Chiết Xuất Và Phân Lập Epigallocatechin Gallat Từ Lá Trà Xanh Camellia Sinensis Làm Chất Đối Chiếu

Luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết xuất, phân lập epigallocatechin gallat từ lá trà xanh Camellia sinensis làm chất đối chiếu trong công nghệ hóa học.

• Tác giả: Huỳnh Thị Ngọc Dung
• Người hướng dẫn: TS. Hà Diệu Ly
• Trường học: Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP.HCM
• Chuyên ngành: Công nghệ hóa học
• Đề tài: Chiết xuất, phân lập Epigallocatechin gallat từ lá trà xanh (Camellia sinensis L.) làm chất đối chiếu
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: TP.HCM

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Giới thiệu chung về trà
• 1.2. Nhóm hợp chất catechin
• 1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.4. Tổng quan chung về chất chuẩn
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3. Phân lập, tinh chế
• 2.4. Xác định cấu trúc
• 2.5. Xây dựng tiêu chuẩn, thẩm định phương pháp đánh giá chất đối chiếu
• 2.6. Thiết lập chất đối chiếu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Xác định cấu trúc
• 3.2. Khảo sát độ tinh khiết của chế phẩm
• 3.3. Thẩm định phương pháp
• 3.3.1. Tính tương thích hệ thống
• 3.3.2. Tính đặc hiệu của phương pháp
• 3.3.3. Độ tuyến tính, hệ số tương quan r, phương trình hồi quy
• 3.3.4. Độ đúng phương pháp
• 3.4. Đánh giá chất đối chiếu
• 3.4.1. Xác định giá trị ấn định
• 3.4.2. Đánh giá chất chuẩn
• 3.5. Ứng dụng phương pháp phân tích và chất đối chiếu để khảo sát một số sản phẩm có chứa chiết xuất trà xanh trên thị trường
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG

Tóm tắt

I. Chiết Xuất Epigallocatechin Gallat

Chiết xuất Epigallocatechin Gallat (EGCG) từ lá trà xanh Camellia Sinensis là quá trình trọng tâm của luận văn. Phương pháp chiết xuất được thực hiện với sự hỗ trợ của siêu âm, đảm bảo hiệu quả cao trong việc tách chiết các hợp chất polyphenol. Kết quả cho thấy EGCG được phân lập với độ tinh khiết trên 95%, đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng cho chất đối chiếu. Quá trình này không chỉ tối ưu hóa điều kiện phòng thí nghiệm mà còn mở ra hướng ứng dụng trong y học và công nghệ hóa học.

1.1 Phương Pháp Chiết Xuất

Phương pháp chiết xuất sử dụng siêu âm được chọn để tối ưu hóa quá trình tách chiết EGCG từ lá trà xanh Camellia Sinensis. Kỹ thuật này giúp tăng hiệu suất trích ly các hợp chất polyphenol, đặc biệt là EGCG, với độ tinh khiết cao. Quá trình được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, đảm bảo tính khả thi và hiệu quả kinh tế.

1.2 Ứng Dụng Trong Y Học

EGCG được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh, gấp 100 lần so với vitamin C. Nghiên cứu chỉ ra rằng EGCG có tiềm năng trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư vú và tuyến tiền liệt. Điều này mở ra hướng ứng dụng quan trọng trong y học, đặc biệt là trong lĩnh vực điều trị và phòng ngừa bệnh tật.

II. Lá Trà Xanh Camellia Sinensis

Lá trà xanh Camellia Sinensis là nguồn nguyên liệu chính cho quá trình chiết xuất EGCG. Thành phần hóa học của lá trà bao gồm nhiều hợp chất polyphenol, đặc biệt là nhóm catechin, chiếm 25-30% khối lượng chất khô. EGCG là thành phần chính trong nhóm này, với hàm lượng từ 5-12%. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình chiết xuất từ lá trà, đảm bảo chất lượng và hiệu quả cao.

