Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sâu khoang (Spodoptera litura) thuộc họ Ngài đêm (Noctuidae), bộ Cánh vẩy (Lepidoptera), là đối tượng dịch hại nguy hiểm trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Đây là loài côn trùng đa thực có phổ ký chủ rất rộng, phá hoại trên 290 loài cây trồng thuộc 99 họ thực vật khác nhau, đặc biệt gây tổn thất nghiêm trọng trên các loại cây thực phẩm, hoa màu như đậu nành, bắp, cải xanh, bắp cải, rau muống, đậu phộng, khoai lang và ớt. Tập tính ăn tạp của sâu non tuổi lớn cùng mật độ cá thể cao làm xơ xác tán lá, giảm nghiêm trọng năng suất và phẩm chất nông sản.

Trong thực tiễn canh tác tại TP. Hồ Chí Minh và các khu vực lân cận, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học trong thời gian dài đã dẫn đến hiện tượng sâu khoang kháng thuốc, đồng thời để lại dư lượng độc hại trong nông sản, làm suy thoái môi trường đất, nước và đe dọa trực tiếp sức khỏe cộng đồng. Do đó, việc ứng dụng các tác nhân phòng trừ sinh học an toàn, thân thiện với hệ sinh thái là yêu cầu cấp thiết trong sản xuất nông nghiệp bền vững.

Trong các nhóm tác nhân sinh học, virus đa diện nhân (Nuclear Polyhedrosis Virus - NPV) thuộc họ Baculoviridae được đánh giá là tác nhân có tiềm năng phòng trừ sâu khoang cao, có hiệu lực tương đương thuốc hóa học nhưng có tính chuyên hóa cao, an toàn cho người, gia súc và thiên địch. Tuy nhiên, việc sản xuất virus NPV hiện nay chủ yếu dựa vào phương pháp nhân nuôi in vivo trên sâu ký chủ sống rồi thu nhận virus từ xác sâu chết. Dịch nghiền thô thu nhận từ xác sâu thường chứa tới 90% tạp chất (mô mỡ, mảnh biểu bì, dịch ruột, chất thải) và bị nhiễm lượng lớn vi sinh vật ngoại nhiễm, chỉ có khoảng 10% là thể vùi virus. Tình trạng tạp nhiễm này làm giảm độc lực dịch virus, sinh mùi hôi thối và rút ngắn thời hạn bảo quản chế phẩm. Tại Việt Nam, quy trình ly tâm nhằm tinh sạch dịch gốc virus NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học chưa được hoàn thiện và chuẩn hóa đầy đủ.

Từ yêu cầu thực tiễn đó, đề tài "Xác định phương pháp tinh sạch NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus)" được thực hiện với các nhiệm vụ và mục tiêu cụ thể:

  1. Xác định ảnh hưởng của việc xử lý dịch gốc đến chất lượng và hoạt tính sinh học của virus NPV.
  2. Xác định chế độ ly tâm vòng 1 (tốc độ vòng quay và thời gian) phù hợp để loại bỏ xác sâu, mảnh vụn mô và các thể hòa tan thô mà không làm thất thoát thể vùi virus trong dịch nổi.
  3. Xác định chế độ ly tâm vòng 2 phù hợp nhằm thu gom tối đa thể vùi virus (PIB) vào phần cặn và loại bỏ tối đa lượng vi sinh vật hiếu khí trong phần dịch nổi.
  4. Tối ưu hóa quy trình ly tâm phân đoạn hai lần để nâng cao độ tinh sạch, duy trì mật độ thể vùi và bảo toàn hiệu lực diệt sâu khoang.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Virus đa diện nhân (Spodoptera litura Nuclear Polyhedrosis Virus - SpltNPV), sâu khoang (Spodoptera litura) tuổi 3 và vi sinh vật hiếu khí ngoại nhiễm trong dịch virus.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH).
  • Phạm vi thời gian: Đề tài được thực hiện từ ngày 25/5/2015 đến ngày 17/8/2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và đối tượng sinh học

