ĐẶT VẤN ĐỀ Colistin được đưa vào sử dụng từ những năm 1940, bị cấm sử dụng trên người vào những năm 1970 do xuất hiện sớm độc tính thận và thần kinh sau khi dùng thuốc đường tĩnh mạch. Độc tính trên thận phụ thuộc vào liều lượng thuốc. Hiện nay colistin được sử dụng như là liệu pháp cứu cánh trên những bệnh nhân nhiễm trùng đe dọa tính mạng gây ra bởi các chủng vi khuẩn Gram (-) đa kháng [3]. Colistin được sử dụng dưới dạng tiền thuốc natri colistin methansulfonat (CMS), một tiền chất không có hoạt tính của colistin, có thể làm giảm độc tính của colistin khi dùng đường tiêm [5].
Sau khi vào cơ thể, CMS được chuyển đổi thành chất có hoạt tính diệt khuẩn là colistin A và colistin B khi ở pH sinh lý. Độc tính, đặc biệt là độc tính trên thận khi sử dụng colistin chủ yếu liên quan với lượng CMS tích lũy hơn so với liều đơn độc hay liều cụ thể hằng ngày, và thường gặp hơn ở những bệnh nhân giảm albumin máu hay có sử dụng đồng thời với các thuốc chống viêm không steroid (NSAID) [54]. CMS thải trừ chủ yếu qua thận do đó CMS có thể tích lũy đáng kể nếu chức năng thận bị suy giảm, trong khi một phần trải qua quá trình thủy phân in vivo thành các dạng colistin A và B, được đào thải chủ yếu bằng cơ chế ngoài thận. Các mô hình thực nghiệm đã chứng minh rằng tỷ lệ diện tích dưới đường cong nồng độ thuốc theo thời gian trên nồng độ ức chế tối thiểu (AUC/MIC) hoặc nồng độ đáy trên MIC (C trough/MIC) là thông số dược lực học dự đoán tốt nhất hiệu quả của colistin.
Định lượng CMS ở những bệnh nhân nặng bị rối loạn chức năng thận, bao gồm liệu pháp thay thế thận (lọc máu ngắt quãng hoặc lọc/thẩm tách máu liên tục), và/hoặc suy gan cũng như sự phơi nhiễm toàn thân của CMS dạng khí dung là cần thiết. Trong những điều kiện này, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng mạnh đến dược động học/dược lực học (PK/PD) của CMS và colistin A/B. Do đó dẫn tới sự biến thiên giữa các cá thể, nồng độ trong huyết tương có thể ảnh hưởng đến hiệu quả (tức là thất bại trong điều trị do dùng thiếu liều dẫn đến nồng độ thấp) hoặc an toàn (tức là độc tính do dùng quá liều dẫn đến nồng độ cao). Thông tin về nồng độ trong huyết tương của colistin A/B và CMS cần được xác định thường quy trên thực hành lâm sàng nhằm tối ưu hóa chế độ liều trên những bệnh nhân nhiễm trùng đe dọa tính mạng thông qua giám sát nồng độ thuốc trong máu (TDM), qua đó nâng cao hiệu quả điều trị và giảm thiểu độc tính trên bệnh nhân cũng như khả năng phát triển đề kháng.
