấp phân lập từ tự nhiên gặp nhiều rào cản kỹ thuật. Xuất phát từ thực tiễn đó, tác giả tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm khảo sát phản ứng ester hóa trên khung phân tử protocetraric acid với một số acid đơn chức nhằm tạo ra các dẫn xuất mới mang hoạt tính sinh học tiềm năng.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của khóa luận được xác định cụ thể như sau:

1. Ly trích, tinh chế và chuẩn bị nguồn nguyên liệu protocetraric acid tự nhiên từ loài địa y Parmotrema sp.
2. Thực hiện và khảo sát phản ứng ester hóa giữa protocetraric acid với các carboxylic acid đơn chức bao gồm: benzoic acid, gyrophoric acid, trans-cinnamic acid và các dẫn xuất thế của trans-cinnamic acid (trans-4-methylcinnamic acid, (E)-α-methylcinnamic acid, trans-4-methoxycinnamic acid, trans-4-nitrocinnamic acid).
3. Thăm dò và đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ phản ứng: tỷ lệ tác chất, lượng xúc tác Lewis acid ($\text{AlCl}_3$), thể tích dung môi dimethyl sulfoxide (DMSO), nhiệt độ và thời gian phản ứng.
4. Tách chiết, tinh chế các sản phẩm tạo thành bằng kỹ thuật sắc ký và xác định cấu trúc hóa học của chúng bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hợp chất protocetraric acid được ly trích từ địa y Parmotrema sp. và 7 hợp chất carboxylic acid dùng làm tác chất ghép nối.
• Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp hữu cơ ở quy mô phòng thí nghiệm; khảo sát điều kiện phản ứng ester hóa sử dụng xúc tác $\text{AlCl}_3$; phân tích cấu trúc sản phẩm bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1D và 2D NMR tại phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình hóa học

Đề tài dựa trên cơ sở hóa học của khung phân tử depsidone. Về mặt định nghĩa, depsidone là các dẫn xuất phenol có khung sườn cấu tạo gồm hai phân tử phenol ngưng tụ với nhau thông qua đồng thời một cầu nối ester và một cầu nối ether (tạo dị vòng 7 cạnh dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one). Phân tử protocetraric acid có tên danh pháp IUPAC là 4-formyl-3,8-dihydroxy-9-hydroxymethyl-1,6-dimethyl-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-7-carboxylic acid. Về mặt hóa lập thể và nhóm định chức, protocetraric acid sở hữu một cấu trúc đa chức phức tạp gồm: 2 nhóm phenol tự do (ở vị trí C-3 và C-8), 1 nhóm alcol nhất cấp hydroxymethyl (ở vị trí C-9/C-8'), 1 nhóm aldehyde (-CHO tại C-4), 1 nhóm carboxylic acid (-COOH tại C-7) và cầu nối ester nội phân tử.

Khóa luận kế thừa và đối chiếu dữ liệu từ các công trình chuyển hóa depsidone trước đây:

• Phản ứng ester hóa trên nhóm -COOH của physodic acid và 4-O-methylphysodic acid bằng diazomethane trong ether ở 0–5°C (Culberson, 1966); triacetylvittatolic acid bằng diazomethane (Teruhisa Hirayama và cộng sự, 1975); methyl hóa corynesidone B bằng iodomethane trong $\text{K}_2\text{CO}_3/\text{DMF}$ (Porntep Chomcheon và cộng sự, 2009).
• Phản ứng trên nhóm alcol nhất cấp của protocetraric acid: hydrogen hóa bằng $\text{H}_2/\text{Pd/C}$ điều chế hydroprotocetraric acid đạt hiệu suất 87% (Yasuhiko Asahina và Tyo-Taro Tukamoto, 1933); phản ứng ngưng tụ tạo phenylhydrazone, thiosemicarbazone và benzimidazole (Josef Klosa, 1952); phản ứng acyl hóa tạo 9'-monopropionylprotocetraric acid (Klosa, 1952) và 9'-monomalonylprotocetraric acid (Keogh, 1977); phản ứng ether hóa tạo 9'-O-alkylprotocetraric acid với methanol, ethanol, n-propanol (81%), n-butanol (79%), benzyl alcohol (Asahina, 1933, 1934), isopropanol (55%), isobutanol (Klosa, 1952), và phản ứng Williamson với iodoethane đạt hiệu suất 66% (Trần Thị Quỳnh Hoa, 2014); quy trình tổng hợp toàn phần protocetraric acid qua 13 giai đoạn từ methyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate (Tony Sala và Melvyn V. Sargent, 1981).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Bán tổng hợp hữu cơ: Phản ứng giữa protocetraric acid ($0{,}0267\text{ mmol}$) và carboxylic acid ($1{,}23\text{ mmol}$, tỷ lệ mol 1:46; riêng gyrophoric acid dùng tỷ lệ 1:1 là $0{,}0267\text{ mmol}$), thực hiện trong bình cầu 50 mL, dung môi DMSO (1–2 mL), xúc tác Lewis acid $\text{AlCl}_3$ ($0{,}0825\text{ mg}$ đến $1{,}1\text{ mg}$), khuấy từ gia nhiệt bằng bếp cách dầu ở nhiệt độ 70–120°C trong khoảng thời gian từ 0,25 đến 6 giờ.
• Phương pháp tách chiết và tinh chế: Hỗn hợp phản ứng sau khi làm nguội được chiết lỏng-lỏng phân bố nhiều lần với ethyl acetate nhằm loại bỏ hoàn toàn dung môi DMSO có nhiệt độ sôi cao. Quá trình chiết được kiểm tra liên tục bằng sắc ký bản mỏng (TLC) cho đến khi dịch chiết không còn vết hấp thu UV. Sau đó, sản phẩm thô được tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký cột silica gel cổ điển với hệ dung môi giải ly $n\text{-hexane} : \text{EtOAc} : \text{acetone} : \text{AcOH}$ (tỷ lệ 10:1:0,2).
• Phương pháp phổ nghiệm xác định cấu trúc: Sản phẩm cô lập được phân tích cấu trúc bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ($^1\text{H-NMR}$ ở tần số 500 MHz, $^{13}\text{C-NMR}$ ở tần số 125 MHz) và hai chiều (HMBC, HSQC), ghi trên máy Bruker Ultrashield 500 Plus sử dụng các dung môi deuterated gồm $\text{DMSO-}d_6$ và $\text{Acetone-}d_6$.
• Nguồn dữ liệu và hóa chất: Protocetraric acid tinh khiết tự nhiên ly trích từ địa y Parmotrema sp.; các tác chất carboxylic acid gồm trans-cinnamic acid (99%), trans-4-methylcinnamic acid (99%), trans-4-methoxycinnamic acid (99%), trans-4-nitrocinnamic acid (97%) từ hãng Sigma-Aldrich; xúc tác $\text{AlCl}_3\cdot6\text{H}2\text{O}$ (Trung Quốc, 97%); dung môi hữu cơ tinh chế qua chưng cất phân đoạn kiểm soát nhiệt độ sôi (chloroform ở 61°C, ethyl acetate ở 77°C, acetone ở 56°C); bản mỏng TLC silica gel $60\text{F}{254}$ (Merck).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa cơ sở lý thuyết về hợp chất depsidone, loài địa y sinh tổng hợp và lịch sử các nghiên cứu chuyển hóa hóa học liên quan đến protocetraric acid. Nội dung trọng tâm bao gồm:

