Khảo sát các phương pháp trích ly polyphenol từ hạt bơ (Persea Americana Mill)

Khóa luận: Khảo sát các phương pháp trích ly polyphenol từ hạt bơ tại ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM

• Tác giả: Phạm Thị Ngọc Lợi
• Người hướng dẫn: TS. Phan Thị Anh Đào
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm
• Đề tài: Khảo sát các phương pháp trích ly polyphenol từ hạt bơ (Persea Americana Mill)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Tóm tắt

I. Tổng quan về quá trình trích ly polyphenol từ hạt bơ

Hạt bơ chiếm khoảng 13 đến 18 phần trăm tổng khối lượng quả. Phần lớn phụ phẩm này thường bị loại bỏ sau chế biến. Hành động đó gây lãng phí nguồn sinh khối dồi dào. Nghiên cứu khoa học xác nhận hạt bơ chứa hàm lượng phenolic phong phú. Nhóm hợp chất này sở hữu khả năng dập tắt các gốc tự do mạnh mẽ. Việc trích ly polyphenol từ hạt bơ mang lại nguồn nguyên liệu dược liệu tiềm năng. Hoạt chất sinh học này giúp ngăn ngừa tổn thương tế bào do stress oxy hóa. Quá trình thu hồi polyphenol tận dụng tối đa phế phụ phẩm nông nghiệp. Hạt bơ Persea americana Mill có nhiều dẫn xuất quý như catechin và epicatechin. Sự hiện diện của các hợp chất này nâng cao giá trị thương phẩm cho cây bơ. Kỹ thuật chiết xuất phù hợp giúp bảo toàn cấu trúc nhạy cảm của polyphenol. Tỷ lệ thu hồi phụ thuộc lớn vào bản chất dung môi và nhiệt độ gia nhiệt. Tận thu hạt bơ tạo tiền đề cho phát triển kinh tế tuần hoàn bền vững trong ngành thực phẩm.

1.1. Giá trị sinh học của hợp chất polyphenol

Polyphenol là chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng ở thực vật. Các phân tử này bảo vệ tế bào khỏi tác nhân oxy hóa độc hại. Hạt bơ chứa nhóm flavonoid, tannin và axit phenolic dồi dào. Năng lực khử của các chất này vượt trội so với nhiều loại quả khác. Hợp chất polyphenol kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây hại. Hoạt tính kháng viêm của dịch chiết hạt bơ cũng đã được ghi nhận. Việc ứng dụng polyphenol giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch mạn tính. Hoạt chất này còn hạn chế quá trình peroxy hóa lipid trong thực phẩm. Nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên này hoàn toàn an toàn cho người dùng.

1.2. Nguồn nguyên liệu phụ phẩm hạt bơ tiềm năng

Ngành công nghiệp chế biến bơ thải ra hàng ngàn tấn hạt mỗi năm. Lượng phụ phẩm này chủ yếu bị chôn lấp hoặc thải bỏ ngoài tự nhiên. Quá trình phân hủy tự do gây ô nhiễm môi trường đất và nguồn nước. Thành phần hạt bơ giàu tinh bột, chất xơ và khoáng chất có ích. Đặc biệt, nồng độ polyphenol trong hạt cao gấp nhiều lần phần thịt quả. Khai thác hạt bơ biến rác thải thành nguyên liệu đầu vào có giá trị kinh tế. Doanh nghiệp thực phẩm có thể tiết kiệm chi phí xử lý chất thải hữu cơ. Dự án nghiên cứu tại ĐH SPKT TP.HCM mở ra hướng đi đầy tiềm năng cho phụ phẩm này.

II. Thực trạng và thách thức khi trích ly polyphenol từ hạt bơ

Việc trích ly polyphenol từ hạt bơ đối mặt với nhiều rào cản kỹ thuật. Màng tế bào hạt bơ có cấu trúc dày và chứa hàm lượng tinh bột cao. Đặc điểm này cản trở sự khuếch tán của dung môi vào sâu bên trong mô thực vật. Hơn nữa, hạt bơ tươi chứa nhiều chất kháng dưỡng như tannin liên kết và phytic acid. Các chất kháng dưỡng làm giảm hoạt tính sinh học và gây vị đắng chát khó chịu. Polyphenol tự nhiên lại rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường. Ánh sáng, nhiệt độ cao và oxy dễ dàng phá hủy vòng benzen của hợp chất. Quá trình xử lý nhiệt không kiểm soát sẽ gây phân hủy hoạt chất nhanh chóng. Chọn lựa dung môi cũng đặt ra bài toán khó về độ an toàn thực phẩm. Dung môi hữu cơ độc hại như methanol hay chloroform không phù hợp cho sản phẩm tiêu dùng. Nồng độ dung môi ethanol cần đạt mức cân bằng tối ưu để hòa tan tốt phenolic mà không kéo theo tạp chất. Nghiên cứu thực nghiệm đòi hỏi quy trình xử lý nguyên liệu bài bản trước khi chiết.

2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố kháng dưỡng trong hạt

Chất kháng dưỡng tồn tại tự nhiên nhằm bảo vệ hạt giống khỏi sâu bệnh. Hạt bơ chứa hàm lượng tannin ngưng tụ và saponin tương đối cao. Nhóm chất này tạo phức bền với protein và cản trở hấp thu khoáng chất. Trong quá trình trích ly, chất kháng dưỡng cản trở phép đo chuẩn tổng hàm lượng polyphenol. Sự xuất hiện của chúng làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm cuối. Việc loại bỏ kháng dưỡng trước khi trích ly là bước tiền xử lý bắt buộc. Kỹ thuật ngâm rửa và gia nhiệt sơ bộ giúp bẻ gãy liên kết phức tạp. Thao tác này giải phóng hoàn toàn polyphenol tự do ra khỏi cấu trúc mạng thực vật.

2.2. Sự suy giảm hoạt tính do tác nhân nhiệt độ

Các hợp chất phenolic mang cấu trúc đa vòng kém bền nhiệt. Gia nhiệt kéo dài khiến các liên kết đôi và nhóm hydroxyl bị oxy hóa mạnh. Khi nhiệt độ vượt quá 70 độ C, nhiều hợp chất flavonoid bị phân hủy hoàn toàn. Năng lực khử gốc tự do DPPH sụt giảm rõ rệt sau quá trình đun sôi. Ngoài ra, nhiệt độ cao làm biến tính protein nội sinh và giải phóng tạp chất không mong muốn. Tạp chất làm dịch chiết bị đục và khó tinh sạch trong các bước tiếp theo. Kiểm soát nhiệt độ trích ly là yếu tố sống còn để giữ nguyên hoạt tính. Quá trình cô đặc dịch chiết cũng cần thực hiện dưới áp suất giảm.

