CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Phương pháp cận hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật đa biến chemometrics 1.1 Phương pháp phân tích cận hồng ngoại Vùng cận hồng ngoại của quang phổ điện từ trải dài từ 750 – 2500 nm (12500 – 4000 cm-1), đây là vùng quang phổ tồn tại giữa cuối tia đỏ trong vùng quang phổ nhìn thấy và bắt đầu vùng trung hồng ngoại. Quang phổ cận hồng ngoại (NIRS) dựa trên phép đo sự hấp thu, truyền qua và phản xạ khuếch tán trong toàn bộ vùng bước sóng 750 – 2500 nm [1]. Trong khoảng thời gian từ những năm 1990 đến nay, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại được ứng dụng trong phân tích thực phẩm, hóa học. Kỹ thuật này kết hợp với sự phát triển của kỹ thuật chemometrics và đã trở thành công cụ phân tích hiệu quả, nhanh chóng, độ chính xác cao và không phá hủy mẫu, có thể dùng để nghiên cứu tính chất, cấu tạo hoặc định lượng các hợp chất hữu cơ [2].1 Nguyên tắc của phép đo phổ cận hồng ngoại Kỹ thuật quang phổ hồng ngoại dựa trên hiệu ứng đơn giản là các hợp chất hóa học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại.
Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại [3]. Nguyên lý của kỹ thuật quang phổ học là dựa trên những biến đổi gây ra bởi sự tương tác giữa bức xạ với vật chất. Vùng hấp thụ quang phổ cận hồng ngoại là một phần trong quang phổ hồng ngoại, tương ứng với năng lượng của các dao động phân tử. Trong khi phổ trung hồng ngoại thể hiện các dải hấp thụ tương ứng với dao động gây thay đổi momen lưỡng cực trong phân tử, dải hấp thụ vùng cận hồng ngoại lại thể hiện các dao động phức tạp hơn nhiều.
Nghĩa là, trong điều kiện bình thường, phân tử ở trạng thái cơ bản có mức năng lượng thấp, khi phân tử nhận năng lượng, ví dụ khi hấp thụ bức xạ, có thể chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Như vậy, khi phân tử nhận năng lượng sẽ gây ra các bước chuyển năng lượng liên quan đến chuyển động của điện 4 tử (Ee), chuyển động dao động (Ev), chuyển động quay (Ej) là nguồn gốc các loại phổ hấp thụ phân tử: phổ quay, phổ dao động kết hợp quay theo trục hoặc kết hợp của cả ba phổ điện tử – dao động – quay … [4] và các dải hấp thụ tương ứng với sự chuyển mức năng lượng gọi là âm bội (overtone). Vùng quang phổ cận hồng ngoại là một phần của phổ rung động phân tử. Quang phổ cận hồng ngoại được dựa trên sự rung động kết hợp các kiểu dao động và những chuyển mức năng lượng như vậy không phù hợp với các quy tắc lựa chọn cơ học lượng tử.
Kết quả là sự hấp thụ phân tử trong vùng cận hồng ngoại thường khá nhỏ. Tuy nhiên, bức xạ cận hồng ngoại có khả năng truyền qua một mẫu dễ dàng hơn so với bức xạ trung hồng ngoại. Trong những năm gần đây, khi kỹ thuật chế tạo máy móc tiến bộ hơn, với những nguồn bức xạ có độ chọn lọc cao và các đầu dò đủ nhạy, phổ cận hồng ngoại đã thể hiện được vai trò của nó trong phân tích. Các nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến nó hơn và lĩnh vực ứng dụng phổ cận hồng ngoại cũng ngày càng mở rộng.
Theo những công bố trong thời gian gần đây, quang phổ cận hồng ngoại là một kỹ thuật phân tích có nhiều ưu điểm trong cả định lượng, định tính và nghiên cứu cấu tạo của vật chất. Nghiên cứu của tác giả Đinh Văn Mười và cộng sự [5] vào năm 2009 đã xây dựng thành công các phương trình suy đoán hàm lượng chất khô, protein, chất béo và xơ của dầu đỗ tương từ các số liệu phổ hấp thụ trên máy NIRS và số liệu phân tích được phân tích theo tiêu chuẩn. Kết quả thu được về các giá trị thành phần chất khô, protein, chất béo và xơ của khô dầu đỗ tương tính theo các phương trình suy đoán so với các giá trị phân tích theo tiêu chuẩn là không khác nhau có ý nghĩa thống kê hay nói cách khác là chúng tương tự nhau. Tác giả kết luận rằng có thể dùng các phương trình vừa xây dựng trên thiết bị NIRS để xác định được hàm lượng chất khô, protein, mỡ và xơ của khô dầu đỗ tương với độ chính xác lớn hơn 95%.
Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây, NIR đã trở thành một trong những công cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp. So với phương pháp phân tích theo tiêu chuẩn để định lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định 5 lượng chất hữu cơ trong phổ cận hồng ngoại có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong quá trình chuẩn bị mẫu, lượng mẫu phân tích ít, chi phí thấp do có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [6]. Việc sử dụng phổ cận hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến đã góp phần đưa phương pháp phổ cận hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng mẫu. Sarragua và cộng sự [7] đã nghiên cứu thành công phương pháp định lượng nhanh aminoglycoside bằng phép đo cận hồng ngoại.
Không giống như các phương pháp định lượng theo tiêu chuẩn là dựa trên cơ sở các phản ứng của dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượng aminoglycoside [8], [9], trong nghiên cứu này, các tác giả đã đưa ra một phương pháp hoàn toàn mới để xác định aminoglycoside. Theo đó, phương pháp này đã được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulfate và ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat. Các mẫu tổng hợp và mẫu nội chuẩn đã được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulfate. Mẫu được tiến hành đo phổ cận hồng ngoại với chế độ đo phản xạ biến đổi Fourier.
Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chuẩn phổ cận hồng ngoại phù hợp với hàm lượng neomycin sulfate. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulfate trong các mẫu thương mại. Kết quả thu được cho thấy neomycin sulfate đã được xác định thành công bằng phương pháp đo phổ cận hồng ngoại với sai số 6,6%. Đối với roxithromycin, thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định.
Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký.H Sherazi [10] đã sử dụng phương pháp cận hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích thống kê đa biến. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu. 6 Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ cận hồng ngoại kết hợp với kỹ thuật thống kê đa biến là công trình của tác giả P. Roychoudhury vào năm 2007 đã giám sát liên tục để phân tích đồng thời glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [11].2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ cận hồng ngoại Tín hiệu đo phổ cận hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử.
Do đó, phổ cận hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau: - Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụ thuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và liên kết nội phân tử [3]. - Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: Ở trạng thái khí, các phân tử chuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại của các chất ở thể khí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử. Tuy nhiên, kỹ thuật đo mẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu cận hồng ngoại ở dạng rắn hoặc dạng lỏng. Các phân tử ở dạng rắn có thể tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau, do đó phổ cận hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tác giữa các phân tử khi thay đổi mạng tinh thể.
Khi phân tử ở trong các dung môi khác nhau thì hấp thụ cận hồng ngoại cũng khác nhau, nguyên nhân là do sự liên kết hydro giữa các phân tử làm dịch chuyển số sóng và mở rộng các vân hấp thụ [3]. Ảnh hưởng của quy trình chuẩn bị mẫu và ảnh hưởng của môi trường. Với trạng thái tồn tại khác nhau của mẫu thì các yếu tố ảnh hưởng tác động đến các mẫu đo là khác nhau [3].3 Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp cận hồng ngoại Ưu điểm: 7 - Phân tích nhanh, nhiều mẫu đồng thời, không độc hại, không gây ảnh hưởng đến môi trường vì không dùng hóa chất, chi phí rẻ dù đầu tư ban đầu cao để trang bị thiết bị. - Thao tác đơn giản và tiến hành nhanh chóng, có thể giảm bớt các công đoạn xử lý mẫu và không phá hủy mẫu khi phân tích.
- Có thể tiến hành định lượng một chất trong khi có mặt các chất khác. - Phạm vi ứng dụng rất rộng cho cả phân tích hữu cơ và vô cơ. - Độ chính xác khá cao [12]. Nhược điểm: - Phương pháp có độ nhạy yếu khi xác định các chất có hàm lượng bé, dạng vết (vi lượng).
- Phải thường xuyên xây dựng và cập nhật mô hình suy đoán từng chất cho từng nền mẫu. - Khi phương pháp quang phổ cận hồng ngoại ngày càng phát triển, nhà sản xuất khó kiểm soát được độ nhạy của các thiết bị cận hồng ngoại vì phải liên tục hiệu chỉnh thiết bị các thiết bị để khỏi làm giảm độ chính xác của thiết bị cận hồng ngoại. - Nói chung, các thiết bị quang phổ cận hồng ngoại có cấu tạo phức tạp, đắt tiền [12].2 Nguyên lý hoạt động của thiết bị quang phổ cận hồng ngoại cầm tay Thiết bị đo phổ cận hồng ngoại dựa trên phép đo phản xạ khuếch tán trong toàn bộ vùng bước sóng hồng ngoại từ 700 nm đến 2500 nm hoặc các phân đoạn của chúng hoặc tại các bước sóng được chọn [13].