2.1 Thành Phần Hóa Học

Lá trà xanh chứa nhiều hợp chất polyphenol, trong đó catechin là nhóm chính. EGCG, một thành phần quan trọng của nhóm catechin, có khả năng chống oxy hóa mạnh. Ngoài ra, lá trà còn chứa các hợp chất khác như flavonol, acid hữu cơ, và caffeine, góp phần vào giá trị dinh dưỡng và dược tính của trà.

2.2 Phân Bố Và Đặc Điểm

Camellia Sinensis được trồng phổ biến ở các vùng khí hậu ôn hòa, ẩm ướt. Ở Việt Nam, trà được trồng nhiều tại các tỉnh miền núi phía Bắc và Tây Nguyên. Đặc điểm sinh trưởng và thành phần hóa học của lá trà phụ thuộc vào giống trà, điều kiện môi trường và phương pháp canh tác.

III. Chất Đối Chiếu

Việc thiết lập chất đối chiếu từ EGCG và catechin là mục tiêu chính của luận văn. Quá trình này bao gồm phân lập, tinh chế và đánh giá độ tinh khiết của các hợp chất. Kết quả cho thấy EGCG và catechin đạt độ tinh khiết trên 95%, đáp ứng tiêu chuẩn ISO 13528. Chất đối chiếu này có giá trị lớn trong việc kiểm soát chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc từ trà xanh trên thị trường.

3.1 Quy Trình Thiết Lập

Quy trình thiết lập chất đối chiếu bao gồm các bước phân lập, tinh chế và đánh giá độ tinh khiết. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), EGCG và catechin được xác định với độ tinh khiết trên 95%. Quá trình này tuân thủ các hướng dẫn của ASEAN và WHO, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy.

3.2 Ứng Dụng Trong Kiểm Soát Chất Lượng

Chất đối chiếu được sử dụng để kiểm soát chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc từ trà xanh, bao gồm thực phẩm chức năng và dược phẩm. Việc thiết lập chất đối chiếu trong nước giúp giảm chi phí và thời gian nhập khẩu từ nước ngoài, đồng thời đảm bảo kết quả kiểm nghiệm đáng tin cậy.

IV. Nghiên Cứu Hóa Học Thực Vật

Luận văn tập trung vào nghiên cứu hóa học thực vật, đặc biệt là quá trình chiết xuất và phân lập các hợp chất từ lá trà xanh Camellia Sinensis. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp kiến thức về thành phần hóa học của trà mà còn mở ra hướng ứng dụng trong công nghệ hóa học và y học. Kết quả nghiên cứu có giá trị thực tiễn cao, đóng góp vào sự phát triển của ngành công nghiệp dược phẩm và thực phẩm chức năng.

4.1 Phương Pháp Nghiên Cứu

Phương pháp nghiên cứu hóa học thực vật bao gồm chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất. Sử dụng các kỹ thuật như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), nghiên cứu đã xác định được cấu trúc và độ tinh khiết của EGCG và catechin.

4.2 Giá Trị Thực Tiễn

Nghiên cứu này có giá trị thực tiễn cao, đóng góp vào việc phát triển các sản phẩm từ trà xanh trong lĩnh vực y học và công nghệ hóa học. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất và kiểm soát chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc từ trà xanh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Trà xanh (Camellia sinensis L.) là một trong những loại thực vật có giá trị kinh tế và y học cao, được trồng phổ biến tại nhiều vùng khí hậu ôn đới và á nhiệt đới, trong đó Việt Nam có các vùng trồng trà nổi bật như Lâm Đồng, Gia Lai, và các tỉnh miền núi phía Bắc. Lá trà chứa nhiều hợp chất polyphenol, đặc biệt là nhóm catechin, chiếm khoảng 25-30% khối lượng chất khô, trong đó epigallocatechin gallate (EGCG) chiếm khoảng 12%. EGCG được biết đến với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, cao gấp 100 lần so với vitamin C, và có nhiều tác dụng sinh học như ức chế sự phát triển tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn.