III. Các phương pháp trích ly polyphenol từ hạt bơ tối ưu nhất

Đồ án tốt nghiệp tại ĐH SPKT TP.HCM đã tiến hành khảo sát đa dạng phương pháp trích ly. Các phương pháp gồm ngâm dầm, ngấm kiệt, trích nóng và trích Soxhlet cổ điển. Hệ dung môi ethanol kết hợp nước ở tỷ lệ 80:20 mang lại hiệu quả hòa tan cao nhất. Tỷ lệ này tạo độ phân cực thích hợp cho đa số phân tử phenolic. Phương pháp ngâm dầm đơn giản nhưng đòi hỏi thời gian kéo dài nhiều ngày. Trích ngấm kiệt cho độ tinh khiết tốt nhờ dòng dung môi liên tục làm mới. Phương pháp trích Soxhlet đạt hiệu suất thu hồi chất khô cao vượt trội. Nhiệt độ hồi lưu liên tục giúp hòa tan triệt để hợp chất trong bột hạt bơ. Tuy nhiên, trích ly hỗ trợ vi sóng MAE mới là giải pháp hiện đại đầy hứa hẹn. Năng lượng điện trường làm nóng phân tử nước bên trong tế bào tức thì. Áp suất nội bào tăng vọt làm vỡ thành tế bào nhanh chóng. Thời gian chiết xuất rút ngắn chỉ còn vài phút mà vẫn bảo toàn hoạt tính sinh học.

3.1. Kỹ thuật trích Soxhlet và trích nóng truyền thống

Trích Soxhlet là phương pháp chiết liên tục mẫu rắn bằng dung môi hồi lưu. Dung môi bay hơi, ngưng tụ và nhỏ giọt đều đặn qua túi đựng mẫu bột hạt bơ. Chu trình xiphong lặp lại liên tục giúp chiết kiệt hoạt chất trong nguyên liệu. Phương pháp này đạt hiệu suất tổng chất khô cao nhất trong các kỹ thuật truyền thống. Ngược lại, trích nóng trực tiếp khuấy đảo mẫu trong bình cầu gia nhiệt. Trích nóng rút ngắn thời gian chiết nhưng dễ làm cháy cục bộ mẫu hạt. Cả hai phương pháp đều tiêu tốn năng lượng nhiệt và đòi hỏi thiết bị làm lạnh liên tục. Dịch chiết thu được cần trải qua bước lọc cẩn thận để loại bỏ bã mịn.

3.2. Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng hiện đại

Kỹ thuật trích ly hỗ trợ vi sóng MAE ứng dụng sóng điện từ tần số cao. Sóng vi sóng tương tác trực tiếp với các phân tử phân cực như nước và ethanol. Cơ chế quay lưỡng cực và dẫn truyền ion tạo nhiệt nhanh trong lòng mẫu. Nhiệt độ tăng đột ngột làm tăng áp suất bên trong màng tế bào hạt bơ. Thành tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, giải phóng tức thì các hợp chất polyphenol. Kỹ thuật MAE tiết kiệm lượng lớn dung môi so với ngâm dầm truyền thống. Thời gian xử lý mẫu giảm từ hàng giờ xuống chỉ còn vài phút ngắn ngủi. Đây là giải pháp công nghệ xanh mang lại hiệu quả kinh tế rất lớn.

IV. Tiềm năng ứng dụng dịch trích ly polyphenol từ hạt bơ

Nghiên cứu của ĐH SPKT TP.HCM khẳng định giá trị thực tiễn to lớn của hạt bơ. Dịch chiết giàu polyphenol có thể thay thế các chất chống oxy hóa tổng hợp vốn tiềm ẩn nguy cơ sức khỏe. Ngành công nghiệp thực phẩm có thể sử dụng cao hạt bơ làm phụ gia bảo quản dầu mỡ và thịt tươi. Khả năng ức chế gốc tự do DPPH cao giúp kéo dài hạn sử dụng mà không làm biến đổi hương vị món ăn. Trong lĩnh vực mỹ phẩm, dịch chiết đóng vai trò như thành phần chống lão hóa và làm sáng da tự nhiên. Các sản phẩm kem dưỡng và serum chứa chiết xuất hạt bơ có tác dụng làm dịu tổn thương do tia cực tím. Ngành dược phẩm cũng hướng đến phát triển các viên nang thực phẩm chức năng hỗ trợ tim mạch và ổn định đường huyết. Việc thương mại hóa quy trình trích ly mở ra chuỗi cung ứng bền vững cho nông sản Việt Nam. Phế phẩm nông nghiệp chuyển hóa thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe có giá trị gia tăng cao.

4.1. Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm và mỹ phẩm

Polyphenol từ hạt bơ là chất ức chế peroxy hóa lipid tự nhiên cực kỳ an toàn. Hoạt chất này ngăn ngừa quá trình ôi thiu ở thực phẩm nhiều chất béo chưa bão hòa. Nhà sản xuất có thể dùng cao bơ thay thế BHA và BHT nhân tạo. Trong mỹ phẩm, dịch chiết giúp vô hiệu hóa các phân tử gốc tự do gây nhăn da. Đặc tính kháng khuẩn nhẹ bảo vệ các công thức mỹ phẩm khỏi vi sinh vật hư hỏng. Dịch trích ly hạt bơ mang lại nguồn nguyên liệu xanh cho các nhãn hàng hữu cơ. Xu hướng làm đẹp từ thành phần thiên nhiên ngày càng ưa chuộng các hoạt chất này.

4.2. Định hướng phát triển kinh tế tuần hoàn bền vững

Tái chế hạt bơ là bước đi quan trọng trong việc khép kín vòng đời nông sản. Mô hình kinh tế tuần hoàn giúp giảm thiểu phát thải rác thải rắn ra môi trường. Các vùng trồng bơ lớn tại Tây Nguyên sẽ có thêm nguồn thu nhập phụ trợ đáng kể. Doanh nghiệp chế biến tinh dầu bơ có thể tận dụng triệt để hạt làm sản phẩm phụ. Việc chuyển giao quy trình trích ly công nghiệp thúc đẩy liên kết giữa đại học và doanh nghiệp. Sự hợp tác này biến kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm thành giá trị thương mại cụ thể. Nền nông nghiệp xanh Việt Nam ngày càng hoàn thiện nhờ những giải pháp tái tạo này.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong ngành công nghiệp chế biến nông sản tại Việt Nam, cây bơ (Persea americana Mill) là loại cây trồng cận nhiệt đới có giá trị kinh tế cao, phân bố tập trung chủ yếu tại các tỉnh Tây Nguyên (đặc biệt là Đắk Lắk), Lâm Đồng, Đồng Nai và một số tỉnh miền Tây Nam Bộ. Theo số liệu khảo sát từ Chương trình phát triển MPI-GTZ SME phối hợp cùng Sở Khoa học và Công nghệ Đắk Lắk (2006), sản lượng bơ của tỉnh Đắk Lắk và các địa phương lân cận ước đạt 337 tấn/ngày, tương đương khoảng 40.000 tấn mỗi vụ thu hoạch chính. Trong cơ cấu sản xuất, giống bơ Sáp chiếm ưu thế với khoảng 60% diện tích canh tác, bên cạnh các giống bơ Mỡ, bơ Nước và các giống ngoại nhập như Hass, Booth, 304. Quá trình chế biến quả bơ chủ yếu tập trung khai thác phần thịt quả để tiêu dùng trực tiếp hoặc trích ly tinh dầu bơ. Phần phụ phẩm gồm vỏ và đặc biệt là hạt bơ—chiếm từ 13% đến 18% tổng khối lượng quả—thường bị thải bỏ trực tiếp ra môi trường tự nhiên, gây ra áp lực đáng kể về mặt sinh thái và quản lý chất thải rắn công nghiệp.