Để tối ưu sử dụng trên thực hành lâm sàng, nồng độ colistin A/B và CMS trong huyết tương cần thiết nằm trong khoảng giữa ngưỡng hiệu quả (ví dụ: nồng độ đáy colistin trong huyết tương cao hơn MIC in vitro vi khuẩn đa kháng) và ngưỡng độc đối với thận và thần kinh. 1 Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được phát triển để định lượng CMS, colistin A, B như sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLC) [26 , 27, 49, 50], sắc ký lỏng 2 lần khối phổ (LC-MS/MS) [28, 42, 43, 34], …Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về xây dựng cũng như thẩm định phương pháp định lượng CMS, và colistin A, B được công bố. Nồng độ colistin A, B trong máu thấp, cùng với đó nền mẫu lại có nhiều thành phần phức tạp có thể gây ảnh hưởng tới quá trình phân tích, cũng như là thách thức cho nghiên cứu. Để phục vụ cho TDM, đòi hỏi phương pháp định lượng colistin A, B cần phải có tính thực tiễn cao, chuẩn bị đơn giản và nhanh chóng, thời gian phân tích mẫu ngắn, giới hạn định lượng dưới (LLOQ) thấp (khoảng 0,01 µg/ml để đánh giá nồng độ colistin trong huyết tương trường hợp vi khuẩn nhạy cảm nồng độ ức chế tối thiểu 0,01 – 4 µg/ml) [52, 53], giới hạn trên của định lượng (ULOQ) đủ cao (khoảng 10 µg/ml để đánh giá được trường hợp dùng thuốc trên bệnh nhân phát sinh đề kháng nồng độ ức chế tối thiểu lên tới 8 µg/ml) [54], do vậy khoảng tuyến tính kì vọng 0,01 – 10 µg/ml; cùng với đó được thẩm định theo các tiêu chí của các hướng dẫn nhằm đảm bảo độ tin cậy, phù hợp với điều kiện thực tế để áp dụng thành công trên lâm sàng.
Mặt khác, phương pháp LC-MS/MS có sự vượt trội về độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Colistin methansulfonat trong huyết tương bằng LC-MS/MS” với 2 mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng colisin A/B và CMS trong huyết tương bằng LC-MS/MS. Ứng dụng LC-MS/MS trong định lượng nồng độ colistin A và B, tiền thuốc CMS trong huyết tương nhằm cá thể hóa liều dùng cho bệnh nhân.
Tổng quan về colistin methansulfonat 1. Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa của CMS 1. Công thức cấu tạo Hình 1. Công thức hóa học của CMS Tên khoa học: N-[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-4-amino-1-oxo-1- [[(3S,6S,9R,12S,15R,18S,21S)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1R)-1-hydroxyethyl]-12,15- bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos- 21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]-6- methyloctanamide 1.
Tính chất lý hóa Định nghĩa: CMS được điều chế từ colistin bằng tác dụng của formaldehyde và natri hydro sulfit. Sản phẩm bán tổng hợp có nguồn gốc từ một sản phẩm lên men. Hình thức: Bột hút ẩm màu trắng hoặc gần như trắng. Độ tan: rất dễ tan trong nước, ít tan trong etanol (96%), thực tế không tan trong aceton.
PH: 6,5- 8,5 Góc quay cực riêng: (-46)-(-51)° (Chất đã làm khô) (BP 8, USP 43). Cấu trúc hóa học colistin, colistin methansulfonat liên quan đến phân tích và cấu trúc vi khuẩn (a) (b) Hình 1. Cấu trúc hóa học colistin A, colistin B, CMS Đường tiêm, colistin được sử dụng dưới dạng natri colistin methansulfonat (CMS), một tiền chất không có hoạt tính của colistin. CMS được điều chế từ colistin bằng phản ứng của các nhóm γ-amin tự do của gốc Dab với formaldehyde sau đó là natri bisulfit.
Do đó, ở pH sinh lý, CMS là một polyanion. CMS có thể được sử dụng qua đường hô hấp để điều trị nhiễm trùng đường hô hấp [36]. CMS ít độc hơn colistin khi nó được dùng qua đường tiêm, và thực sự đây là lý do cho sự phát triển của CMS [35]. Cấu trúc hóa học khác nhau đã tạo ra sự khác biệt về dược động học và dược lực học giữa colistin và CMS [34, 36].
CMS không ổn định và chuyển đổi thành colistin ở nồng độ thấp, có liên quan về mặt lâm sàng trong huyết tương và nước tiểu in vivo và trong dung dịch đệm và môi trường vi sinh (như <100 μg/ml ở 37°C). Sự chuyển đổi như vậy tạo thành một hỗn hợp phức tạp của chất trung gian được sulfome hóa một phần và colistin, với khả năng tạo ra tới 32 sản phẩm khác nhau ngay cả đối với một thành phần đơn lẻ (ví dụ như CMS A). Một nghiên cứu về độ ổn định lâu dài cho thấy CMS ở mức 2 và 30 μg/ml trong huyết tương người ổn định đến 4 tháng khi được bảo quản ở -80°C và -70°C, trong khi ở -20°C nồng độ đáng kể của colistin (~ 0,4 μg/ml) được phát hiện trong huyết tương tăng đột biến với 2 μg/ml CMS ngay cả trong vòng 2 tháng. Tính không ổn định của CMS có ý nghĩa quan trọng đối với việc thu thập và xử lý mẫu trong các nghiên cứu PK tiền lâm sàng và lâm sàng với CMS.