Nghiên cứu tập trung vào việc chiết xuất, phân lập và tinh chế EGCG từ lá trà xanh giống LD 97 thu hoạch tại Lâm Đồng trong giai đoạn năng suất cao (tháng 9-11). Mục tiêu chính là thiết lập chất đối chiếu EGCG, catechin và acid gallic với độ tinh khiết trên 95% theo tiêu chuẩn ISO 13528, phục vụ kiểm soát chất lượng các sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh trên thị trường thực phẩm chức năng và dược phẩm. Nghiên cứu được thực hiện trong khoảng thời gian từ 06/2013 đến 06/2014 tại Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP.HCM.

Việc xây dựng chất đối chiếu trong nước giúp giảm chi phí nhập khẩu chất chuẩn nước ngoài, rút ngắn thời gian kiểm nghiệm và nâng cao độ tin cậy kết quả phân tích, góp phần phát triển ngành công nghệ sinh học và công nghiệp thực phẩm chức năng trong nước.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

• Hóa học polyphenol và catechin: Catechin là nhóm flavonoid thuộc nhóm flavan-3-ol, có cấu trúc gồm hai vòng benzen nối với vòng dị vòng chứa oxy. EGCG là một dạng ester của epigallocatechin và acid gallic, có nhiều nhóm hydroxyl giúp tăng khả năng chống oxy hóa.
• Phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm: Sử dụng sóng siêu âm để tăng hiệu quả trích ly các hợp chất polyphenol từ nguyên liệu thực vật, giảm thời gian và nhiệt độ chiết xuất, hạn chế sự phân hủy các hợp chất nhạy cảm với nhiệt.
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Được sử dụng để phân tích độ tinh khiết và định lượng các hợp chất EGCG, catechin và acid gallic với độ chính xác cao.
• Tiêu chuẩn ISO 13528: Áp dụng để thiết lập và đánh giá chất đối chiếu, đảm bảo tính đồng nhất, ổn định và độ chính xác của chất chuẩn.