Về mặt hóa học thực phẩm, các nghiên cứu quốc tế đã chứng minh hạt bơ không đơn thuần là phế phụ phẩm mà chứa hàm lượng hợp chất chuyển hóa thứ cấp rất dồi dào, đặc biệt là các hợp chất polyphenol sở hữu hoạt tính chống oxy hóa cao, thậm chí vượt trội hơn so với phần thịt quả. Tuy nhiên, hạt bơ tươi cũng chứa một lượng đáng kể các thành phần kháng dưỡng (anti-nutritional factors) như tannin, acid phytic và oxalate. Những chất này có khả năng tạo phức không tan với protein hoặc khoáng chất (như canxi hình thành tinh thể canxi-oxalat, sắt vô cơ), gây ức chế enzyme tiêu hóa và cản trở sự hấp thu dinh dưỡng. Để tận dụng nguồn hoạt chất sinh học này phục vụ chế biến thực phẩm và dược liệu, việc lựa chọn phương pháp trích ly thích hợp kết hợp với việc kiểm soát yếu tố kháng dưỡng là yêu cầu kỹ thuật then chốt.

Khóa luận tốt nghiệp tập trung giải quyết các mục tiêu và 6 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản giao đề tài:

1. Tổng quan về polyphenol, phân loại các hợp chất polyphenol, cơ chế hoạt động chống oxy hóa của polyphenol, và một số phương pháp trích ly polyphenol.
2. Tổng quan về hạt bơ (Persea americana Mill), thành phần dinh dưỡng, thành phần kháng dưỡng và thành phần hóa học có trong hạt bơ.
3. Điều chế các mẫu cao bơ, tiến hành khảo sát các phương pháp trích ly bao gồm: trích ngâm dầm, trích ngấm kiệt, trích nóng và trích Soxhlet với hệ dung môi ethanol : nước (tỉ lệ 80 : 20 v/v) trên hai loại mẫu nguyên liệu: loại kháng dưỡng và không loại kháng dưỡng.
4. Xác định các chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm: độ ẩm nguyên liệu, hiệu suất của quá trình trích ly.
5. Xác định tổng hàm lượng polyphenol và hoạt tính sinh học của hợp chất polyphenol có trong hạt bơ thông qua hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, xác định năng lực khử.
6. So sánh và đánh giá hoạt tính sinh học của từng mẫu được sản xuất bằng các phương pháp khác nhau, từ đó đưa ra phương pháp trích ly hiệu quả nhất để ứng dụng cho quá trình nghiên cứu tiếp theo.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Hạt bơ (Persea americana Mill) thu nhận từ quả bơ thương phẩm.
• Phạm vi không gian: Thu mua 20 kg hạt bơ có nguồn gốc từ tỉnh Đắk Lắk, Việt Nam. Toàn bộ các quá trình xử lý nguyên liệu, điều chế cao chiết và phân tích hóa lý được thực hiện tại các phòng thí nghiệm thuộc Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Nguyên liệu được thu nhận trong khoảng thời gian từ tháng 09/2018 đến tháng 10/2018; thời gian thực hiện nghiên cứu thực nghiệm từ ngày 01/09/2018 đến ngày 31/12/2018; hoàn thành khóa luận vào tháng 01/2019.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết của đề tài được xây dựng trên cơ sở hóa học các hợp chất tự nhiên và kỹ thuật trích ly hoạt chất sinh học:

• Phân loại polyphenol: Phân loại theo cấu trúc khung cacbon từ nhóm phenol đơn giản (monophenol, diphenol, triphenol) đến polyphenol monome gồm nhóm $C_6-C_1$ (acid phenolcarbonic), nhóm $C_6-C_3$ (acid cumaric, acid cafeic), nhóm $C_6-C_3-C_6$ (flavonoid: flavon, flavonol, flavanonol, dihydroflavonol, isoflavone, anthocyanidin, catechin) và polyphenol polymer (tanin, lignin, acid humic).
• Cơ chế chống oxy hóa: Khóa luận luận giải 3 cơ chế dập tắt gốc tự do của phân tử polyphenol ($ArOH$):
  • Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atomic Transfer – HAT): Phản ứng $ROO^\bullet + ArOH \rightarrow ROOH + ArO^\bullet$, phụ thuộc vào năng lượng phân ly liên kết (Bond Dissociation Enthalpy – BDE).
  • Cơ chế chuyển một electron chuyển proton (Single Electron Transfer - Proton Transfer – SET-PT): Quá trình gồm hai bước $ROO^\bullet + ArOH \rightarrow ROO^- + ArOH^{+\bullet} \rightarrow ROOH + ArO^\bullet$, phụ thuộc vào năng lượng ion hóa (Ionization Energy – IE) và năng lượng phân ly proton (Proton Dissociation Enthalpy – PDE).
  • Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer – SPLET): Diễn ra theo chuỗi phân ly proton trước khi chuyển electron ($ArOH \rightarrow ArO^- + H^+$, sau đó $ArO^- + RO_2^\bullet \rightarrow RO_2^- + ArO^\bullet$), được quyết định bởi ái lực proton (Proton Affinity – PA) và năng lượng chuyển electron (Electron Transfer Enthalpy – ETE).
• Nguyên lý các phương pháp trích ly: Tổng quan 4 kỹ thuật cổ điển áp dụng trong thực nghiệm (trích ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, trích ngấm kiệt liên tục ngược dòng, trích nóng đun hồi lưu ở nhiệt độ sôi dung môi, trích Soxhlet tuần hoàn dung môi) cùng hai kỹ thuật hiện đại mở rộng (trích ly lỏng siêu tới hạn - SFE và trích ly có hỗ trợ vi sóng - MAE).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm và phân tích định lượng:

• Chuẩn bị mẫu: Hạt bơ tươi được rửa sạch, cắt lát mỏng và chia làm 2 nhóm: nhóm A (loại kháng dưỡng bằng cách ngâm ngập trong nước 24 giờ ở nhiệt độ phòng $25^\circ\text{C}$ nhằm khuếch tán các chất kháng dưỡng tan trong nước) và nhóm B (không loại kháng dưỡng, không qua ngâm nước). Cả hai nhóm được sấy khô đối lưu ở $70^\circ\text{C}$, nghiền thành bột mịn bằng máy xay chuyên dụng và rây qua cỡ rây 80 mesh.
• Quy trình trích ly: Sử dụng thống nhất hệ dung môi ethanol : nước theo tỉ lệ thể tích $80 : 20$. Khảo sát đồng thời 4 phương pháp trên 2 nhóm nguyên liệu tạo ra 8 mẫu thử nghiệm:
  • Trích ngâm dầm (1A, 1B): Tỷ lệ 200 g bột trong 300 mL dung môi ở $25^\circ\text{C}$, ngâm 24 giờ, lặp lại đến khi trích kiệt.
  • Trích ngấm kiệt (2A, 2B): Nạp 200 g bột vào bình ngấm kiệt hình trụ có lớp đệm bông thủy tinh và giấy lọc chặn bi thủy tinh, cho dung dịch chiết chảy giọt đồng thời bổ sung dung môi liên tục ở $25^\circ\text{C}$.
  • Trích nóng (3A, 3B): Nạp 100 g bột và 400 mL dung môi vào bình cầu có ống sinh hàn hoàn lưu, gia nhiệt cách thủy ở $70^\circ\text{C}$.
  • Trích Soxhlet (4A, 4B): Nạp 50 g bột vào buồng chiết của hệ thống Soxhlet, sử dụng 250 mL dung môi trong bình cầu gia nhiệt ở $70^\circ\text{C}$.
  • Dịch chiết của tất cả các mẫu được lọc qua giấy lọc, loại bỏ dung môi bằng hệ thống cô quay chân không ở $60^\circ\text{C}$, sau đó sấy đối lưu ở $60^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi để thu nhận cao trích thô.
• Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hóa lý:
  • Độ ẩm nguyên liệu: Xác định theo tiêu chuẩn TCVN 8900-2:2012 bằng phương pháp sấy khô ở $105^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi: $$%,\text{ẩm} = \frac{m_1 - m_2}{m} \times 100$$
  • Hiệu suất trích ly ($H$): Tính toán dựa trên hàm lượng chất khô tuyệt đối của cao trích và nguyên liệu ban đầu: $$H = \frac{m_1(1 - W_1)}{m_2(1 - W_2)} \times 100$$ (với $m_1, W_1$ là khối lượng và độ ẩm cao sấy; $m_2, W_2$ là khối lượng và độ ẩm bột nguyên liệu).
  • Tổng hàm lượng polyphenol (TPC): Định lượng bằng phản ứng đo màu với thuốc thử Folin-Ciocalteu (pha loãng tỷ lệ 1:5) và dung dịch $\text{Na}_2\text{CO}3$ 10% (w/v), ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang trên máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis ở bước sóng cực đại $\lambda{\max} = 770\text{ nm}$. Kết quả được tính theo đường chuẩn acid gallic ($1 - 20\ \mu\text{g/mL}$) và biểu diễn dưới dạng $\text{mg GAE/g}$ chất khô.
  • Hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH: Đánh giá khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, xác định phần trăm ức chế (%) và giá trị $\text{IC}_{50}$ (nồng độ dập tắt 50% gốc tự do), đối chứng dương bằng acid gallic.
  • Năng lực khử (Reducing power): Đo mật độ quang hấp thụ tại bước sóng $700\text{ nm}$ của phức chất tạo thành từ ion sắt phản ứng với dịch chiết.
  • Xử lý số liệu: Dữ liệu thí nghiệm được phân tích thống kê phương sai (ANOVA) và phân tích tương quan tuyến tính Pearson ($r$) với mức ý nghĩa $p < 0,01$.

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Chương tổng quan hệ thống hóa các cơ sở khoa học về đối tượng nghiên cứu và kỹ thuật thực nghiệm:

• Lý thuyết về polyphenol: Định nghĩa cấu trúc phân tử có vòng thơm gắn một hoặc nhiều nhóm hydroxyl (-OH). Khảo sát chi tiết phân loại flavonoid (hơn 8.000 hợp chất tự nhiên mang khung $C_6-C_3-C_6$), cấu trúc phân tử dihydroflavonol (aromanderin, taxifolin, ampelopsin có hai carbon bất đối $C_2$ và $C_3$), isoflavone (vòng B thế vào vị trí $C_3$ như genistein, daidzein), anthocyanidin (cyanidin, pelargonidin mang điện tích dương) và cấu trúc phân tử acid tannic đại diện cho nhóm tannin.
• Cơ chế chống oxy hóa: Trình bày chi tiết bản chất nhiệt động học của 3 cơ chế HAT, SET-PT và SPLET dưới tác động của dung môi và năng lượng liên kết.
• Đặc tính thực vật và giá trị dinh dưỡng của bơ: Trái bơ gồm vỏ, thịt và hạt. Thịt bơ giàu chất béo đơn không bão hòa (oleic, linoleic, $\alpha$-linolenic) và các vi chất (kali $485\text{ mg/100g}$, vitamin C $10\text{ mg/100g}$, năng lượng $160\text{ kcal/100g}$). Hạt bơ chứa hàm lượng carbohydrate cao ($49,03\text{ g/100g}$ chất khô), protein ($15,55\text{ g/100g}$), chất béo ($17,90\text{ g/100g}$), tro ($2,26\text{ g/100g}$), độ ẩm ($15,01\text{ g/100g}$).
• Thành phần kháng dưỡng: Hạt bơ chứa tannin ($6,98\text{ g/100g}$ chất khô), oxalate ($14,98\text{ g/100g}$ chất khô) và acid phytic ($3,18\text{ g/100g}$ chất khô). Văn bản dẫn chứng nghiên cứu của Justina và cộng sự (2016) cho thấy quá trình ngâm 24 giờ làm giảm hàm lượng tannin 65%, acid phytic 58%, alkaloid 64%, oxalate 49%, saponin 48%; còn quá trình đun sôi 25 phút làm giảm lần lượt 75%, 53%, 79%, 32% và 21%.
• Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt bơ: Dẫn xuất 83 hợp chất tự nhiên được công bố bởi Jorge và cộng sự (2018) qua phân tích HPLC-Q-TOF (với 45 hợp chất phenolic); các hợp chất trong dịch chiết phân đoạn như squalene ($12,4%$), stigmast-5-en-3-ol ($69,93%$), acid béo oleic ($24,1%$), linoleic ($27,6%$), palmitic ($21,3%$). Văn bản chỉ ra hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết hạt bơ đối với Lactobacillus fermentum và Staphylococcus aureus, cùng tiềm năng chống ung thư tuyến tiền liệt in-vitro.

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết quy trình bố trí thí nghiệm, trang thiết bị và hóa chất phân tích:

• Danh mục hóa chất chuẩn độ phân tích: Ethanol 96, thuốc thử Folin-Ciocalteu, acid gallic chuẩn, DPPH, $\text{Na}_2\text{CO}_3$, đệm phosphate ($\text{Na}_2\text{HPO}_4$, $\text{NaH}_2\text{PO}_4$), acid trichloroacetic (TCA), $\text{FeCl}_3$, potassium ferricyanide.
• Thiết bị đo lường: Máy quang phổ UV-Vis Hitachi, hệ thống cô quay chân không Yamamoto, bộ chiết Soxhlet Trade Raypa, cân phân tích Precisa 4 số lẻ ($0,1\text{ mg}$), tủ sấy Memmert, máy ly tâm Hettich.
• Mã hóa 8 mẫu thí nghiệm:
  • Mẫu loại kháng dưỡng (ngâm 24 giờ): 1A (Ngâm dầm, $25^\circ\text{C}$), 2A (Ngấm kiệt, $25^\circ\text{C}$), 3A (Trích nóng hồi lưu, $70^\circ\text{C}$), 4A (Soxhlet, $70^\circ\text{C}$).
  • Mẫu không loại kháng dưỡng (không ngâm): 1B (Ngâm dầm, $25^\circ\text{C}$), 2B (Ngấm kiệt, $25^\circ\text{C}$), 3B (Trích nóng hồi lưu, $70^\circ\text{C}$), 4B (Soxhlet, $70^\circ\text{C}$).
• Xây dựng phương pháp kiểm tra độ cạn kiệt dịch chiết bằng cách chấm dịch lên phiến kính thủy tinh kiểm tra cặn khô.
• Quy chuẩn đường chuẩn acid gallic với 8 nồng độ ($1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20\ \mu\text{g/mL}$), thiết lập thể tích thuốc thử tối ưu gồm $1.000\ \mu\text{L}$ Folin-Ciocalteu (1:5) và $700\ \mu\text{L}\ \text{Na}_2\text{CO}_3$ 10% tại bước sóng $770\text{ nm}$.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

Chương thực nghiệm cung cấp toàn bộ số liệu đo đạc và biện luận khoa học:

• Độ ẩm và hiệu suất trích ly: Báo cáo số liệu độ ẩm nguyên liệu ban đầu, độ ẩm của 8 mẫu cao trích và tính toán hiệu suất thu hồi $H$ (%).
• Hàm lượng polyphenol tổng và hoạt tính sinh học: Báo cáo số liệu tổng hàm lượng polyphenol (mg GAE/g chất khô), tỷ lệ phần trăm ức chế gốc tự do DPPH theo các nồng độ pha loãng, chỉ số $\text{IC}_{50}$ tương ứng của 8 mẫu so với acid gallic chuẩn, và mật độ quang hấp thụ thể hiện năng lực khử tại bước sóng $700\text{ nm}$.
• Phân tích tương quan: Phân tích tương quan Pearson cho thấy mối liên hệ tỷ lệ thuận rất chặt chẽ giữa tổng hàm lượng polyphenol với năng lực khử và hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH với hệ số tương quan đạt $r = 0,88$ ($p < 0,01$).
• Biện luận so sánh nhóm mẫu nguyên liệu: Mẫu không loại kháng dưỡng (nhóm B) luôn cho hiệu suất, hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn hẳn nhóm loại kháng dưỡng (nhóm A). Tác giả giải thích: quá trình ngâm nguyên liệu trong nước 24 giờ nhằm loại kháng dưỡng đã hòa tan và rửa trôi một lượng lớn các hợp chất polyphenol tự do tan trong nước, làm tổn thất trực tiếp nguồn hoạt chất sinh học quý giá.
• Biện luận so sánh phương pháp trích ly: Thứ tự hiệu quả trích ly giữa các phương pháp được ghi nhận: Soxhlet > Trích nóng > Trích ngấm kiệt > Trích ngâm dầm. Phương pháp Soxhlet sử dụng nhiệt độ cao ($70^\circ\text{C}$) kết hợp hoàn lưu dung môi tinh khiết liên tục tạo ra động lực truyền khối lớn nhất, giúp phá vỡ màng tế bào và trích kiệt triệt để polyphenol. Mẫu 4B (không loại kháng dưỡng, trích Soxhlet) đạt các chỉ tiêu cao nhất toàn phần: hiệu suất trích ly đạt $21,31%$, tổng hàm lượng polyphenol đạt $189,67 \pm 4,38\text{ mg GAE/g}$ chất khô.

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tổng kết lại các chỉ số thực nghiệm tốt nhất, khẳng định phương pháp trích Soxhlet trên mẫu không ngâm loại kháng dưỡng là tối ưu, đồng thời đề xuất các định hướng nghiên cứu tiếp theo để hoàn thiện quy trình công nghệ.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm đồng bộ trên 8 mẫu cao trích hạt bơ, thu nhận các số liệu định lượng cụ thể:

Ký hiệu mẫu	Nhóm nguyên liệu	Phương pháp trích ly	Nhiệt độ ($^\circ\text{C}$)	Dung môi (Ethanol : Nước)	Kết quả nổi bật
1A	Loại kháng dưỡng (ngâm 24h)	Trích ngâm dầm	25	80 : 20	Hiệu suất và hàm lượng polyphenol thấp
2A	Loại kháng dưỡng (ngâm 24h)	Trích ngấm kiệt	25	80 : 20	Hiệu quả trích ly trung bình
3A	Loại kháng dưỡng (ngâm 24h)	Trích nóng hoàn lưu	70	80 : 20	Hoạt tính cao hơn 1A và 2A
4A	Loại kháng dưỡng (ngâm 24h)	Trích Soxhlet	70	80 : 20	Hiệu quả cao nhất trong nhóm A
1B	Không loại kháng dưỡng	Trích ngâm dầm	25	80 : 20	Hoạt tính cao hơn mẫu 1A
2B	Không loại kháng dưỡng	Trích ngấm kiệt	25	80 : 20	Hoạt tính cao hơn mẫu 2A
3B	Không loại kháng dưỡng	Trích nóng hoàn lưu	70	80 : 20	Hoạt tính và hiệu suất cao tiệm cận 4B
4B	Không loại kháng dưỡng	Trích Soxhlet	70	80 : 20	Hiệu suất $H = 21,31%$; TPC = $189,67 \pm 4,38\text{ mg GAE/g}$ chất khô; hoạt tính khử và DPPH mạnh nhất

Các phát hiện và kết quả khoa học chính:

1. Xác định mối tương quan tuyến tính thuận giữa hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa thông qua năng lực khử và hoạt tính dập tắt gốc tự do DPPH với hệ số tương quan $r = 0,88$ ($p < 0,01$). Mẫu có hàm lượng polyphenol càng cao thì hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh.
2. Chứng minh ảnh hưởng bất lợi của công đoạn ngâm nước loại kháng dưỡng: Các mẫu nhóm B (không loại kháng dưỡng) đều có hiệu suất trích ly, hàm lượng polyphenol và hoạt tính sinh học vượt trội so với các mẫu nhóm A (loại kháng dưỡng). Quá trình ngâm nước 24 giờ gây thất thoát lớn lượng polyphenol có sẵn trong hạt.
3. Xác định phương pháp trích ly tối ưu: Phương pháp trích Soxhlet trên mẫu không loại kháng dưỡng (mẫu 4B) đạt hiệu suất trích ly cao nhất ($21,31%$), thu nhận tổng hàm lượng polyphenol cao nhất ($189,67 \pm 4,38\text{ mg GAE/g}$ chất khô), thể hiện giá trị $\text{IC}_{50}$ thấp nhất (khả năng dập tắt gốc tự do DPPH mạnh nhất) và năng lực khử cao nhất ở bước sóng $700\text{ nm}$.
4. Khẳng định tiềm năng ứng dụng: Nguồn phụ phẩm hạt bơ Đắk Lắk hoàn toàn có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu tự nhiên giàu polyphenol phục vụ cho các ngành sản xuất thực phẩm chức năng, chất chống oxy hóa tự nhiên thay thế phụ gia tổng hợp, hoặc thức ăn chăn nuôi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài dựa trên phạm vi nghiên cứu thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới khảo sát cố định ở quy mô phòng thí nghiệm với một hệ dung môi duy nhất là ethanol : nước (tỉ lệ $80 : 20\text{ v/v}$), chưa tiến hành khảo sát các tỷ lệ nồng độ ethanol khác hoặc các hệ dung môi phân cực khác nhau để so sánh độ chọn lọc.
• Đề tài chỉ định lượng tổng polyphenol bằng phương pháp trắc quang Folin-Ciocalteu và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa tổng quát qua mô hình in-vitro (DPPH, năng lực khử); chưa tiến hành phân tích sắc ký (HPLC, GC-MS) để định danh và định lượng cụ thể từng hợp chất polyphenol đơn lẻ trong cao trích thô.
• Chưa khảo sát các biến thiên công nghệ chuyên sâu trên từng phương pháp (như ảnh hưởng của kích thước hạt bột bơ, thời gian chiết tối ưu theo chu kỳ, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi biến thiên).
• Chưa kiểm nghiệm đánh giá tồn dư các hợp chất kháng dưỡng độc hại (như oxalate lắng đọng tạo sỏi) còn lại trong dịch cao chiết của mẫu 4B để xác định ngưỡng an toàn thực phẩm.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được tác giả đề xuất:

• Khảo sát tối ưu hóa các điều kiện trích ly (thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ rắn/lỏng, tỷ lệ dung môi ethanol/nước) nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi polyphenol.
• Ứng dụng các công nghệ trích ly hiện đại, xanh và hiệu năng cao đã được tổng quan lý thuyết như trích ly có hỗ trợ vi sóng (MAE) hoặc trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) với $\text{CO}_2$.
• Tiến hành phân lập, tinh sạch và định danh thành phần các polyphenol đặc trưng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
• Thử nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học mở rộng trên các dòng tế bào, thử nghiệm khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và nghiên cứu ứng dụng thực tế của cao hạt bơ trong việc bảo quản thực phẩm ngăn ngừa hiện tượng oxy hóa lipid.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên cao học ngành Công nghệ Thực phẩm, Công nghệ Hóa học, Kỹ thuật Hóa sinh và Dược học: Cung cấp cơ sở lý thuyết đầy đủ về hóa học polyphenol thực vật, cơ chế chống oxy hóa phân tử (HAT, SET-PT, SPLET), quy trình điều chế và so sánh đồng thời 4 kỹ thuật trích ly (ngâm dầm, ngấm kiệt, trích nóng hồi lưu, Soxhlet).
• Người làm nghiên cứu về tận dụng phụ phẩm nông nghiệp: Cung cấp số liệu thực tế về thành phần dinh dưỡng (protein, lipid, carbohydrate, tro, độ ẩm) và thành phần kháng dưỡng (tannin, oxalate, acid phytic) của hạt bơ Việt Nam so với các loại hạt đậu thông thường.
• Nghiên cứu viên phân tích hoạt tính sinh học: Tham khảo quy trình chuẩn độ Folin-Ciocalteu (tối ưu hóa thể tích $\text{Na}_2\text{CO}3$ và thuốc thử ở bước sóng $770\text{ nm}$), phương pháp dựng đường chuẩn acid gallic, quy trình thử nghiệm gốc tự do DPPH tính toán $\text{IC}{50}$, và phép đo năng lực khử ở bước sóng $700\text{ nm}$.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao mẫu cao không loại kháng dưỡng (nhóm B) lại cho hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn nhóm loại kháng dưỡng (nhóm A)? Trong nghiên cứu, nhóm mẫu loại kháng dưỡng (A) được xử lý bằng cách ngâm hạt bơ trong nước suốt 24 giờ ở nhiệt độ phòng ($25^\circ\text{C}$). Do nhiều hợp chất polyphenol trong hạt bơ có tính phân cực cao và tan tốt trong nước, quá trình ngâm này không chỉ làm giảm các chất kháng dưỡng mà còn hòa tan và cuốn trôi một lượng lớn polyphenol tự do ra môi trường nước thải. Kết quả là hàm lượng polyphenol còn lại trong mô tế bào hạt bơ giảm đi rõ rệt, dẫn đến hiệu suất trích ly, tổng hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nhóm A đều thấp hơn nhóm B.

2. Phương pháp trích ly nào cho hiệu quả cao nhất trong khóa luận và các thông số thực nghiệm tương ứng là gì? Phương pháp trích Soxhlet trên mẫu nguyên liệu không loại kháng dưỡng (mẫu ký hiệu 4B) đạt kết quả cao nhất toàn diện: hiệu suất trích ly đạt $H = 21,31%$, tổng hàm lượng polyphenol đạt $189,67 \pm 4,38\text{ mg GAE/g}$ chất khô, đồng thời thể hiện khả năng ức chế gốc tự do DPPH và năng lực khử mạnh nhất. Thông số thực nghiệm của mẫu 4B gồm: 50 g bột hạt bơ (kích thước rây 80 mesh), 250 mL hệ dung môi ethanol : nước tỉ lệ 80 : 20, gia nhiệt ở nhiệt độ $70^\circ\text{C}$ trên bộ thiết bị Soxhlet liên tục đến khi kiệt hoạt chất.

3. Mối tương quan giữa tổng hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa trong nghiên cứu này được xác định như thế nào? Số liệu thực nghiệm khẳng định có mối tương quan tuyến tính tỷ lệ thuận rất mạnh mẽ giữa tổng hàm lượng polyphenol đo bằng Folin-Ciocalteu với hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH và năng lực khử (đo tại bước sóng $700\text{ nm}$). Hệ số tương quan Pearson thu được đạt $r = 0,88$ với mức ý nghĩa thống kê $p < 0,01$, chứng minh polyphenol chính là tác nhân chủ đạo quyết định hoạt tính kháng oxy hóa trong cao chiết hạt bơ.