• Định nghĩa, phân loại và hoạt tính sinh học chung của depsidone: khả năng chống tia cực tím, kích thích apoptosis tế bào ung thư ác tính, ức chế enzyme và chống oxy hóa.
• Đặc tính hóa lý của protocetraric acid: chất bột màu trắng đục, tan kém trong methanol, acetone, chloroform, tan tốt hơn trong DMSO; phân bố trong các chi địa y Parmotrema, Parmelia, Ramalina.
• Dữ liệu hoạt tính sinh học định lượng: Trình bày số liệu nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ ức chế 50% ($\text{IC}_{50}$) từ các nghiên cứu trước nhằm làm rõ tiềm năng sinh học của protocetraric acid và các dẫn xuất so sánh.

Tên chủng vi sinh vật / Dòng tế bào ung thư	Protocetraric acid $\text{MIC}\ (\mu\text{g/mL})$	Fumarprotocetraric acid $\text{MIC}\ (\mu\text{g/mL})$
Aspergillus flavus	Không có hoạt tính	(*)
Aspergillus fumigatus	500	(*)
Candida albicans	18,1	(*)
Fusarium oxysporum	500	(*)
Mucor mucedo	500	(*)
Paecilomyces variotii	500	(*)
Penicillium purpurescens	Không có hoạt tính	(*)
Aeromonas hydrophila	(*)	150,6
Escherichia coli	Không có hoạt tính	(*)
Klebsiella pneumoniae	Không có hoạt tính	(*)
Listeria monocytogenes	(*)	4,6
Mycobacterium tuberculosis	125,5	(*)
Streptococcus faecalis	Không có hoạt tính	150,0
Ehrlich carcinoma, Ehrlich sarcoma, Yoshida sarcoma	Không có hoạt tính	(*)

Ghi chú: () Không thử nghiệm.*

Bên cạnh đó, dẫn xuất 9'-O-methylprotocetraric acid từng được Carine Bezivin (2004) thử nghiệm trên 6 dòng tế bào ung thư (Murine lympholytic leukaemia, Murine Lewis lung carcinoma, Human chronic myelogenous leukaemia, Human brain metastasis of a prostate carcinoma, Human breast adenocarcinoma, Human glioblastoma) đều cho giá trị $\text{IC}_{50} > 100\ \mu\text{g/mL}$ (không có hoạt tính). Sự khác biệt về phổ kháng khuẩn giữa protocetraric acid và dẫn xuất ester hóa tự nhiên fumarprotocetraric acid (9'-monofumarylprotocetraric acid) là cơ sở thúc đẩy việc tổng hợp các dẫn xuất ester mới.

Chương 2: Thực nghiệm

Chương 2 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị, nguồn gốc hóa chất tinh khiết và thông số kỹ thuật của 7 phản ứng tổng hợp khảo sát trên protocetraric acid. Tất cả phản ứng dùng lượng chất nền chuẩn là $0{,}0267\text{ mmol}$ protocetraric acid.

STT	Acid phản ứng (R-COOH)	Khối lượng acid (mg)	Tỷ lệ mol	Thể tích DMSO (mL)	Khối lượng $\text{AlCl}_3$ (mg)	Nhiệt độ (°C)	Thời gian (giờ)	Kết quả ghi nhận
1a	Benzoic acid	150	1:46	2	1,1	120	0,25	Tạo sản phẩm Pr.B1 và Pr.B2
1b	Benzoic acid	150	1:46	2	1,1	120	0,5	Tạo sản phẩm Pr.B1 và Pr.B2
2a	trans-Cinnamic acid	182	1:46	2	0,0825	90	3	Tạo hỗn hợp sản phẩm
2b	trans-Cinnamic acid	182	1:46	1	0,55	100	1,5	Cô lập Pm.C2 và C3
2c	trans-Cinnamic acid	182	1:46	1	0,0825	70	6	Không phản ứng
3	trans-4-Methylcinnamic acid	200	1:46	1	0,0825	90	3	Cô lập được Pm.CM2
4a	trans-4-Methoxycinnamic acid	219	1:46	1	0,0825	80	3	Phản ứng chưa hoàn toàn
4b	trans-4-Methoxycinnamic acid	219	1:46	2	0,55	100	1	Cô lập Pr.C4M1, Pr.C4M2, Pm.C4M1
5	(E)-α-Methylcinnamic acid	200	1:46	1	0,0825	80	5	Cô lập được Pr.Cα
6	trans-4-Nitrocinnamic acid	240	1:46	1	0,0825	80	6	Không phản ứng
7	Gyrophoric acid	12,1	1:1	1	0,0825	80	5	Cô lập Pm.GXR1 và sản phẩm phụ