Các khái niệm chính bao gồm: chất đối chiếu (reference standard), độ tinh khiết, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng và độ thô của phương pháp phân tích.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Lá trà giống LD 97 thu hoạch tại Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Lâm Đồng trong mùa năng suất cao (tháng 9-11). Nguyên liệu được xử lý diệt men bằng hơi nước, sấy khô ở 40°C, xay nhỏ.
• Phương pháp chiết xuất: So sánh bốn phương pháp chiết xuất polyphenol tổng gồm chiết xuất có hỗ trợ vi sóng, chiết xuất thường bằng đun hồi lưu, chiết xuất có hỗ trợ siêu âm và ngâm trích. Kết quả cho thấy chiết xuất có hỗ trợ siêu âm với ethanol 60° trong 30 phút đạt hiệu suất trích ly khoảng 63,3%, được chọn làm phương pháp chính.
• Phân lập và tinh chế: Dịch chiết được xử lý loại bỏ clorophyll bằng chiết clorofom, loại tannin bằng gelatin 25%, sau đó chiết ethyl acetat và cô quay thu cao thô. Sắc ký cột silica gel và Sephadex LH-20 được sử dụng để phân đoạn và tinh chế các hợp chất EGCG, catechin và acid gallic. Tinh chế cuối cùng bằng sắc ký lỏng điều chế HPLC với cột Phenomenex RP-18.
• Xác định cấu trúc: Sử dụng phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (^1H-NMR, ^13C-NMR) để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập.
• Đánh giá chất lượng và thiết lập chất đối chiếu: Đánh giá độ tinh khiết bằng HPLC với độ tinh khiết trên 95%. Thẩm định phương pháp phân tích về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ tuyến tính (hệ số tương quan r > 0,999), độ đúng (tỷ lệ phục hồi ~99,4%), độ thô và ổn định theo tiêu chuẩn ISO 13528. Đánh giá độ đồng nhất và ổn định qua phân tích ANOVA liên phòng thí nghiệm với ít nhất 3 phòng thí nghiệm tham gia.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Hiệu quả chiết xuất polyphenol: Phương pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm với ethanol 60° trong 30 phút đạt hiệu suất trích ly polyphenol tổng là 12,97% (63,3% so với phương pháp chuẩn), phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm nhằm hạn chế oxy hóa EGCG.
2. Độ tinh khiết các hợp chất phân lập: EGCG, catechin và acid gallic được phân lập với độ tinh khiết lần lượt là 97,14%, 99,69% và 99,76% theo kết quả phân tích HPLC, vượt mức yêu cầu tối thiểu 95% cho chất đối chiếu.
3. Xác định cấu trúc: Các phổ IR, UV, ^1H-NMR và ^13C-NMR của các hợp chất phân lập phù hợp với tài liệu tham khảo, xác nhận thành công cấu trúc hóa học của EGCG, catechin và acid gallic.
4. Thẩm định phương pháp phân tích: Phương pháp HPLC đạt các chỉ tiêu về tính tương thích hệ thống (RSD thời gian lưu < 1%, diện tích pic < 2%), tính đặc hiệu (không có pic tạp), độ tuyến tính với hệ số tương quan r = 0,9999, độ đúng với tỷ lệ phục hồi trung bình 99,4%, và độ thô trong giới hạn cho phép.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả chiết xuất polyphenol bằng siêu âm phù hợp với đặc tính nhạy cảm của EGCG với nhiệt độ cao, giúp bảo toàn hoạt tính sinh học. Độ tinh khiết cao của các hợp chất phân lập cho thấy quy trình sắc ký kết hợp silica gel, Sephadex LH-20 và HPLC điều chế là hiệu quả trong việc tách chiết các hợp chất polyphenol từ lá trà xanh.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, hàm lượng EGCG thu được (> 95% tinh khiết) cao hơn nhiều so với các sản phẩm chiết xuất thô trên thị trường (khoảng 35-52%), đáp ứng yêu cầu làm chất đối chiếu chuẩn trong kiểm nghiệm. Việc thiết lập chất đối chiếu trong nước giúp giảm phụ thuộc vào nhập khẩu, tiết kiệm chi phí và thời gian, đồng thời nâng cao năng lực kiểm nghiệm nội địa.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ hiệu suất chiết xuất các phương pháp, bảng so sánh độ tinh khiết và các chỉ tiêu thẩm định phương pháp phân tích, giúp minh họa rõ ràng tính ưu việt của quy trình nghiên cứu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Ứng dụng quy trình chiết xuất và phân lập EGCG trong sản xuất chất chuẩn nội địa: Khuyến khích các viện nghiên cứu và doanh nghiệp áp dụng phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm kết hợp sắc ký để sản xuất chất đối chiếu EGCG, giảm chi phí nhập khẩu, nâng cao chất lượng kiểm nghiệm. Thời gian triển khai dự kiến 12-18 tháng.
2. Xây dựng hệ thống kiểm soát chất lượng sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh: Sử dụng chất đối chiếu EGCG, catechin và acid gallic đã thiết lập để kiểm tra định tính, định lượng trong thực phẩm chức năng và dược phẩm, đảm bảo an toàn và hiệu quả sản phẩm. Chủ thể thực hiện là các phòng kiểm nghiệm dược phẩm và thực phẩm chức năng.
3. Đào tạo và chuyển giao công nghệ cho các phòng thí nghiệm trong nước: Tổ chức các khóa đào tạo về kỹ thuật chiết xuất, phân lập và thẩm định chất đối chiếu theo tiêu chuẩn ISO, nâng cao năng lực phân tích và kiểm nghiệm. Thời gian thực hiện 6-12 tháng.
4. Khuyến khích nghiên cứu mở rộng về các hợp chất polyphenol khác trong trà xanh: Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất và ứng dụng các hợp chất khác như epicatechin, gallocatechin nhằm đa dạng hóa nguồn chất chuẩn và phát triển sản phẩm mới. Chủ thể thực hiện là các viện nghiên cứu và trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ Hóa học, Dược học, Công nghệ Thực phẩm: Nghiên cứu cung cấp quy trình chiết xuất, phân lập và thẩm định chất đối chiếu EGCG, giúp phát triển đề tài liên quan đến polyphenol và chất chuẩn.
2. Phòng kiểm nghiệm dược phẩm và thực phẩm chức năng: Áp dụng chất đối chiếu EGCG và phương pháp phân tích đã thẩm định để kiểm soát chất lượng sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh, nâng cao độ chính xác và tin cậy kết quả kiểm nghiệm.
3. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng và mỹ phẩm: Sử dụng quy trình chiết xuất và chất đối chiếu để phát triển sản phẩm có hoạt chất EGCG tinh khiết, đảm bảo hiệu quả và an toàn cho người tiêu dùng.
4. Cơ quan quản lý nhà nước về dược phẩm và thực phẩm: Tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm, quản lý chất lượng sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao chọn phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm thay vì vi sóng hay đun hồi lưu?
   Phương pháp siêu âm giúp chiết xuất hiệu quả polyphenol ở nhiệt độ thấp, hạn chế oxy hóa EGCG nhạy cảm với nhiệt độ cao, trong khi vi sóng và đun hồi lưu có thể làm giảm hàm lượng hoạt chất do nhiệt độ cao.