4. Phụ phẩm hạt bơ chiếm bao nhiêu phần trăm khối lượng quả và thành phần kháng dưỡng gồm những chất nào? Theo các tài liệu được khóa luận trích dẫn, hạt bơ chiếm từ 13% đến 18% tổng khối lượng quả tươi. Hạt bơ chứa các thành phần kháng dưỡng đáng kể gồm: tannin ($6,98 \pm 0,04\text{ mg/100g}$ hoặc $6,98\text{ g/100g}$ chất khô tùy cách biểu diễn trong văn bản), tổng oxalate ($14,98 \pm 0,03\text{ mg/100g}$ hoặc $14,98\text{ g/100g}$ chất khô), và acid phytic ($3,18 \pm 0,16\text{ mg/100g}$ hoặc $3,18\text{ g/100g}$ chất khô). Các chất này gây trở ngại cho quá trình hấp thu khoáng chất và chuyển hóa protein nếu không được xử lý hoặc kiểm soát phù hợp.

5. Khóa luận sử dụng tiêu chuẩn nào để xác định độ ẩm và hệ dung môi trích ly cụ thể là gì? Độ ẩm của nguyên liệu bột hạt bơ được xác định theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8900-2:2012 bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ $105^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi. Hệ dung môi được lựa chọn đồng nhất cho toàn bộ các thí nghiệm trích ly (ngâm dầm, ngấm kiệt, trích nóng, Soxhlet) là hỗn hợp ethanol : nước pha theo tỉ lệ thể tích $80 : 20$.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Phạm Thị Ngọc Lợi đã thực hiện thành công việc khảo sát, so sánh 4 phương pháp trích ly polyphenol từ phụ phẩm hạt bơ (Persea americana Mill) nguồn gốc Đắk Lắk trên hai nhóm nguyên liệu có và không ngâm loại kháng dưỡng. Kết quả thực nghiệm khẳng định phương pháp trích Soxhlet với dung môi ethanol : nước (80 : 20) trên mẫu không loại kháng dưỡng (mẫu 4B) đem lại hiệu suất trích ly tối ưu ($21,31%$) và hàm lượng polyphenol cao nhất ($189,67 \pm 4,38\text{ mg GAE/g}$ chất khô), đồng thời xác lập mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa tổng hàm lượng polyphenol với khả năng dập tắt gốc tự do DPPH và năng lực khử ($r = 0,88; p < 0,01$). Nghiên cứu cung cấp hệ thống dữ liệu hóa học thực nghiệm tin cậy, làm cơ sở khoa học cho các định hướng thu hồi hoạt chất sinh học tự nhiên và gia tăng chuỗi giá trị chế biến từ phế phụ phẩm ngành bơ tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Tổng quan về polyphenol Polyphenol là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tồn tại trong thực vật được chứng minh là có khả năng kháng oxy hóa vô cùng hiệu quả. Polyphenol có thể bảo vệ cơ thể, giúp cơ thể chống lại nhiều loại bệnh khác nhau do gốc tự do gây ra. Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (vòng benzen) chứa một, hai, ba.

hoặc nhiều nhóm hydroxyl (OH) gắn trực tiếp vào vòng benzen. Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm OH với bộ khung hóa học mà các tính chất hoá học hoặc hoạt tính sinh học thay đổi (Milner và cộng sự, 1994). Phân loại các hợp chất polyphenol Dựa vào số lượng vòng benzen mà người ta phân biệt thành:  Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ một vòng benzen và một hay nhiều nhóm OH, được phân thành các mono-phenol, di-phenol (pyrocatechin, rezoxyn,.  Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm như monome và polyme (Nguyễn Minh Thông, 2016).

 Monome hay polyphenol đơn giản: được chia thành - Nhóm C6 – C1 (acid phenol carbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm. - Nhóm C6 – C3 (acid cumaric, acid cafeic): có gốc carbonyl được nối với nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao. - Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các Flavonoid và được chia thành các nhóm phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím), catechin (không màu),.  Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ như tanin, lignin, acid humic,.

1 Các chất phenol Polyphenol Phenol đơn giản Monophenol Triphenol Nhóm C6 – C1 Nhóm C6 – C3 Phenol Acid phenolcarbonic Acid Cumaric Polymer Diphenol Acid Cafeic Nhóm C6 – C3 – C1 Tanin Humic Flavonoid Lignin Aglycon: Flavon, Flavonol, Flavanonol, Chalcon, Auron, Catechin, Leucoanthocyanidin, Anthocyanidin, izoflavonoid, neoflavonoid, Biflavonoit. Sơ đồ phân loại các hợp chất phenol và polyphenol (Harborn J. B, 1964) Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hóa quan trọng, tham gia vào các quá trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô hấp tế bào (vận chuyển H+ trong quá trình photphoryl hóa oxy hóa,…), quá trình quang hợp, điều hòa sinh trưởng phát triển của thực vật,…(Harborn J. B, 1964) Dưới đây là một số polyphenol đơn giản: Flavonoid Những hợp chất thuộc họ flavonoid có số lượng rất lớn và được nghiên cứu nhiều nhất trong các hợp chất polyphenol (Harborne JB và cộng sự, 1982).

Cho đến nay đã có hơn 8000 hợp chất thuộc họ flavonoid đã được phát hiện (Cheynier, 2005). Chúng có bộ khung hóa học C6−C3−C6’ (Hình 1. Cấu trúc tổng quan của hợp chất flavonoid Dựa vào bản chất của cấu trúc cơ bản, flavonoid được phân chia thành nhiều phân lớp khác nhau, ví dụ: (i) Vòng dị tố (đóng và mở), (ii) sự có hoặc không có liên kết đôi C2=C3 và nhóm carbonyl ở C4 và (iii) vị trí của vòng B (ở vị trí C2 hoặc C3). Hầu hết các flavonoid đều có nhóm thế OH ở vị trí C5 và C7 còn vòng B thường có nhóm thế ở vị trí C3’ và C4’ (Tsao, 2010).

Dihydroflavonol Hợp chất dihydroflavonol là flavanone được gắn nhóm thế OH ở C3 (2- phenyl-3- hydroxy-2,3-dihydropyran-4-ones). Chúng có hai carbon bất đối 8 C2 và C3 nên tạo ra hai cặp đôi đồng phân quang học. Những hợp chất dihydroflavonol phổ biến nhất là: aromanderin, taxifolin và ampelopsin (Hình 1. Cấu trúc của hợp chất dihydroflavonol Isoflavone Trong isoflavone thì vòng B được thế vào C3 thay vì C2 như trong hợp chất flavonoid (ví dụ: genistein và daidzein ở Hình 1.

Cấu trúc của hợp chất isoflavone Anthocyanidin Đặc điểm nổi bật của hợp chất này là một ion mang điện tích dương. Hầu hết các hợp chất của anthocyanidin là nhân tố chủ yếu tạo ra những màu sắc khác nhau ở thực vật. Hai hợp chất anthocyanidin phổ biến là cyanidin, pelargonidin được trình bày ở Hình 1. Cấu trúc của hợp chất anthocyanidin Tannin Tannin thực vật có thể được chia thành hai chính nhóm: (1) tannin thủy phân được và (2) tannin ngưng tụ.

Một nhóm thứ ba của tannin là phlorotannin, chỉ được tìm thấy trong tảo nâu biển và không được tiêu thụ phổ biến bởi con người (Ragan MA và cộng sự, 1986). Cấu trúc của acid tannic 1. Cơ chế hoạt động của các hợp chất kháng oxy hóa polyphenol 1. Cơ chế chuyển nguyên tử hydro (Hydrogen Atomic Transfer-HAT) Trong cơ chế này, chất chống oxy hóa được ký hiệu là ArOH sẽ khống chế các gốc tự do (ví dụ: gốc peroxyl ROO•) bằng cách chuyển một nguyên tử hydro của nhóm OH trong ArOH sang gốc tự do ROO• : ROO• + ArOH  ROOH + ArO• (1.1) Gốc phenoxyl (ArO•) tạo thành có thể được ổn định nhờ vào sự chuyển một nguyên tử hydro ở xa hơn để tạo thành quinone hoặc phản ứng với gốc tự do khác bao gồm cả các gốc phenoxyl khác.

Với sự phát triển liên tục như vậy sẽ tạo ra một chuỗi các phản ứng (Apak và cộng sự, 2016). Cơ chế HAT phù hợp với kiểu phân cắt đồng ly của liên kết O-H trong hợp chất polyphenol. Phản ứng này có thể xảy ra trên mỗi nhóm OH của hợp chất polyphenol (ArOH) và nó phụ thuộc vào năng lượng phân ly liên kết (Bond Dissociation Enthalpy − BDE) của nhóm OH và enthalpy của phản ứng (1. Cơ chế chuyển một electron chuyển proton (Single Electron TransferProton Transfer − SET−PT) Cơ chế này gồm hai quá trình (phản ứng 1.2), trong quá trình thứ nhất một electron từ polyphenol chuyển sang gốc tự do và quá trình thứ hai là chuyển một proton (Shahidi F và cộng sự, 1992).

ROO• + ArOH  ROO- + ArOH+•  ROOH + ArO• (1.2) Cơ chế SET−PT được quyết định bởi khả năng chuyển electron, được đặc trưng bởi năng lượng ion hóa (Ionization Energy − IE). Trong quá trình thứ hai của cơ chế này thì liên kết O−H phân cắt theo kiểu dị ly, được đặc trưng bởi năng lượng phân ly proton (Proton Dissociation Enthalpy – PDE), nó tỏa nhiệt mạnh đối với hợp chất phenolic (Jovanovic S.V và cộng sự, 1994). Ngoài ra, dung môi cũng ảnh hưởng đến enthalpy phản ứng của quá trình 5 thứ nhất (Simic M.G và cộng sự, 1996). Vì vậy, dung môi cần phải đưa vào nghiên cứu để thu được một sự mô phỏng tốt về đặc điểm phản ứng oxy hóa của hợp chất polyphenol.

Cơ chế chuyển proton mất electron (Sequential Proton Loss Electron Transfer − SPLET) Trong cơ chế SPLET (các phản ứng 1.C và cộng sự, 2014), thì một proton bị mất và tiếp theo đó là sự chuyển electron. Hai đại lượng nhiệt động học bao gồm ái lực proton (Proton Affinity – PA) và năng lượng chuyển electron (Electron Transfer Enthalpy – ETE) là hai thông số đặc trưng cho quá trình này (Litwinienko G và cộng sự, 2003). Cơ chế này được xét trong điều kiện pH cụ thể (Zhang H.Y và cộng sự, 2006). ArOH  ArO• + H+ ArO- + RO2•  RO2- + ArO• (1.3) RO2- + H+  ROOH Sơ đồ tổng quát về các cơ chế chống oxy hóa của hợp chất polyphenol được trình bày ở Hình 1.

Sơ đồ các cơ chế chống oxy hóa 1. Một số phương pháp trích ly polyphenol Phương pháp trích ly bao gồm việc lựa chọn dung môi, dụng cụ trích ly và cách trích ly. Một phương pháp trích ly phù hợp chỉ có thể được lựa chọn khi đã biết rõ thành phần hóa học của sinh vật. Vì vậy, không thể có một phương pháp trích ly chung cho tất cả các loại hợp chất trong các sinh vật.

Lựa chọn phương pháp trích ly để có được cao trích thô là công việc rất quan trọng để tránh phân hủy hợp chất, tránh các phản ứng phụ, các phản ứng chuyển vị. Phương pháp trích ngâm dầm Đây là một phương pháp trích ly đơn giản, không đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với một lượng lớn nguyên liệu thực vật, nên thường được sử dụng rộng rãi (Pavia và cộng sự, 2012). Tiến hành ngâm mẫu trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đây. Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nữa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong nguyên liệu thực vật (Sarker và cộng sự, 2012).

Phương pháp trích ngâm dầm Có thể gia tăng hiệu quả sự trích bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp nguyên liệu thực vật hoặc sử dụng máy lắc để lắc nhẹ, đảm bảo độ đồng nhất (Pavia và cộng sự, 2012). Mỗi lần ngâm dung môi chỉ cần 24h là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn, nếu ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian (Nguyễn Thị Kim Phụng, 2007). Sau khi trích ly, nguyên liệu thực vật còn sót lại phải được tách ra khỏi dung môi, có thể loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm nếu bột quá mịn (Sarker và cộng sự, 2012). Nhược điểm chính của phương pháp này là mất nhiều thời gian, có thể từ vài giờ đến vài tuần (Takahashivà cộng sự, 2001).

Toàn bộ quá trình cũng có thể làm tiêu tốn một lượng lớn dung môi và có thể dẫn đến nguy cơ tìm tàng là mất đi một số chất chuyển hóa của nguyên liệu thực vật. Hơn nữa, một số chất có thể không được trích ly hiệu quả nếu chúng kém hòa tan ở nhiệt độ phòng (Pavia và cộng sự, 2012). Phương pháp trích ngấm kiệt Trích ngấm kiệt cũng là một phương pháp được sử dụng phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Trong phương pháp trích ngấm kiệt, dung môi được dịch chuyển trong khối nguyên liệu theo một chiều xác định với một tốc độ nhất định.

Trong quá 7 trình dịch chuyển, các chất tan trong nguyên liệu tan vào trong dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối nguyên liệu. Trích ngấm kiệt là quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối nguyên liệu. Dung môi mới tiếp xúc với nguyên liệu có lượng hoạt chất thấp nhất. Do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn (Sarker và cộng sự, 2012).

Dụng cụ cần thiết cho phương pháp này gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. Phía trên cao của bình ngấm kiệt là bình lóng để chứa dung môi tinh khiết (Vladimir Kislik, 2012).