  • Cấu tạo và cơ chế tác động của Baculovirus/NPV: Virus NPV thuộc họ Baculoviridae, genome là DNA sợi đôi dạng vòng khép kín với trọng lượng phân tử $50 - 100 \times 10^6$ Da. Hạt virus (virion) hình que kích thước $35 - 50 \times 200 - 320\text{ nm}$ được bọc trong các thể vùi đa diện (Polyhedral Inclusion Body - PIB) có bản chất protein kết tinh dạng mạng lưới mắt cáo, kích thước từ $1 - 4\ \mu\text{m}$. Protein thể vùi ổn định ở môi trường trung tính và hòa tan trong dịch ruột giữa của sâu có tính kiềm ($\text{pH} \ge 9{,}5$), giải phóng các virion xâm nhập qua biểu mô ruột vào khoang máu, nhân lên trong nhân tế bào ký chủ và phá hủy toàn bộ cơ quan nội tạng.
  • Nguyên lý phân tách bằng phương pháp ly tâm: Dựa trên sự khác biệt về khối lượng riêng và hệ số lắng giữa các cấu tử trong dịch huyền phù dưới tác dụng của lực ly tâm. Thể vùi PIB có kích thước và tỷ trọng trung bình, nằm giữa kích thước của các mảnh mô tế bào sâu (lớn, nặng) và vi khuẩn hiếu khí/thể hòa tan (nhỏ, nhẹ). Quy trình tinh sạch gồm 2 bước:
    • Ly tâm vòng 1 (tốc độ thấp): Làm lắng các mảnh vụn cơ thể, biểu bì sâu xuống cặn; giữ thể vùi virus lơ lửng trong dịch nổi.
    • Ly tâm vòng 2 (tốc độ cao): Làm lắng toàn bộ thể vùi virus xuống đáy ống nghiệm để thu cặn; giữ các vi sinh vật hiếu khí, protein hòa tan và chất béo lơ lửng trong dịch nổi để loại bỏ.

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu tiến hành 3 nội dung thí nghiệm chính được bố trí ngẫu nhiên:

Thí nghiệm Nghiệm thức (Công thức) Chế độ ly tâm và thu nhận Chỉ tiêu theo dõi
Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng dịch gốc CT1 Ly tâm 1 lần: $6000\text{ vòng/phút}$ trong 15 phút, thu dịch nổi, bỏ cặn. - Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml)
- Hiệu lực diệt sâu (%) qua các ngày
CT2 Ly tâm 2 lần: Vòng 1 ($500\text{ vòng/phút}$, 5 phút, thu dịch); Vòng 2 ($5000\text{ vòng/phút}$, 15 phút, thu cặn hòa lại nước cất).
ĐC Dịch gốc thô không ly tâm.
Thí nghiệm 2: Xác định tốc độ ly tâm vòng 1 CT1, CT2, CT3, CT4, ĐC Ly tâm 5 phút ở các tốc độ: $500$, $1000$, $1500$, $2500\text{ vòng/phút}$; thu dịch nổi. ĐC: không ly tâm. - Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml)
- Mật độ thể vùi (PIB/ml)
- Hiệu lực diệt sâu (%)
Thí nghiệm 3: Xác định tốc độ ly tâm vòng 2 CT5, CT6, CT7 Vòng 1 cố định $500\text{ vòng/phút}$ (5 phút, lấy dịch). Vòng 2 ly tâm 15 phút ở $5000$, $10000$, $12000\text{ vòng/phút}$; thu cặn định mức lại bằng nước cất. - Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml)
- Mật độ thể vùi (PIB/ml)
- Hiệu lực diệt sâu (%)

Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu và nguồn dữ liệu

  • Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí: Áp dụng phương pháp đổ đĩa dựa trên TCVN 5165-1990 có điều chỉnh; môi trường tổng hợp Plate Count Agar (PCA); pha loãng mẫu theo dãy thập phân trong nước muối sinh lý $0{,}85%$; cấy 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 3 đĩa lặp lại; ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ và đếm các khuẩn lạc trong khoảng 25–250 CFU/đĩa. Mật độ tính theo công thức: $$A\ (\text{CFU/ml}) = \frac{N}{n_1 V f_1 + \dots + n_i V f_i}$$
  • Định lượng thể vùi virus (PIB/ml): Sử dụng kính hiển vi quang học và buồng đếm hồng cầu (chiều dày $0{,}1\text{ mm}$, thể tích mỗi ô nhỏ là $1/4000\text{ mm}^3$). Mẫu được pha loãng bậc 10, quan sát ở vật kính 40X, đếm theo đường zigzag trên 5 ô lớn (tương ứng 80 ô nhỏ). Mật độ PIB tính theo công thức: $$N\ (\text{PIB/ml}) = \frac{A \cdot n \cdot 4000 \cdot 1000}{B}$$ (Trong đó: $A$ là tổng số thể vùi trong 5 ô lớn; $B = 80$ là tổng số ô nhỏ; $n$ là độ pha loãng).
  • Đánh giá hiệu lực sinh học diệt sâu: Sử dụng phương pháp lây nhiễm bề mặt trên thức ăn nhân tạo (FAO, 2011; Lawrence et al., 2007). Thành phần thức ăn nhân tạo gồm: đậu trắng ($200\text{ g}$), tinh bột tan ($30\text{ g}$), men mì ($30\text{ g}$), ascorbic acid ($3\text{ g}$), methyl-paraben ($1{,}9\text{ g}$), sorbic acid ($1\text{ g}$), formalin ($2\text{ cc}$), agar ($4\text{ g}$), nước cất ($400\text{ ml}$). Quét đều $1\text{ ml}$ dịch virus nồng độ $4 \times 10^6\text{ PIB/ml}$ lên bề mặt thức ăn trong hộp nhựa kích thước $20 \times 12 \times 7\text{ cm}$. Thả 20 sâu non tuổi 3 khỏe mạnh cho mỗi nghiệm thức, lặp lại 3 lần. Sâu ăn thức ăn chứa virus trong 2 ngày, sau đó chuyển sang thức ăn sạch và theo dõi tỷ lệ chết hàng ngày. Tỷ lệ hiệu lực trừ sâu được hiệu chỉnh theo công thức Abbott (1925): $$H\ (%) = \left(1 - \frac{T}{C_0}\right) \times 100$$ (Trong đó: $T$ là số sâu sống ở nghiệm thức xử lý; $C_0$ là số sâu sống ở nghiệm thức đối chứng quét nước cất vô trùng).
  • Xử lý số liệu: Tính toán giá trị trung bình và phân tích thống kê trên phần mềm Microsoft Excel 2010 và Statgraphics Centurion XVI.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Phần mở đầu nêu rõ tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ tác hại của sâu khoang Spodoptera litura đối với hơn 290 loài cây trồng tại TP. Hồ Chí Minh và các vùng lân cận. Tác giả phân tích những hạn chế của biện pháp hóa học và ưu thế của chế phẩm sinh học virus NPV. Đặt ra vấn đề then chốt: dịch nhân nuôi NPV trên cơ thể sâu bị tạp nhiễm nặng bởi vi sinh vật và xác sâu làm giảm chất lượng chế phẩm, trong khi công nghệ ly tâm tinh sạch NPV trong nước chưa được chuẩn hóa. Mục tiêu của đồ án là tìm ra quy trình ly tâm phân đoạn thích hợp để giảm thiểu vi sinh vật hiếu khí và thu nhận tối đa mật độ thể vùi PIB.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp toàn diện các nghiên cứu trong và ngoài nước:

  • Đặc điểm sâu khoang: Trình bày vòng đời sâu khoang ($35 - 40\text{ ngày}$), giai đoạn sâu non ($20 - 25\text{ ngày}$, trải qua 5–6 tuổi), giai đoạn nhộng ($7 \pm 1\text{ ngày}$) và giai đoạn bướm (đẻ $300 - 2000\text{ trứng}$). Mô tả tập tính cắn phá mạnh vào ban đêm, xu tính với mùi chua ngọt và ánh sáng bước sóng ngắn. Phân tích các nhóm thiên địch (bọ rùa, kiến, ong ký sinh Cotesia prodeniae, Telenomus remus) và các biện pháp phòng trừ canh tác, hóa học, IPM, sinh học.
  • Khái quát về virus diệt côn trùng: Tổng hợp lịch sử phát hiện virus trên côn trùng từ thời cổ đại đến các công trình của Cornilia, Maestri (1856), Bolle (1898), Akkva (1919), Bergold (1943–1947). Phân loại các họ virus côn trùng chính: Baculoviridae (NPV, GV), Reoviridae (CPV), Iridoviridae, Parvoviridae (Densovirus), Picornaviridae, Rhabdoviridae (Sigmavirus), Ascoviridae.
  • Cấu trúc và sinh học virus NPV: Chi tiết hóa cấu tạo thể vùi đa diện (polyhedra) kích thước $1 - 4\ \mu\text{m}$, cấu tạo nucleocapsid đường kính $40\text{ nm}$, dài $350\text{ nm}$, lõi Deoxyribo Nucleo Protein (DNP) đường kính $32\text{ nm}$. Trình bày 3 giai đoạn xâm nhiễm (tiềm ẩn $6 - 12\text{ giờ}$, tăng sinh $12 - 48\text{ giờ}$, tạo thể vùi sau $48\text{ giờ}$), thời gian ủ bệnh ($3 - 12\text{ ngày}$), con đường lây truyền ngang (qua thức ăn, phân, xác thối) và lây truyền dọc (qua trứng).
  • Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính virus: Bức xạ tia tử ngoại (UV bước sóng $215 - 216\text{ nm}$ sinh gốc peroxide bất hoạt virus), nhiệt độ cao (trên $32^\circ\text{C}$ làm chậm bệnh, $40^\circ\text{C}$ làm mất triệu chứng), độ pH (bất hoạt ở $\text{pH} = 2$ ngay lập tức, $\text{pH} = 4$ trong 1 giờ, sống sót ở $\text{pH} = 6$).
  • Phương pháp ly tâm tinh sạch: Tổng kết các chế độ ly tâm của các tác giả quốc tế như Ignoffo (1992: vòng 1 $500\text{ vòng/phút}$, vòng 2 $12000\text{ vòng/phút}$), Jiang jie-Xian và Liu Juin-Jun (2002: $1000\text{ vòng/phút}$ và $7000\text{ vòng/phút}$), Kao và Meher (2004: $1000\text{ vòng/phút}$ và $5000\text{ vòng/phút}$), Flávío et al. (1997: $1500\text{ vòng/phút}$ và $7000\text{ vòng/phút}$), Arivudainambi et al. (2000: $6000\text{ vòng/phút}$/1 lần), Kiều Trang et al. (2002: $6000\text{ vòng/phút}$ trong 1 giờ).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết hệ thống trang thiết bị (buồng đếm hồng cầu, kính hiển vi, máy ly tâm, máy lắc, nồi hấp, tủ cấy vô trùng), hóa chất (PCA, methyl-paraben, sorbic acid, ascorbic acid, formalin) và địa điểm nghiên cứu tại PTN HUTECH. Thiết lập cụ thể quy trình chế biến môi trường thức ăn nhân tạo cho sâu khoang, phương pháp nhân nuôi dịch gốc virus in vivo trên sâu tuổi 4, phương pháp cấy đổ đĩa định lượng vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 5165-1990, kỹ thuật đếm thể vùi trên buồng đếm hồng cầu ở độ phóng đại 40X và phương pháp thử nghiệm sinh học lây nhiễm trên sâu tuổi 3 với mật độ chuẩn $4 \times 10^6\text{ PIB/ml}$ theo công thức Abbott.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương này phân tích các chuỗi số liệu thực nghiệm thông qua hệ thống bảng biểu và đồ thị:

  • Ảnh hưởng của dịch gốc đến hiệu quả nhân NPV (Thí nghiệm 1): So sánh giữa dịch thô không ly tâm (ĐC), ly tâm 1 lần $6000\text{ vòng/phút}$ (CT1) và ly tâm 2 lần (CT2: $500\text{ vòng/phút}$ và $5000\text{ vòng/phút}$). Kết quả cho thấy phương pháp ly tâm 2 lần giúp loại bỏ đáng kể lượng tạp khuẩn hiếu khí, hạn chế hiện tượng ôi thối dịch virus và duy trì hiệu lực gây chết sâu khoang ổn định hơn so với dịch thô không qua xử lý.
  • Xác định số vòng ly tâm vòng 1 (Thí nghiệm 2): Khảo sát các mức tốc độ $500$, $1000$, $1500$, $2500\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút để thu dịch nổi. Ở tốc độ $500\text{ vòng/phút}$, các mảnh vụn xác sâu, mô liên kết thô lắng xuống cặn mà không kéo theo thể vùi virus, giữ lại mật độ PIB trong dịch nổi cao nhất. Khi tăng tốc độ ly tâm lên $1000 - 2500\text{ vòng/phút}$, một lượng đáng kể thể vùi PIB bị kết tủa sớm cùng với xác sâu vào phần cặn, dẫn đến thất thoát mật độ virus trong dịch nổi. Do đó, chế độ $500\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút được xác định là tối ưu cho ly tâm vòng 1.
  • Xác định số vòng ly tâm vòng 2 (Thí nghiệm 3): Khảo sát các mức tốc độ $5000$, $10000$, $12000\text{ vòng/phút}$ trong 15 phút trên dịch nổi thu được từ vòng 1. Ở tốc độ $10000$ và $12000\text{ vòng/phút}$, hầu hết thể vùi PIB lắng hoàn toàn xuống đáy tạo thành cặn kết tủa chặt, cho phép loại bỏ phần dịch nổi chứa vi khuẩn hiếu khí tự do, chất béo và protein hòa tan. Định mức lại phần cặn thu được bằng nước cất vô trùng giúp mật độ thể vùi PIB đạt giá trị cao, giảm thiểu mật độ vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml) và đạt hiệu lực diệt sâu khoang cao sau 3–7 ngày lây nhiễm.
  • Tối ưu hóa quy trình ly tâm tinh sạch NPV: Tổng hợp và so sánh toàn diện 3 chỉ tiêu (tổng vi sinh vật hiếu khí, mật độ PIB và hiệu lực diệt sâu sinh học), xác lập công thức ly tâm 2 giai đoạn tối ưu: Vòng 1 ly tâm $500\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút (lấy dịch nổi), sau đó chuyển dịch nổi sang ly tâm vòng 2 ở tốc độ $10000 - 12000\text{ vòng/phút}$ trong 15 phút (thu cặn, loại dịch nổi).

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp các kết luận khoa học rút ra từ các thí nghiệm thực nghiệm và đưa ra các kiến nghị kỹ thuật nhằm ứng dụng quy trình tinh sạch dịch gốc virus NPV vào quy mô sản xuất thử nghiệm chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học.

Kết quả và đóng góp

Kết quả nghiên cứu chính

  • Xác định được phương pháp ly tâm 2 lần là phương thức hiệu quả nhất để tinh sạch dịch virus NPV từ sâu khoang bị bệnh.
  • Xác định chế độ ly tâm vòng 1 tối ưu ở mức $500\text{ vòng/phút}$ trong thời gian 5 phút: chế độ này loại bỏ triệt để cặn xác sâu lớn, mảnh biểu bì thô mà không làm lắng thể vùi PIB, bảo toàn tối đa số lượng virus trong phần dịch nổi.
  • Xác định chế độ ly tâm vòng 2 tối ưu ở mức $10000 - 12000\text{ vòng/phút}$ trong thời gian 15 phút: chế độ này giúp kết tủa hoàn toàn thể vùi PIB xuống phần cặn, loại bỏ tối đa các vi sinh vật hiếu khí tạp nhiễm và các chất béo, dịch mô hòa tan theo phần dịch nổi.
  • Chứng minh dịch virus NPV sau khi qua quy trình ly tâm 2 giai đoạn đạt mật độ PIB cao, giảm thiểu lượng vi khuẩn hiếu khí (CFU/ml) so với dịch thô ban đầu và duy trì hiệu lực gây chết cao trên sâu khoang tuổi 3 khi lây nhiễm nhân tạo ở mật độ $4 \times 10^6\text{ PIB/ml}$.

Đóng góp thực tiễn và học thuật

  • Cung cấp các thông số kỹ thuật cụ thể về tốc độ và thời gian ly tâm phân đoạn phục vụ công đoạn tinh sạch dịch gốc virus NPV tại Việt Nam.
  • Thiết lập quy trình tiền xử lý dịch thô giúp khắc phục hiện tượng ôi thối, giảm độc lực và hư hỏng dịch gốc do tạp khuẩn trong quá trình lưu trữ, nhân sinh khối và sản xuất chế phẩm sinh học BVTV.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Nghiên cứu chỉ tập trung đánh giá nhóm chỉ tiêu vi sinh vật hiếu khí tổng số trên môi trường PCA; chưa phân lập và định danh chi tiết các loài vi khuẩn, vi nấm cụ thể trong dịch tạp nhiễm.
  • Các thí nghiệm mới chỉ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm với dung tích mẫu nhỏ trong ống falcon/eppendorf, chưa kiểm chứng trên các hệ thống máy ly tâm công nghiệp công suất lớn.
  • Thời gian theo dõi hiệu lực sinh học tập trung trên sâu non tuổi 3 trong điều kiện phòng thí nghiệm ($25 - 28^\circ\text{C}$), chưa tiến hành thử nghiệm diện rộng ngoài đồng ruộng chịu tác động của bức xạ mặt trời (UV) và biến động nhiệt độ tự nhiên.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Khảo sát việc bổ sung các chất phụ trợ chống tia cực tím, chất kháng khuẩn, kháng oxy hóa để kéo dài thời gian bảo quản chế phẩm virus NPV sau khi tinh sạch.
  • Nghiên cứu mở rộng quy trình ly tâm trên các thiết bị phân ly công nghiệp liên tục nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học SpltNPV quy mô bán công nghiệp.
  • Thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của dịch virus sau tinh sạch trên các mô hình canh tác rau màu ngoài đồng ruộng thực tế.

Giá trị tham khảo

Đồ án tốt nghiệp là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

  • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Bảo vệ Thực vật, Nông học, Vi sinh vật học ứng dụng và Quản lý Dịch hại Nông nghiệp (IPM).
  • Cán bộ nghiên cứu tại các viện, trung tâm nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học, phòng thí nghiệm sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.
  • Các phần có giá trị tham khảo kỹ thuật cao:
    • Công thức và quy trình chế biến thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang (Spodoptera litura) trong phòng thí nghiệm.
    • Phương pháp chuẩn hóa thao tác đếm thể vùi virus bằng buồng đếm hồng cầu kết hợp công thức toán học tính mật độ PIB/ml.
    • Quy trình thử nghiệm sinh học đánh giá hiệu lực diệt sâu theo phương pháp lây nhiễm bề mặt và xử lý số liệu theo công thức Abbott.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao không thể sử dụng trực tiếp dịch nghiền xác sâu chết mà bắt buộc phải qua công đoạn ly tâm tinh sạch?
Dịch nghiền thô từ xác sâu chết chỉ chứa khoảng 10% là thể vùi virus NPV, 90% còn lại là tạp chất gồm mảnh biểu bì, mô mỡ, chất thải và mật độ vi sinh vật ngoại nhiễm rất cao (vi khuẩn hiếu khí, vi nấm gây thối). Các thành phần này gây phân hủy, làm thối rữa dịch virus, làm giảm độc lực và gây khó khăn lớn cho quá trình bảo quản chế phẩm.

2. Nguyên lý phân tách của quy trình ly tâm 2 lần trong đồ án là gì?
Quy trình dựa trên sự khác biệt về kích thước và khối lượng riêng của các thành phần trong dịch:

  • Vòng 1 ($500\text{ vòng/phút}$, 5 phút): Lắng các mảnh xác sâu, mô cơ lớn xuống đáy; thể vùi virus (PIB) có kích thước nhỏ hơn vẫn lơ lửng trong dịch nổi nên thu lấy dịch nổi, loại bỏ cặn.
  • Vòng 2 ($10000 - 12000\text{ vòng/phút}$, 15 phút): Tốc độ quay cao tạo lực ly tâm lớn làm lắng toàn bộ thể vùi PIB xuống đáy; vi khuẩn hiếu khí tự do và các chất hòa tan nhẹ hơn vẫn lơ lửng trong dịch nổi nên loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn chứa virus và hòa lại bằng nước cất vô trùng.

3. Vì sao không chọn tốc độ ly tâm vòng 1 cao hơn (như 1500 hay 2500 vòng/phút)?
Khi ly tâm ở tốc độ cao từ $1500 - 2500\text{ vòng/phút}$ ngay từ vòng 1, lực ly tâm lớn sẽ làm một lượng đáng kể thể vùi PIB bị kết tủa sớm cùng với xác sâu và lắng xuống cặn, dẫn đến thất thoát mật độ virus trong phần dịch nổi cần thu nhận. Tốc độ $500\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút là vừa đủ để tách mảnh mô thô mà vẫn giữ nguyên vẹn mật độ virus trong dịch nổi.

4. Mật độ lây nhiễm virus và tuổi sâu nào được sử dụng trong các thử nghiệm sinh học của đề tài?
Thử nghiệm sinh học sử dụng sâu khoang non ở tuổi 3 (nuôi từ ổ trứng trên lá thầu dầu trước khi chuyển sang thức ăn nhân tạo) và mật độ lây nhiễm virus chuẩn quét trên bề mặt khối thức ăn nhân tạo là $4 \times 10^6\text{ PIB/ml}$ (quét $1\text{ ml}$ dịch cho mỗi hộp nghiệm thức nuôi 20 sâu).

5. Thành phần chính trong công thức thức ăn nhân tạo nuôi sâu khoang của đề tài gồm những gì?
Công thức thức ăn nhân tạo (theo M. Sorour et al., 2011) gồm: Đậu trắng ($200\text{ g}$), tinh bột tan ($30\text{ g}$), men mì ($30\text{ g}$), ascorbic acid ($3\text{ g}$), methyl-paraben ($1{,}9\text{ g}$), sorbic acid ($1\text{ g}$), formalin ($2\text{ cc}$), agar ($4\text{ g}$) và nước cất ($400\text{ ml}$).

Kết luận

Đồ án tốt nghiệp của sinh viên Trương Hùng Phong đã giải quyết thành công vấn đề kỹ thuật trong việc làm sạch dịch gốc virus đa diện nhân (Spodoptera litura NPV) nhân nuôi in vivo. Nghiên cứu đã xác lập quy trình ly tâm phân đoạn 2 bước tối ưu gồm: ly tâm vòng 1 ở $500\text{ vòng/phút}$ trong 5 phút (thu dịch nổi) và ly tâm vòng 2 ở $10000 - 12000\text{ vòng/phút}$ trong 15 phút (thu cặn thể vùi). Kết quả đạt được giúp giảm thiểu đáng kể vi khuẩn hiếu khí ngoại nhiễm, bảo toàn mật độ thể vùi PIB và duy trì hiệu lực diệt sâu khoang tuổi 3, tạo cơ sở thực nghiệm quan trọng cho việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học NPV quy mô lớn.