2. Độ tinh khiết trên 95% có ý nghĩa gì trong thiết lập chất đối chiếu?
   Độ tinh khiết cao đảm bảo chất đối chiếu có tính đồng nhất và ổn định, giúp kết quả phân tích chính xác, đáng tin cậy, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế ISO 13528.

3. Phương pháp phân tích HPLC được thẩm định như thế nào?
   Phương pháp được kiểm tra tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ tuyến tính (r=0,9999), độ đúng (tỷ lệ phục hồi ~99,4%) và độ thô, đảm bảo phù hợp cho việc định lượng EGCG và catechin trong mẫu thử.

4. Chất đối chiếu EGCG trong nghiên cứu có thể ứng dụng ở đâu?
   Chất đối chiếu được sử dụng trong kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu, thành phẩm thực phẩm chức năng, dược phẩm chứa chiết xuất trà xanh, làm chuẩn so sánh trong các phép thử định tính và định lượng.

5. Làm thế nào để đảm bảo chất đối chiếu ổn định và đồng nhất?
   Thông qua đánh giá liên phòng thí nghiệm với ít nhất 3 phòng đạt chuẩn GLP hoặc ISO 17025, sử dụng phân tích thống kê ANOVA để kiểm tra độ đồng nhất và ổn định của các lô mẫu chất đối chiếu.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế EGCG, catechin và acid gallic từ lá trà xanh giống LD 97 với độ tinh khiết trên 95%.
• Phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm được lựa chọn tối ưu, bảo toàn hoạt chất nhạy cảm với nhiệt độ.
• Phương pháp phân tích HPLC được thẩm định đầy đủ về tính tương thích, đặc hiệu, tuyến tính và độ đúng, phù hợp làm chuẩn đối chiếu.
• Chất đối chiếu EGCG và catechin được đánh giá đồng nhất, ổn định theo tiêu chuẩn ISO 13528, có thể ứng dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm nội địa.
• Đề xuất áp dụng quy trình và chất đối chiếu trong sản xuất, kiểm soát chất lượng sản phẩm chứa chiết xuất trà xanh, đồng thời đào tạo chuyển giao công nghệ cho các phòng thí nghiệm trong nước.

Tiếp theo, cần triển khai ứng dụng quy trình và chất đối chiếu vào thực tế kiểm nghiệm, đồng thời mở rộng nghiên cứu các hợp chất polyphenol khác nhằm phát triển nguồn chất chuẩn đa dạng, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm và năng lực kiểm nghiệm trong nước. Đề nghị các cơ quan, doanh nghiệp và viện nghiên cứu phối hợp triển khai các giải pháp đã đề xuất để phát huy hiệu quả nghiên cứu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TONG QUANN.3 Thanh phan hóa học có trong lá trà — các tính chất được lý.---- - + 25+ 2+s+£+zs+xzx>scsd 4 1.2 Nhóm hợp chất catechin.--- ¿5-56 SE SxSEEE2E£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEErkrrrrkrkrrrrees 6 1. --- - c1 11310111113 3011111 nu HH kh 9 14 Tình hình nghiên cứu trong TƯỚC. Họ nh vớ 9 1.5 Tổng quan chung về chất chuẩn.---- --¿- + 26 52292 SE2E9E£EE‡E£EE£E£EEEEEEEEEEEEESEEEErkererrrree 10 1. --- --- - + + -- c EEE22026 111010101011 11180 111 1vY KH kg kế 11 1.