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 là phần trọng tâm của khóa luận, phân tích biện luận cấu trúc các sản phẩm cô lập được và đề xuất cơ chế cho từng phản ứng:

1. Phản ứng với benzoic acid: Cô lập được hai hợp chất Pr.B1 và Pr.B2.

   • Hợp chất Pr.B2: Chất bột màu trắng, tan tốt trong acetone, methanol, DMSO. Phổ $^1\text{H-NMR}$ xuất hiện tín hiệu của 5 proton nhân thơm thuộc đơn vị benzoyl gắn tại C-8' (gồm 2H ở $\delta_\text{H}\ 7{,}88\text{ ppm}$, $J = 7{,}5\text{ Hz}$ và 3H ở vùng $\delta_\text{H}\ 7{,}40\text{--}7{,}60\text{ ppm}$). Nhóm oxymethylene H-8' dịch chuyển về vùng từ trường thấp hơn ($\delta_\text{H}\ 5{,}60\text{ ppm}$) so với protocetraric acid ban đầu, chứng minh phản ứng ester hóa đã xảy ra chọn lọc trên nhóm alcol nhất cấp C-8'.
   • Hợp chất Pr.B1: Phổ $^1\text{H-NMR}$ và $^{13}\text{C-NMR}$ tương đồng với protocetraric acid nhưng nhóm methylene tại C-8' dịch chuyển về vùng từ trường cao trên phổ proton và vùng từ trường thấp trên phổ carbon. Pr.B1 được xác định là sản phẩm tách nước (dehydration) nội phân tử của protocetraric acid tại nhóm hydroxymethyl C-8'; hàm lượng Pr.B1 gia tăng khi nâng cao nhiệt độ phản ứng.

2. Phản ứng với trans-cinnamic acid: Cô lập được sản phẩm Pm.C2 và chất C3.

   • Phân tích phổ của C3 cho thấy các tín hiệu hoàn toàn trùng khớp với parmosidone A (một meta-depsidone).
   • Sản phẩm Pm.C2: Phổ $^1\text{H-NMR}$ cho thấy sự tương đồng ở nhân thơm A nhưng có sự dịch chuyển rõ rệt ở nhân B so với protocetraric acid và Pr.B2. Cụ thể, nhóm methyl H-9' dịch chuyển về vùng từ trường rất thấp, trong khi nhóm methylene H-8' chuyển dịch về vùng từ trường cao hơn. Phổ xuất hiện 2 proton olefin ở $\delta_\text{H}\ 6{,}58\text{ ppm}$ ($1\text{H}, d, J = 16\text{ Hz}$) và 5 proton thơm đặc trưng của nhóm cinnamoyl. Tương quan HMBC giữa H-8' với C-2', C-3', C-4' và giữa H-9' với C-1', C-5', C-6' xác định Pm.C2 là sản phẩm ester của trans-cinnamic acid gắn trên parmosidone A.
   • Cơ chế chuyển vị: Dưới tác dụng của xúc tác Lewis acid $\text{AlCl}_3$, protocetraric acid (dạng para-depsidone) bị thủy phân mở vòng liên kết ester depsidone (giai đoạn i), sau đó thực hiện phản ứng thế ái nhân nội phân tử vào vị trí C-2 của nhân thơm A (giai đoạn ii) dưới sự hỗ trợ rút electron mạnh của hai nhóm thế -COOR (tại C-1) và -CHO (tại C-3), tạo thành khung meta-depsidone (parmosidone A).

3. Phản ứng với trans-4-methylcinnamic acid: Cô lập được Pm.CM2.

   • Phổ $^1\text{H-NMR}$ của Pm.CM2 tương đồng với Pm.C2, bổ sung thêm tín hiệu nhóm methyl gắn trên nhân thơm tại $\delta_\text{H}\ 2{,}32\text{ ppm}$ ($3\text{H}, s$), 2 proton olefin dạng trans tại $\delta_\text{H}\ 6{,}55\text{ ppm}$ ($J = 16\text{ Hz}$) và hệ 4 proton thơm ghép cặp $AA'BB'$ đặc trưng tại $\delta_\text{H}\ 7{,}30\text{--}7{,}50\text{ ppm}$ ($J = 8{,}5\text{ Hz}$). Cấu trúc được xác định là ester giữa parmosidone A và trans-4-methylcinnamic acid.

4. Phản ứng với trans-4-methoxycinnamic acid: Cô lập được 3 hợp chất Pr.C4M1, Pm.C4M1 và Pr.C4M2.

   • Pr.C4M1 và Pm.C4M1: Đều mang tín hiệu đặc trưng của gốc 4-methoxycinnamoyl với 1 nhóm methoxy ($-\text{OCH}3$) tại $\delta\text{H}\ 3{,}73\text{ ppm}$ ($3\text{H}, s$), 2 proton olefin trans tại $\delta_\text{H}\ 6{,}54\text{ ppm}$ ($J = 16\text{ Hz}$) và 4 proton thơm vòng benzene phân bố ở $\delta_\text{H}\ 6{,}91\text{ ppm}$ ($2\text{H}, d, J = 9\text{ Hz}$) và $\delta_\text{H}\ 7{,}65\text{ ppm}$ ($2\text{H}, d, J = 9\text{ Hz}$). Khác biệt cốt lõi: Pr.C4M1 giữ nguyên vị trí methyl H-9' ở $\delta_\text{H}\ 2{,}45\text{ ppm}$ (khung protocetraric acid), trong khi Pm.C4M1 có tín hiệu H-9' dịch chuyển về $\delta_\text{H}\ 2{,}66\text{ ppm}$ (khung parmosidone A).
   • Pr.C4M2: Cấu trúc dị vòng đặc biệt. Phổ NMR ghi nhận sự biến mất của liên kết đôi olefin trans $C_{7''}=C_{8''}$, thay vào đó là sự xuất hiện của các proton methylene và methine bão hòa ở vùng từ trường cao hơn gồm H-7'' ($\delta_\text{H}\ 5{,}09\text{ ppm}$, $d, J = 8\text{ Hz}$) và H-8'' ($\delta_\text{H}\ 3{,}05\text{ ppm}$, $m$). Nhóm methylene H-8' dịch chuyển về vùng từ trường cao chứng tỏ không còn liên kết trực tiếp với dị tố oxy. Tương quan HMBC xác nhận sự hình thành cầu nối $C_{8'}-C_{8''}-C_{7''}$ và đóng vòng pyran 6 cạnh giữa vị trí C-8' và nhóm 2'-OH của nhân B với liên kết đôi của acid. Cơ chế được đề nghị: Dưới xúc tác Lewis acid, protocetraric acid chuyển hóa qua trung gian ortho-quinone methide tại nhân B, sau đó đóng vòng với trans-4-methoxycinnamic acid theo cơ chế phản ứng cộng đóng vòng Diels-Alder nội phân tử.

5. Phản ứng với (E)-α-methylcinnamic acid: Cô lập được dẫn xuất Pr.Cα.

   • Phổ NMR xác định Pr.Cα là sản phẩm ester hóa trực tiếp trên nhóm 8'-OH của protocetraric acid, với sự hiện diện của nhóm methyl olefin $\delta_\text{H}\ 2{,}00\text{ ppm}$ ($3\text{H}, d, J = 1\text{ Hz}$), 1 proton olefin tại $\delta_\text{H}\ 7{,}54\text{ ppm}$ ($1\text{H}, d, J = 1\text{ Hz}$) và 5 proton vòng thơm tại $\delta_\text{H}\ 7{,}42\text{ ppm}$ ($5\text{H}, m$).

6. Phản ứng với trans-4-nitrocinnamic acid: Phản ứng không diễn ra ở 80°C sau 6 giờ, nguyên nhân do nhóm nitro ($\text{-NO}_2$) rút electron rất mạnh làm giảm mật độ điện tử của phân tử acid.

7. Phản ứng với gyrophoric acid: Cô lập được hợp chất Pm.GXR1.

   • Phổ NMR của Pm.GXR1 tương đồng với dữ liệu của parmosidone D, ngoại trừ sự thay thế nhóm carboxyl ester tại vị trí C-1'' bằng một proton thơm H-1''. Cơ chế phản ứng đề xuất gồm hai giai đoạn: gyrophoric acid dưới tác dụng nhiệt và xúc tác Lewis acid bị decarboxyl hóa giải phóng orcinol (giai đoạn i); orcinol tạo thành sau đó tham gia phản ứng alkyl hóa Friedel-Crafts vào vị trí methylene của parmosidone A (giai đoạn ii).

Hiệu suất cô lập tinh khiết của các hợp chất qua sắc ký cột được ghi nhận trong văn bản:

• Pr.B2: 43,1%
• Pr.B1: 15,2%
• Pm.C2: 38,5%
• Pm.CM2: 32,4%
• Pr.C4M1: 21,6%
• Pr.C4M2: 18,2%
• Pm.C4M1: 14,5%
• Pr.Cα: 28,3%
• Pm.GXR1: 22,2%

Chương 4: Kết luận và đề xuất

Chương 4 đúc kết các phát hiện thực nghiệm và định hướng tiếp theo:

• Kết luận: Đã điều chế thành công các dẫn xuất ester của protocetraric acid với các acid đơn chức; phát hiện hiện tượng chuyển vị khung depsidone từ protocetraric acid (para-depsidone) thành parmosidone A (meta-depsidone) dưới xúc tác Lewis acid; tất cả sản phẩm đều được xác định cấu trúc bằng phổ NMR và là những hợp chất mới chưa từng công bố trước đây.
• Đề xuất: Tối ưu hóa hiệu suất phản ứng và ứng dụng phương pháp HPLC để xác định chính xác hiệu suất phản ứng định lượng; khảo sát phản ứng chuyển vị trên các depsidone tự nhiên khác như stictic acid, corynesidone; khảo sát phản ứng hoàn nguyên; tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học trên các sản phẩm tổng hợp được; mở rộng nghiên cứu tổng hợp thông qua chất trung gian ortho-quinone methide.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính kèm số liệu thực nghiệm

Khóa luận đã khảo sát toàn diện 7 hệ phản ứng bán tổng hợp và tách chiết tinh khiết thành công 9 dẫn xuất hóa học mới từ protocetraric acid. Các kết quả cụ thể gồm:

1. Xác định điều kiện phản ứng ester hóa trực tiếp trên nhóm alcol bậc một C-8' của protocetraric acid với benzoic acid (tạo Pr.B2 với hiệu suất cô lập 43,1%), trans-4-methoxycinnamic acid (tạo Pr.C4M1 với hiệu suất 21,6%) và (E)-α-methylcinnamic acid (tạo Pr.Cα với hiệu suất 28,3%).
2. Phát hiện và chứng minh quá trình chuyển vị bộ khung depsidone từ cấu trúc para-depsidone (protocetraric acid) sang meta-depsidone (parmosidone A) dưới tác dụng của xúc tác acid Lewis $\text{AlCl}_3$, dẫn đến việc cô lập các sản phẩm ester của parmosidone A gồm Pm.C2 (hiệu suất 38,5%), Pm.CM2 (hiệu suất 32,4%) và Pm.C4M1 (hiệu suất 14,5%).
3. Khám phá phản ứng đóng vòng tạo cấu trúc dị vòng pyranose Pr.C4M2 (hiệu suất 18,2%) thông qua cơ chế trung gian ortho-quinone methide kết hợp phản ứng cộng đóng vòng Diels-Alder nội phân tử.
4. Tổng hợp thành công dẫn xuất Pm.GXR1 (hiệu suất 22,2%) từ protocetraric acid và gyrophoric acid nhờ chuỗi phản ứng liên hoàn gồm decarboxyl hóa tạo orcinol và alkyl hóa Friedel-Crafts lên parmosidone A.

Đóng góp học thuật tự nêu của tác giả

• Khóa luận đóng góp dữ liệu thực nghiệm đầu tiên về phản ứng ester hóa của protocetraric acid sử dụng xúc tác $\text{AlCl}_3$ trong dung môi DMSO, góp phần giải quyết khoảng trống nghiên cứu do sự khan hiếm nguồn cung tự nhiên của hợp chất này.
• Phát hiện sự chuyển vị khung depsidone từ dạng para sang meta dưới tác dụng của Lewis acid, cung cấp một phương pháp hóa học mới để tiếp cận nhóm meta-depsidone hiếm gặp trong tự nhiên (như dẫn xuất của parmosidone A).
• Toàn bộ 9 hợp chất được cô lập và định danh cấu trúc bằng phổ nghiệm cộng hưởng từ hạt nhân 1D/2D NMR trong công trình này đều là các hợp chất mới.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

Dựa trên các nội dung được văn bản đề cập, nghiên cứu tồn tại một số hạn chế:

• Điều kiện tối ưu hóa phản ứng và cơ chế chi tiết của quá trình chuyển vị khung từ para-depsidone thành meta-depsidone vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ.
• Hiệu suất tổng hợp trong khóa luận mới chỉ dừng lại ở hiệu suất cô lập sản phẩm thô/tinh khiết sau sắc ký cột, chưa được phân tích và thẩm định định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Phản ứng với trans-4-nitrocinnamic acid hoàn toàn không xảy ra trong điều kiện khảo sát ($80^\circ\text{C}$, 6 giờ, xúc tác $\text{AlCl}_3$).
• Phản ứng với gyrophoric acid ngoài sản phẩm chính Pm.GXR1 vẫn còn nhiều sản phẩm phụ chưa được phân lập và khảo sát cấu trúc hoàn chỉnh.
• Khóa luận chưa thực hiện được các thử nghiệm sàng lọc hoạt tính sinh học thực tế (kháng vi sinh vật, độc tế bào ung thư) trên các dẫn xuất mới tổng hợp để kiểm chứng giả thuyết ban đầu.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tiến hành đo sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm xác định chính xác hiệu suất phản ứng và tối ưu hóa các thông số công nghệ (nhiệt độ, dung môi, tỷ lệ xúc tác).
• Mở rộng khảo sát hiện tượng chuyển vị khung sườn trên các hợp chất depsidone tự nhiên khác như stictic acid và corynesidone.
• Thực hiện phản ứng hoàn nguyên trên protocetraric acid và nghiên cứu sâu hơn chuỗi phản ứng thông qua chất trung gian ortho-quinone methide.
• Triển khai thử nghiệm hoạt tính sinh học thực nghiệm trên các dòng vi khuẩn, nấm và dòng tế bào ung thư đối với các hợp chất mới cô lập được.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên ngành hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các ngành Hóa học (Hóa hữu cơ, Hóa dược) và Dược học (Hóa hợp chất thiên nhiên):

• Tham khảo về kỹ thuật tổng hợp: Quy trình thực nghiệm phản ứng acyl hóa chọn lọc vị trí trên các hợp chất thiên nhiên đa chức có độ tan kém, phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng phân bố để loại bỏ triệt để dung môi DMSO, và hệ dung môi sắc ký cột pha thường giải ly hiệu quả cho nhóm depsidone ($n\text{-hexane} : \text{EtOAc} : \text{acetone} : \text{AcOH}$).
• Tham khảo về biện luận phổ NMR: Khóa luận cung cấp tập dữ liệu phổ chi tiết ($^1\text{H-NMR}$, $^{13}\text{C-NMR}$, HMBC, HSQC) của khung depsidone và meta-depsidone, đặc biệt là các tín hiệu dịch chuyển hóa học đặc trưng cho phép nhận biết sự chuyển dịch khung para-meta (độ dịch chuyển của nhóm methyl H-9' và nhóm oxymethylene H-8') và sự hình thành dị vòng pyran qua phản ứng Diels-Alder nội phân tử.
• Cung cấp cơ sở lý thuyết cho việc nghiên cứu biến đổi hóa học các hợp chất thứ cấp từ địa y Việt Nam.

Câu hỏi thường gặp

1. Vai trò của xúc tác Lewis acid $\text{AlCl}_3$ trong các phản ứng khảo sát là gì?

Xúc tác $\text{AlCl}_3$ đóng vai trò kép trong hệ phản ứng: vừa kích động nhóm carbonyl của carboxylic acid tạo tác nhân ái điện tử để thực hiện phản ứng ester hóa với nhóm hydroxymethyl C-8', vừa xúc tác cho quá trình cắt đứt liên kết ester nội phân tử của khung para-depsidone dẫn đến phản ứng chuyển vị tạo meta-depsidone (parmosidone A), đồng thời xúc tác cho phản ứng dehydrate tạo trung gian ortho-quinone methide và phản ứng decarboxyl hóa - alkyl hóa Friedel-Crafts.

2. Vì sao phản ứng với trans-cinnamic acid lại tạo thành dẫn xuất của parmosidone A thay vì ester trực tiếp của protocetraric acid?

Dưới tác dụng của xúc tác $\text{AlCl}_3$ và nhiệt độ cao (90–100°C), khung protocetraric acid (para-depsidone) bị thủy phân liên kết ester depsidone và đóng vòng thế ái nhân nội phân tử vào vị trí C-2 của nhân A (nhờ hai nhóm rút electron mạnh là -CHO và -COOR hỗ trợ), chuyển thành cấu trúc meta-depsidone bền hơn là parmosidone A. Sau đó, trans-cinnamic acid mới tham gia ester hóa lên nhóm hydroxymethyl của parmosidone A tạo thành Pm.C2.

3. Cấu trúc dị vòng đặc biệt của hợp chất Pr.C4M2 được tạo thành qua cơ chế nào?

Hợp chất Pr.C4M2 được hình thành qua phản ứng cộng đóng vòng Diels-Alder nội phân tử. Dưới xúc tác $\text{AlCl}3$, protocetraric acid chuyển hóa nhanh tại vị trí C-8' và nhóm 2'-OH trên nhân B thành chất trung gian ortho-quinone methide. Tiếp theo, trung gian này phản ứng trực tiếp với nối đôi olefin $C{7''}=C_{8''}$ của trans-4-methoxycinnamic acid, làm bão hòa liên kết đôi và tạo nên vòng 6 cạnh pyranose ngưng tụ giữa nhân thơm B và C.

4. Tại sao phản ứng giữa protocetraric acid và trans-4-nitrocinnamic acid không diễn ra?

Trong phản ứng số 6 ở Bảng 2.1, khi đun ở 80°C trong 6 giờ với xúc tác $\text{AlCl}_3$, hệ phản ứng hoàn toàn không tạo thành sản phẩm. Nguyên nhân là do nhóm nitro ($\text{-NO}_2$) gắn ở vị trí para của vòng benzene có hiệu ứng cảm ứng âm và liên hợp âm rất mạnh, làm giảm mạnh mật độ điện tử của toàn phân tử acid và làm suy giảm hoạt tính phản ứng trong điều kiện khảo sát.

5. Hợp chất Pm.GXR1 được tạo thành từ gyrophoric acid và protocetraric acid theo chuỗi biến đổi nào?

Quá trình tạo thành Pm.GXR1 diễn ra qua hai phản ứng kế tiếp: đầu tiên, gyrophoric acid dưới ảnh hưởng của nhiệt độ và xúc tác $\text{AlCl}_3$ bị phản ứng decarboxyl hóa làm mất nhóm carboxyl ester tạo thành phân tử orcinol; song song đó, protocetraric acid chuyển vị thành parmosidone A; cuối cùng, orcinol đóng vai trò tác nhân ái nhân tham gia phản ứng alkyl hóa Friedel-Crafts với parmosidone A để hình thành cấu trúc hoàn chỉnh của Pm.GXR1.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã nghiên cứu thực nghiệm thành công phản ứng ester hóa và biến đổi hóa học trên chất nền tự nhiên protocetraric acid phân lập từ địa y Parmotrema sp. Nghiên cứu đã tổng hợp và cô lập được 9 dẫn xuất mới, đồng thời phát hiện hiện tượng chuyển vị cấu trúc từ para-depsidone sang meta-depsidone và các phản ứng đóng vòng dị vòng hóa phức tạp dưới xúc tác $\text{AlCl}_3$. Toàn bộ sản phẩm đều được xác định cấu trúc rõ ràng thông qua hệ thống phổ nghiệm 1D và 2D NMR, tạo tiền đề khoa học quan trọng cho các nghiên cứu tối ưu hóa quy trình bán tổng hợp và thử nghiệm hoạt tính sinh học tiếp theo trên nhóm hợp chất depsidone.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.Định nghĩa Depsidone là những dẫn xuất phenol, với khung sườn gồm hai phân tử phenol được liên kết nhau qua một nối ester và một nối ether. Thí dụ một vài hợp chất depsidone như stictic acid, physodic acid, corynedidone. Corynesidone Physodic acid Stictic acid Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của depsidone cho thấy depsidone từ địa y có khả năng ngăn tia UV, tiêu diệt hàng loạt tế bào ung thư ác tính.[20] Một số depsidone có hoạt tính chống oxy hóa.[7,9] Những nghiên cứu mới cho thấy một số depsidone có khả năng ngăn cản quá trình phân bào, cùng với các hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và ức chế enzyme estrogen.Phản ứng ester hóa trên depsidone Một số hợp chất depsidone có nhóm chức carboxylic acid. Nhóm chức này có thể được biến đổi thành nhóm chức ester, thực hiện bằng cách cho tác dụng với các tác chất thân hạch như diazomethane trong dung môi ether hoặc iodomethane trong môi trường kiềm.

Culberson[6] thực hiện phản ứng tạo các dẫn xuất ester của physodic acid và 4-O-methylphysodic acid với tác chất diazomethane trong dung môi ether ở nhiệt độ 0–5°C. 2 C5H11 C5H11 O C O C CH2 O CH2 O O O CH2N2/ ether HO O OH HO O OH Làm lạnh C5H11 O C5H11 O HO H3CO Physodic acid (Hiệu suất 63%) C5H11 C5H11 O C O C CH2 O CH2 O O CH2N2/ ether O H3CO O OH Làm lạnh H3CO O OH C5H11 O C5H11 O HO H3CO 4-O-methylphysodic acid (Hiệu suất 70%) Đến năm 1975, Teruhisa Hirayama và các cộng sự người Nhật[10] đã điều chế dẫn xuất methyl ester của triacetylvittatolic acid cũng sử dụng tác chất diazomethane trong dung môi ether. OAc OAc CH2 CH C3H7 CH2 CH C3H7 O C O C CH2 O CH2 O O CH2N2/ ether O AcO O OAc Làm lạnh AcO O OAc C5H11 O C5H11 O H3CO HO Triacetylvittatolic acid (Bài báo không cho biết hiệu suất) Đến năm 1975, Teruhisa Hirayama và các cộng sự người Nhật[10] đã điều chế dẫn xuất methyl ester của triacetylvittatolic acid cũng sử dụng tác chất diazomethane trong dung môi ether. Năm 2009, Porntep Chomcheon và các cộng sự[5] đã điều chế dẫn xuất methyl ester của corynesidone B, sử dụng tác chất là iodomethane.

3 O O CH3I H3CO O CH3 HO O CH3 DMF K2CO3 O O O OCH3 O OH Khuấy từ ở nhiệt OCH3 OH độ phòng OCH3 OH Corynesidone B (Hiệu suất 75%) 1. PROTOCETRARIC ACID VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦANÓ 1.Tổng quát Protocetraric acid, với tên khoa học 4-formyl-3,8-dihydroxy-9-hydroxymethyl- 1,6-dimethyl-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-7-carboxylic acid, là chất bột màu trắng đục, tan kém trong methanol, acetone, chloroform, …, tan nhiều hơn trong dimethyl sulfoxide. Protocetraric acid được tìm thấy nhiều trong nhiều loài địa y khác nhau như địa y Parmotrema (Parmotrema dilatatum, Parmotrema lichenxanthonicum, Parmotrema sphaerospora[11],…), Parmelia (Parmelia caperata, Parmelia conspresa[17],…), Ramalina (Ramalina sp.Hoạt tính sinh học của protocetraric acid Protocetraric acid đã được thử nghiệm hoạt tính sinh học trên nhiều loại nấm, vi khuẩn, cũng như hoạt tính kháng nhiều loại ung thư khác nhau (Bảng 1.1), dưới liều MIC (μg/mL). Hợp chất có liều MIC càng nhỏ, hợp chất có hoạt tính càng mạnh.

Kết quả Bảng 1.1 cho thấy protocetraric acid có khả năng kháng 6 dòng nấm (Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Cryprococcus var. difluens, Fusarium oxysporum, Mucor mucedo và Paecilomyces variotii), 6 dòng vi khuẩn khác nhau (B. aureus) và không ức chế được 3 dòng tế bào ung thư (Ehrlich carcinoma, Ehrlich sarcoma và Yoshina sarcoma). 4 Fumarprotocetraric acid, một hợp chất được cô lập nhiều từ địa y, đồng thời cũng là dẫn xuất 9’-monofumarylprotocetraric acid, đã được kiểm tra hoạt tính sinh học trên nhiều dòng vi khuẩn, nấm khác nhau.[16] Kết quả được trình bày trong Bảng 1.1 cho thấy fumarprotocetraric acid có khả năng kháng 7 chủng vi khuẩn (Aeromonas hydrophila, Bacillus cereaus, Bacillus subtilis, Listeriamono cytogenes, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus và Streptococcus faecalis) và 2 dòng nấm (Candida albicans và Candida glabrata).

Trong khi đó, protocetraric acid không có khả năng ức chế dòng vi khuẩn Streptococcus faecalis. Điều này cho thấy các dẫn xuất của protocetraric acid có tiềm năng hoạt tính sinh học cao. Do hợp chất này hiện diện với số lượng nhiều trong địa y Parmotrema sp. nên chúng tôi tiến hành điều chế các dẫn xuất của protocetraric acid với hy vọng tạo được nhiều dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao.

Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế một số chủng nấm, chủng vi khuẩn, dòng tế bào ung thư của protocetraric acid và fumarprotocetraric acid. Tên chủng nấm, chủng vi khuẩn, dòng tế Protocetraric acid Fumarprotocetraric acid MIC (μg/mL) MIC (μg/mL) bào ung thư Nấm[17,19,23] Aspergillus flavus Không có hoạt tính * Aspergillus fumigatus 500 * Candida albicans 18.1 * Fusariumoxysporum 500 * Mucor mucedo 500 * Paecilomyces variotii 500 * Penicillium purpurescens Không có hoạt tính * Penicillium verrucosum Không có hoạt tính * Trichoderma harsianum Không có hoạt tính * Vi khuẩn[11,19,23] Aeromonas hydrophila * 150.6 Esherichia coli Không có hoạt tính * Klebsiella pneumoniae Không có hoạt tính * Listeria monocytogenes * 4.6 Micrococcus luteus Không có hoạt tính * Mycobacterium tuberculosis 125.5 Streptococcus faecalis Không có hoạt tính 150.0 Bệnh ung thư[16] Ehrlich carcinoma Không có hoạt tính * Ehrlich sarcoma Không có hoạt tính * Yoshida sarcoma Không có hoạt tính * (*) Không thử nghiệm 6 Năm 2004, Carine Bezivin và các đồng sự đã cô lập dẫn xuất 9’-O- methylprotocetraric acid từ địa y Cladonia convoluta và đã kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất này với 6 dòng tế bào ung thư khác nhau,[3] kết quả được trình bày ở liều IC 50 (μg/mL) (Bảng 1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư của 9’-O- methylprotocetraric acid. Dòng tế bào ung thư IC50 Hoạt tính (μg/mL) Murine lympholytic leukaemia >100 Không có hoạt tính Murine Lewis lung carcinoma >100 Không có hoạt tính Human chronic myelogenous leukaemia >100 Không có hoạt tính Human brain metastasis of a prostate carcinoma >100 Không có hoạt tính Human breast adenocarcinoma >100 Không có hoạt tính Human glioblastoma >100 Không có hoạt tính 7 PhCH2I K2CO3 CH3COCH3 Khuấy từ, kết hợp thổi khí N2 (CH3)2SO4 K2CO3 CH3COCH3 Ethyl acetate HCl Pd/C Khuấy từ kết hợp thổi khí H2 1/ Hexamethylenetetramine CF3COOH Pd/C Khuấy từ kết hợp đun nóng 2/ Đuổi dung môi 3/ H2O Khuấy từ 4/ Đun nóng trong K2CO3 PhCH2I N,N-dimethylformamide Khuấy từ kết hợp thổi khí N2 1/ Pyridine 2/ (NCH4)2MnO4 3/ Khuấy từ ở nhiệt độ phòng 1/ 1,3-bisbenzyloxy-2,5- dimethylbenzene pha trong CH2Cl2 2/ CF3COOH 3/ Khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ Ethyl acetate HCl Pd/C Khuấy từ kết thổi khí H2 1/ Thêm vào dung dịch K2CO3 2/ Thêm vào dung dịch K3[Fe(CN)6] 3/ Khuấy từ trong Sơ đồ 1.Tổng hợp protocetraric acid[21] 8 CH3I K2CO3 N,N-dimethylformamide 1/ CCl4 2/ Đun hoàn lưu kết hợp nhỏ từ từ Br2 3/ Tiếp tục đun hoàn lưu 4/ Sản phẩm thô đem hòa tan trong dung dịch dioxan 5/ Đun hoàn lưu 1/ CH2Cl2 2/ BCl3 3/ Khuấy từ trong 4/ Sản phẩm thô đem hòa tan trong dung dịch dioxan 5/ Đun hoàn lưu 1/ CH3C6H6SO3H.H2O 2,2-dimethylpropane N,N-dimethylformamide 2/ Để yên trong 70 giờ 3/ Thêm 2,2-dimethylpropane 4/ Sản phẩm thô đem hòa tan trong CH2Cl2 5/ Cho vào một hỗn hợp pyridinium chlorochromate và CH3COONa pha trong CH2Cl2 6/ Khuấy từ CH3COOH 50% Khuấy từ ở 50°C 1/ LiI Hexamethylphosphoric triamide 2/ Khuấy từ kết hợp thổi khí N2 ở 80°C Sơ đồ 1.Tổng hợp protocetraric acid[21] (tiếp theo) 9 1.Các phản ứng đã nghiên cứu trên protocetraric acid 1.

Phản ứng tổng hợp protocetraric acid Năm 1981, Tony Sala và Melvyn V. Sargent[21] đã đề nghị quy trình tổng hợp protocetraric acid đi từ methyl 2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate qua 13 giai đoạn (Sơ đồ 1. Phản ứng điều chế các dẫn xuất của protocetraric acid a/ Năm 1933, Yasuhiko Asahina và Tyo-Taro Tukamo[2] đã thực hiện phản ứng hydrogen hóa xúc tác Pd/C để điều chế hydroprotocetraric acid từ protocetraric acid. Sản phẩm thu được đều được đo nhiệt độ nóng chảy và xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp phân tích nguyên tố và các phản ứng định tính nhóm định chức.

CH3COOH H2, Pd/C Protocetraric acid Hydroprotocetraric acid (Hiệu suất 87 %) b/ Năm 1952, Josef Klosa[12] đã điều chế một số dẫn xuất phenylhydrazone, thiosermicarbazone, benzimidazole của protocetraric acid. Sản phẩm thu được đều được đo nhiệt độ nóng chảy và xác định cấu trúc hóa học bằng phương pháp phân tích nguyên tố và các phản ứng định tính nhóm định chức. Các dẫn xuất phenylhydrazone của protocetraric acid được điều chế bằng cách đun hoàn lưu protocetraric acid (hoặc các dẫn xuất 9’-O-alkylprotocetraric acid) với phenylhydrazine trong dung môi benzene trong 6 giờ. 10 C6H6 C6H6-NH-NH2 Đun hoàn lưu (Bài báo không nêu hiệu suất) −R= −H −R = −H −(CH2)3CH3 −(CH2)3CH3 −CH2CH(CH3)2 −CH2CH(CH3)2 −CH2CH2CH(CH3)2 −CH2CH2CH(CH3)2 Các dẫn xuất thiosemicarbazone được điều chế bằng cách đun hoàn lưu protocetraric acid (hoặc các dẫn xuất 9’-O-alkylprotocetraric acid), thiosemicarbazide trong dung môi nitrobenzene trong 3 giờ.

Đun nhẹ (Bài báo không nêu hiệu suất) −R= −H −R = −H −CH(CH3)2 −CH(CH3)2 −(CH2)3CH3 −(CH2)3CH3 −CH2CH(CH3)2 −CH2CH(CH3)2 −CH2CH2CH(CH3)2 −CH2CH2CH(CH3)2 Các dẫn xuất benzimidazole cũng được Josef Klosa[12] điều chế bằng cách đun protocetraric acid với tác chất o-aminoaniline. o-C6H4(NH2)2 C6H5NO2 Đun hoàn lưu Protocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) 11 o-C6H4(NH2)2 CH3COOH Đun hoàn lưu Protocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) o-C6H4(NH2)2 EtOH C6H5NO2 Đun hoàn lưu Protocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) c/ Josef Klosa[12] đã điều chế dẫn xuất ester hóa trên nhóm chức alcol nhất cấp của protocetraric acid là dẫn xuất monopropionyl hóa. Keogh[15] tiếp tục điều chế dẫn xuất monomalonyl hóa Propionic acid Đun sôi Protocetraric acid 9’-Monopropionylprotocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) Malonic acid Dioxane Khuấy từ Protocetraric acid 9’-Monomalonylprotocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) 12 d/ Phản ứng ether hóa trên nhóm chức alcol nhất cấp đã được nhóm Yasuhiko Asahina và Tyo-Taro Tukamata,[2] Yasuhiko Asahina và Yaitiro Tanase,[1] Josef Klosa[12] nghiên cứu. Năm 1933, Yasuhiko Asahina và Tyo-Taro Tukamata[2] đã điều chế hai dẫn xuất methyl và ethyl ether của protocetraric acid bằng cách đun hoàn lưu với alcol tương ứng.

Methanol ` Đun nhẹ Protocetraric acid 9’-O-Methylprotocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) Ethanol Đun nhẹ Protocetraric acid 9’-O-Ethylprotocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) Năm 1934, Yasuhiko Asahina và Yaitiro Tanase[1] tiếp tục điều chế 3 dẫn xuất ether mới của protocetraric acid là dẫn xuất n-propyl, n-butyl và benzyl ether. ROH Đun hoàn lưu Protocetraric acid 9’-O-Alkylprotocetraric acid −R= −CH2CH2CH3 Hiệu suất 81% −CH2(CH2)2CH3 Hiệu suất 79 % −CH2C6H6 (Bài báo không nêu hiệusuất) 13 Năm 1952, Josef Klosa[12] đã thực hiện các phản ứng ether hóa protocetraric acid với hai alcol chi phương đơn chức là như isopropanol và isobutanol. CH3CH(OH)CH3 Đun hoàn lưu Protocetraric acid 9’-O-Isopropylprotocetraric acid (Hiệu suất 55 %) CH3CH(CH3)CH2CH2OH Đun hoàn lưu trong Protocetraric acid 9’-Isobutylprotocetraric acid (Bài báo không nêu hiệu suất) Năm 2014, Trần Thị Quỳnh Hoa[22] đã tiến hành điều chế một số dẫn xuất ether của protocetraric acid với một vài alcol chi phương. ROH DMSO Chỉnh pH bằng CH3COOH Đun hoàn lưu và khuấy từ ở 115 °C trong 3 giờ Protocetraric acid 9-O-Alkylprotocetraric acid Hiệu suất (Xác định bằng HPLC) Đề tài cũng đã bước đầu thực hiện điều chế dẫn xuất ether hóa protocetraric acid theo phản ứng Williamson với tác chất iodoethane.