Nếu có sự chuyển đổi đáng kể CMS thành colistin sau khi lấy mẫu từ bệnh nhân hoặc động vật, thì nồng độ colistin sẽ được đánh giá quá cao, từ đó dẫn 4 đến các phân tích dược lý không chính xác. Thật vậy, đây là vấn đề lớn đối với việc sử dụng các xét nghiệm vi sinh không thể phân biệt giữa colistin có trong mẫu tại thời điểm lấy mẫu từ bệnh nhân và được hình thành do chuyển đổi liên tục từ CMS trong thời gian ủ bệnh phẩm của xét nghiệm vi sinh [5]. Sử dụng phương pháp LC-MS/MS để định lượng riêng biệt CMS và colistin trong dịch sinh học đã chứng minh sự hình thành colistin in vivo ở bệnh nhân và chuột; cả CMS và colistin được tạo ra đều được theo dõi trong huyết tương [35]. Ở vi khuẩn Gram âm, màng ngoài tế bào đóng vai trò là hàng rào ngăn thấm, được cấu tạo bởi lớp phospholipid bên trong và lớp bên ngoài gồm lipopolysaccharid (LPS), protein và phospholipid.
Lipid A là thành phần quan trọng nhất của LPS có vai trò giữ chặt các chuỗi acyl béo ở bên trong nhờ đặc tính thân lipid, giúp ổn định toàn bộ cấu trúc màng ngoài của tế bào vi khuẩn. Một số cation hóa trị 2 như Ca2+ và Mg2+ giữ vai trò là cầu nối giữa các phân tử LPS cạnh nhau [6]. Cấu trúc hóa học của colistin quan trọng với đặc tính diệt khuẩn của thuốc. Các amin chính của Các gốc axit α, γ ‐ diaminobutyric (Dab) được ion hóa ở pH sinh lý và do đó các phân tử polymyxin mang điện tích dương, một đặc tính quan trọng đối với sự tương tác của chúng với các nhóm photphat tích điện âm của lipid A của lipopolysaccharide (LPS).
Ngoài ra, các polymyxin có các vùng kỵ nước, dễ nhận biết nhất là chuỗi acyl béo và các vùng này có thể tương tác với các vùng tương ứng của LPS [37]. Cơ chế tác dụng Cơ chế tác dụng chính xác của colistin hiện vẫn còn đang được tranh cãi, có thể liên quan đến nhiều đích khác nhau của tế bào vi khuẩn. Cơ chế được đồng thuận nhất hiện nay liên quan đến ly giải màng tế bào [6]. Cấu trúc vi khuẩn Gram (-) Ở vi khuẩn Gram âm, OM hoạt động như một hàng rào thẩm thấu.
Mục tiêu ban đầu của polymyxin là LPS của OM. Polymyxin có thể liên kết chọn lọc với LPS, trùng hợp với hoạt tính kháng khuẩn phổ hẹp của nó đối với vi khuẩn Gram âm [42]. LPS bao gồm ba vùng: lipid A trong cùng, vùng oligosaccharid lõi trung tâm và chuỗi kháng nguyên O ngoài cùng [21]. Trong số đó, miền quan trọng nhất là lipid A đóng vai trò là chất béo kỵ nước với sự liên kết chặt chẽ của các chuỗi acyl béo để ổn định cấu trúc OM tổng thể.
Một số cation hóa trị hai như Ca2+ và Mg2+ thường đóng vai trò là cầu nối giữa các phân tử LPS liền kề để ổn định đơn lớp [43, 51, 12]. Con đường ly giải màng Hình 1.