Chất chuẩn dược điỂn.-- -- + tt HH HH HH hà nh hi 11 1.2 Các loại chuẩn khác. - - St c k1 SE K1 S1 SE S HH TT TK TT HT TH TT HH 11 1. Mục đích sử dụng chất chuẩn.- :-c- Sc St SE SE SE ExKEE SE S SH TS KH TH HT TT 12 1.53 Sơ lược về bộ tiêu chuẩn ISO Guide.-- + tt tt tt ghe 12 1.4 Một số chất chuẩn phain lap tir duc LGU 03. 13 CHUONG 2: DOI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỨU.-5- 2 5-2 se <se=sesee 14 2.1 Đối tượng nghiên CỨU .--- ¿55% SE SE2E9EEEE9EEEEEEEE 1212121211 11211121 111121111115 11 111111 re.2 Phương pháp nghiÊn CỨU.

Họ TT TT tre 15 2. th nh HH HH Hàn nành nhàn gà 15 2.2 Phân lập, tỉnh chế .-¿- 5S SS2E2 SE 2EEEEEEEEE2EEEE1EE111211E11111. Xác định cấu trúc.4 Xây dựng tiêu chuẩn, thẩm định phương pháp đánh giá chất đối chiếu .5 Thiết lập chất đối chiếu. ¿5-5252 22x EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEETEEETkrrrrkrrrrrke 18 CHƯƠNG 3: KET QUÁ NGHIÊN CỨU.

Q LH TH Thọ Họ Họ Thọ ke 21 3.3 — Xác định cấu trÚC .4 Khảo sát độ tinh khiết của chế pham o. Thắm định phương pháp.1 Tính tương thích hệ thong.2 Tính đặc hiệu của phương pháp.-- -- - 5 111 SH SH HH HH 32 3.3 Độ tuyến tính, hệ số tương quan r, phương trình hồi quy .4 Độ đúng phương pháp.- -- - - << 6 - + 11+ 1* 111 SH HH KH HH HH 35 3. tHx ST HH1 1111111211111 1111111111111.6 Đánh giá chất đối chiếu.2 Xác định giá trị ấn định - Đánh giá chất chuẩn.8 _ Ứng dụng phương pháp phân tích và chất đối chiếu để khảo sát một số sản phẩm có chứa chiết xuất trà xanh trên thị tTƯỜIg.--- -¿- - ¿ SE SE St SE2E9EE 119212135 121112111 11211111 1111111111111 111111. 43 CHƯƠNG 4: KET LUẬN VÀ DE NGHỊ.

53 ĐẶT VAN DE Trà là thức uống có truyền thống từ lâu đời trong nhiều nên văn hóa trên thế giới (Trung Quốc, Nhật Ban,. Ngày nay, các nhà nghiên cứu khoa học đã chứng minh trong trà có nhiều thành phần có lợi cho sức khỏe như các hợp chất polyphenol đặc biệt là nhóm catechins (epicatechin, epigallocatechin, epigallogatechin gallat,.) là những chất chống oxy hóa cao (gấp 100 lần so với acid ascorbic). Ngoài ra, epigallocatechin gallat được nhiều công trình nghiên cứu công bố về khả năng kìm hãm sự phát triển của các tế bào ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phôi [12],[15],[16],[17],[18] Acid gallic là một acid hữu co thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá tra và nhiều loai thực vật khác, nó có thé ở dạng tự do hay ở dạng một phan cua tannin. Acid gallic có tinh kháng khuẩn, kháng nam, nó cũng là chat chống oxy hóa và có kha năng kháng tế bào ung thu ma không làm tốn hại đến các tế bào lành.

Đặc điểm chiết xuất thiên nhiên và an tòan vì vậy ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của nhóm hợp chất này là khả năng chống oxy hóa nên được sử dụng nhiều trong lãnh vực thực phẩm và mỹ phẩm [9] Các dé tài nghiên cứu trước đây [3].I6] đều khảo sát các phương pháp tối ưu để trích ly epigallocatechin gallat từ trà xanh và khảo sát họat tính của cao thô nhưng chưa tạo ra sản phẩm có độ tinh khiết cao để phù hợp làm chuẩn đối chiếu chiết từ được liệu. Hiện nay, phan lớn chất chuẩn đang sử dụng trong nước chủ yếu phải nhập từ nước ngoài (chuẩn USP, Chromadex, Wako Pure Chemicals.) với giá thành cao và thổi gian đặt hàng kéo dài vài tuần đến vài tháng. Trong khi đó ở Việt Nam, bên cạnh hệ thống chất chuẩn do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương và Viện Kiểm Ngiệm Thuốc TP.HCM thiết lap, một số cơ sở khoa học cũng được phân lập được chất chuẩn từ được liệu nhưng việc sử dụng còn hạn chế trong phạm vi cơ sở và chưa được thâm định đủ. Vì vậy cần phải xây dựng hệ thống chất chuẩn với chất lượng cao hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phạm vi cả nước, giúp tiết kiệm chỉ Trang | 1 phí, thời gian mua chuẩn từ nước ngoài nhưng vẫn đảm bảo kết quả kiểm nghiệm đáng tin cậy và hiệu quả để làm cơ sở kiểm tra chất lượng chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng.

Xuất phát từ thực tế đó, trên cơ sở tham khảo tài liệu kết hợp các điều kiện thực nghiệm, trong luận văn nay chúng tôi chiết xuất cô lập, tinh chế và thiết lập chất đối chiếu epigallocatechin gallat, catechin, gallic acid nhăm cung cấp chất đối chiếu đạt yêu cầu phục vụ cho việc kiểm soát chất lượng sản phẩm có trà xanh lưu hành trên thị trường. Trang | 2 CHUONG 1: TONG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về trà [1],[6].[7] Tên khoa học: Camellia sinensis (L.Kuntze Trà thuộc lớp Ngọc lan (hai lá mam) Magnoliopsida, bộ Tra Theales, ho Tra Theaceae, chi Tra Camellia (Thea. Cây trà sinh trưởng trong điều kiện tự nhiên chỉ có một thân chính, chia làm 3 loại: thân 26, than bui, than nho (ban gỗ). Cành trà do mam sinh dưỡng phát trién thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài biến đổi nhiều từ 1 — 10cm.

Đốt trà càng dài là biểu hiện của giống trà có năng suất cao. Lá trà mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích thước thay đổi tùy giống. Lá tra có gần rất rõ, rìa lá có răng cưa. Búp trà là giai đoạn non của một cành trà, được hình thành từ các mầm dinh dưỡng, gdm có tôm (phan lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non Trà là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất lâu 60 — 100 năm, tuổi thọ kinh tế tối đa là 50 — 60 năm tùy vào điều kiện môi trường và phương pháp trồng, cho năng suất cao vào mùa mưa từ tháng 5 — 11, sau 10 — 15 ngày thì thu hoạch một lần.

Trà nguyên liệu sử dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là 1 tôm và 2 — 3 lá non. 12 Phân bỗ Trà được trồng nhiều tại các vành đai á nhiệt đới, khu vực có khí hậu ôn hòa, âm ướt. Hiện nay, trà được trồng ở hơn 30 nước, các nước sàn xuất và xuất khẩu nhiều trà nhất là: Trung Quốc, An Độ, Sirlanca, Nhật Bản,.Ở Việt Nam tra được trồng phố biến ở các tỉnh miền núi phía Bac ( Lai Châu, Hoàng Liên Sơn.), các vùng trung du (Vĩnh Phúc, Yên Bái.) vùng Tây Nguyên (Lâm Đồng, Gia Lai, Kom Tum). Thành phan hóa học có trong lá trà — các tính chất được lý [3].1: Thành phần hóa học có trong lá trà Thành phần % khối lượng chất khô Catechin 25 — 30 (-)-Epigallocatechin gallat $— 12 (-)-Epicatechin gallat 3-6 (-)-Epigallo catechin 3-6 (-)-Epicatechin 1-3 (+)-Catechin 1-2 (+)-Gallo catechin 3-4 Flavonol va flavonol glucoside 3-4 Polyphenolic acid 3-4 Leucoanthocyanin 2-3 Chlorophyll và các chat màu khác 05-06 Khóang 5-6 Caffein 3-4 Theobromin 02 Theophyllin 05 Amino acid 4—5 Acid hữu cơ 05-06 Trang | 4 Monosaccharide 4-5 Polysaccharide 14-22 Cellulose và hemicellulose 4— 7 Pectin 5-6 Lignin 5-6 Protein 14-17 Lipid 3-5 1.1 Acid gallic [6],[10],[11] Acid gallic là một acid hữu co thuộc nhóm acid trihydroxybenzoic có trong lá tra và nhiều loai thực vật khác đặc biệt trong củ tỏi, giúp làm giảm cholesterol trong máu.

Ngoai ra, acid gallic lam gia tăng phóng thích insulin tự do trong máu, tăng cường chuyền hóa glucose trong gan, làm giảm lượng đường trong máu va trong nước tiểu. Acid gallic có khả năng ức chế 70 lọai vi khuẩn gram (-) va gram (+), khang virus như cúm, cam lạnh. Nó có họat tính kháng viêm mạnh, dùng chữa dau thần kinh, phong thấp, đau hệ cơ và phần lưng dưới. HO OH OH Hình 1.1: Cau tạo của acid galic Trang | 5 1.2 Nhóm hợp chất catechin|I I | Catechin cua trà thuộc họ flavonoid, nhóm flavan-3-ol, phân tử có 15 carbon bao gdm hai vòng 6 carbon A va B được nối bởi 3 đơn vi carbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử oxy.

Cau trúc của catechin có chứa hai carbon bat đôi ở vi trí 2 và 3, không chứa nôi đôi ở vi trí 2,3 và nhóm 4-oxo Hình 1.2: Cấu tạo khung cơ bản của catechin Các catechin được chia thành 2 nhóm: nhóm catechin tự do bao gom GC, EC, EGC (vi trí carbon số 3 có chứa nhóm thé hydroxyl) và nhóm đã bi ester hóa hay nhóm galloyl catechin : ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí carbon số 3 được thay bang một nhóm gallat). Các hợp chất catechin trong lá trà tác dụng với FeCla cho kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong phân tử. Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, aceton, ethyl acetat tao dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực hoặc ít phân cực như benzene hoặc chloroform Các hợp chất trong nhóm catechin: Trang | 6 OH OH OH OH H 9 vu OH H OH (+)- Catechin C¡zH¡4Os (-)-Epicatechin C1sH1406 OH OH OH OH H HO O ww. OH OH H OH OH (-)-Epigallocatechin C1sHi407 (+)-Gallocatechin C1sH1407 Trang | 7 (-)-Epigcatechin gallat C22Hi14010 (-)-Epigallocatechin gallat C22HisO1n Hình 1.3: Cấu tạo các hợp chất trong (+/-) catechin Hàm lượng catechin trong búp trà cao nhất khỏang 30 % khối lượng khô.

Trong các hợp chất catechin được tim thấy trong trà, thành phân gallat là chiếm đa số (trên 80 % tong catechin), ngòai ra các hợp chất catechin còn được tìm thấy trong cacao, nho, táo, hành,. Hàm lượng các catechin trong là trà luôn thay đồi, phụ thuộc vào giống trà, thời kỳ sinh trưởng, vị trí các lá trên búp trà và các yếu tố khác về tho nhưỡng. Trong quá trình phát triển của lá trà, dưới tác dụng của enzyme các catechin bị chuyên hóa dan thành các hợp chat tannin và giảm dan hàm lượng trong lá trưởng thành. Công thức cấu tạo catechin với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm ở các catechin, 6 nhóm ở các gallocatechin, 8 nhóm ở các catechin gallat và 9 nhóm ở các gallocatechin gallat) đảm bảo khả kháng oxy hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin.

Nhóm hợp chất catechin có khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nhóm chất này còn được quan tâm sử dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm.