Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Colistin (polymyxin E) là kháng sinh nhóm polypeptid được đưa vào sử dụng từ những năm 1940. Đến thập niên 1970, hoạt chất này bị hạn chế sử dụng trên người do ghi nhận độc tính cao trên thận và thần kinh khi dùng đường tĩnh mạch. Trong bối cảnh gia tăng các chủng vi khuẩn Gram âm đa kháng thuốc đe dọa tính mạng, colistin đã được tái sử dụng như một liệu pháp cứu cánh cuối cùng trong lâm sàng.

Khi dùng đường tiêm, thuốc được sử dụng dưới dạng tiền chất natri colistin methansulfonat (CMS) không có hoạt tính nhằm giảm độc tính cấp. Sau khi vào cơ thể, CMS chuyển hóa dần ở pH sinh lý thành hai dạng đồng phân có hoạt tính diệt khuẩn là colistin A và colistin B. Về mặt dược động học, khoảng 60% liều CMS được bài xuất nguyên vẹn qua thận trong vòng 24 giờ và dưới 25% chuyển đổi thành colistin. Ngược lại, colistin được bài xuất chủ yếu qua con đường ngoài thận (dưới 1% qua nước tiểu do tái hấp thu mạnh ở ống thận). Độc tính trên thận của thuốc phụ thuộc vào lượng tích lũy CMS và nồng độ colistin tự do trong máu, đặc biệt ở bệnh nhân suy giảm chức năng thận, giảm albumin máu hoặc có dùng đồng thời thuốc kháng viêm không steroid (NSAID).

Hiệu quả diệt khuẩn của colistin tương quan chặt chẽ với tỷ lệ diện tích dưới đường cong trên nồng độ ức chế tối thiểu (AUC/MIC) hoặc nồng độ đáy trên MIC ($C_{\text{trough}}/\text{MIC}$). Do sự biến thiên dược động học rất lớn giữa các cá thể bệnh nhân nặng, việc theo dõi nồng độ thuốc trong máu (Therapeutic Drug Monitoring - TDM) là yêu cầu cấp thiết để cá thể hóa liều dùng, cân bằng giữa hiệu lực điều trị và nguy cơ độc tính. Tại Việt Nam, trước thời điểm nghiên cứu, chưa có phương pháp tiêu chuẩn nào được công bố để định lượng đồng thời CMS và colistin A/B trong huyết tương phục vụ TDM.

Khóa luận xác định 02 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

  1. Xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng colistin A/B và CMS trong huyết tương bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC-MS/MS).
  2. Ứng dụng LC-MS/MS trong định lượng nồng độ colistin A, colistin B và tiền thuốc CMS trong huyết tương nhằm phục vụ cá thể hóa liều dùng cho bệnh nhân.
  • Đối tượng nghiên cứu: Hoạt chất colistin (đồng phân colistin A, colistin B), tiền chất natri colistin methansulfonat (CMS) và chất chuẩn nội polymyxin B trong nền mẫu huyết tương người.
  • Phạm vi nghiên cứu: Thực nghiệm được tiến hành tại Bộ môn Kiểm nghiệm – Hóa phân tích (Trường Đại học Dược Hà Nội) và Khoa Độc học và Dị nguyên (Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia) từ năm 2021 đến tháng 06 năm 2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế sinh học

  • Cơ chế tác dụng diệt khuẩn: Colistin liên kết chọn lọc với lipopolysaccharid (LPS) ở màng ngoài vi khuẩn Gram âm nhờ lực hút tĩnh điện giữa các nhóm $\gamma$-amine mang điện tích dương của gốc acid $\alpha,\gamma$-diaminobutyric (Dab) với nhóm phosphat mang điện tích âm của lipid A, thay thế các cation hóa trị hai ($\text{Ca}^{2+}, \text{Mg}^{2+}$). Sau đó, chuỗi acyl béo chèn vào màng làm mất tính toàn vẹn của màng ngoài và màng trong, dẫn đến ly giải tế bào vi khuẩn. Ngoài ra, thuốc còn gây stress oxy hóa tạo các gốc hydroxyl ($-\text{OH}$) phá hủy DNA, lipid và protein tế bào.
  • Cơ chế độc tính thận: Colistin gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và hoại tử tế bào ống thận (necrosis) do làm giảm hoạt tính enzym chống oxy hóa (catalase, superoxide dismutase, glutathione), gây rối loạn chức năng ty thể và giải phóng cytochrom c.
  • Đặc tính phân tích: CMS là polyanion không ổn định, dễ bị thủy phân tự nhiên in vitro và in vivo thành nhiều dẫn chất trung gian sulfomethyl hóa. Do đó, các phương pháp vi sinh truyền thống không thể phân biệt được lượng colistin có sẵn với lượng tạo thành sau khi lấy mẫu. Phương pháp LC-MS/MS với nguồn ion hóa phun điện tử ESI dương kết hợp chế độ ghi phổ MRM là công cụ tối ưu để phân tích đặc hiệu.
  • Khung hướng dẫn thẩm định: Quy trình thẩm định tuân thủ đầy đủ các tiêu chí đối với phương pháp phân tích dịch sinh học theo hướng dẫn của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (US-FDA).

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Hệ thống thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Sciex Triple Quad 6500+ (hãng Sciex), cột sắc ký pha đảo XBridge C18 ($150 \times 4,6 \text{ mm}; 3,5 \ \mu\text{m}$), tủ lạnh âm sâu ($-86^\circ\text{C}$), máy lắc xoáy Vortex, máy ly tâm tốc độ cao.
  • Hóa chất và chất chuẩn: Chuẩn colistin sulfat (độ tinh khiết 95,10%), chuẩn CMS (khối lượng phân tử $1759,90 \text{ g/mol}$), chuẩn nội polymyxin B ($1 \text{ mg/mL}$), acid trichloroacetic (TCA), acetonitril (MeCN), n-hexan, acid sulfuric ($\text{H}_2\text{SO}_4$), natri hydroxyd ($\text{NaOH}$), acid formic (AF). Nền mẫu huyết tương trắng (HTT) mã số 20PO184747 do Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp.
  • Phương pháp xử lý mẫu:
    • Định lượng colistin tự do (Quy trình 1): Mẫu huyết tương được bổ sung chất chuẩn nội Polymyxin B, tủa protein bằng dung dịch TCA 1% trong MeCN, sau đó chiết lỏng - lỏng loại tạp kém phân cực bằng n-hexan, ly tâm $13.000 \text{ vòng/phút}$ trong 10 phút, lấy lớp dịch dưới đem tiêm vào hệ thống LC-MS/MS.
    • Định lượng colistin toàn phần / CMS (Quy trình 2): Mẫu huyết tương chứa CMS được thủy phân cưỡng bức bằng dung dịch $\text{H}_2\text{SO}_4 \ 0,5\text{M}$ ở $50^\circ\text{C}$ trong 10 phút để chuyển toàn bộ CMS về dạng colistin, trung hòa bằng dung dịch $\text{NaOH}$, sau đó tiến hành tủa protein và chiết loại tạp bằng n-hexan tương tự Quy trình 1. Nồng độ CMS được tính toán gián tiếp thông qua độ chênh lệch giữa colistin toàn phần và colistin tự do.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan về colistin methansulfonat

Chương này tổng hợp cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa, dược lý học, dược động học và các phương pháp phân tích colistin và CMS:

  • Tính chất lý hóa: CMS là dẫn chất bán tổng hợp điều chế từ phản ứng giữa các nhóm $\gamma$-amin tự do của colistin với formaldehyd và natri bisulfit; dạng bột màu trắng, rất dễ tan trong nước, ít tan trong ethanol 96% và thực tế không tan trong aceton.
  • Dược động học phục vụ TDM: Nồng độ thuốc đạt trạng thái cân bằng sau 5–7 liều. Khuyến cáo TDM được chỉ định đặc biệt trên nhóm bệnh nhân có rối loạn chức năng thận, bệnh nhân lọc máu ngắt quãng hoặc lọc máu liên tục nhằm kiểm soát nồng độ đích theo $C_{\text{trough}}/\text{MIC}$.
  • Tổng quan phương pháp phân tích: So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp định lượng trong huyết tương đã công bố trên thế giới (HPLC-UV, HPLC huỳnh quang, điện di mao quản và LC-MS/MS). Bảng tổng kết các nghiên cứu của Jian Li (2002), Patrice Gobin (2010), Miao Zhao (2014, 2016), Matthias Weber (2014) cho thấy phương pháp LC-MS/MS vượt trội về độ nhạy (LLOQ từ $0,01$ đến $0,5 \ \mu\text{g/mL}$), độ đặc hiệu và rút ngắn thời gian xử lý mẫu.

Chương 2. Nguyên liệu, thiết bị, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị hóa chất, nồng độ các dãy dung dịch làm việc và các bước thẩm định phương pháp:

  • Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn: Chuẩn gốc colistin sulfat $1000 \ \mu\text{g/mL}$ được pha loãng thành các dung dịch làm việc G1–G6 ($0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 \ \mu\text{g/mL}$). Từ đó chuẩn bị các mẫu chuẩn huyết tương C1–C6 tương ứng. Mẫu kiểm tra chất lượng gồm: LLOQ ($0,1 \ \mu\text{g/mL}$), LQC ($0,2 \ \mu\text{g/mL}$), MQC ($2,0 \ \mu\text{g/mL}$), HQC ($5,0 \ \mu\text{g/mL}$).
  • Quy chuẩn thẩm định theo US-FDA: Đặt ra các tiêu chí đánh giá nghiêm ngặt đối với độ chọn lọc (nhiễu nền huyết tương trắng $\le 20%$ LLOQ), độ phù hợp hệ thống ($\text{CV} \le 1%$ đối với thời gian lưu, $\le 2%$ đối với diện tích pic), đường chuẩn tuyến tính ($R^2 > 0,99$, độ chệch $\le 15%$, riêng LLOQ $\le 20%$), độ đúng và độ chính xác trong ngày/khác ngày ($\text{CV} \le 15%$, độ đúng $85 - 115%$), tỷ lệ thu hồi chất phân tích, độ pha loãng mẫu và độ ổn định ở các điều kiện bảo quản khác nhau (ngắn hạn, 3 chu kỳ đông - rã đông, dài hạn $7 - 21$ ngày ở $-86^\circ\text{C}$, và mẫu sau xử lý ở $2 - 8^\circ\text{C}$).

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và bàn luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm khảo sát thông số và dữ liệu thẩm định:

1. Khảo sát thông số khối phổ (MS/MS)

Các thông số bắt mảnh đặc hiệu tại Q1 và Q3 được tối ưu hóa trên máy Sciex 6500+ ở chế độ ESI dương:

Chất phân tích Khối lượng Q1 ($m/z$) Khối lượng Q3 ($m/z$) DP (V) CE (V) CXP (V) Mục đích sử dụng
Colistin A 585,7 101,2 46,0 83,0 12,0 Định tính
585,7 241,4 46,0 29,0 16,0 Định tính
585,7 202,0 46,0 31,0 18,0 Định tính
391,0 102,2 46,0 23,0 12,0 Định lượng
Colistin B 587,8 102,2 66,0 63,0 8,0 Định tính
587,8 227,3 66,0 31,0 10,0 Định tính
386,0 102,2 66,0 23,0 8,0 Định lượng
579,0 202,0 66,0 31,0 12,0 Định tính
Polymyxin B (IS) 602,7 241,4 106,0 37,0 18,0 Nội chuẩn
602,7 233,4 106,0 41,0 6,0 Nội chuẩn
402,3 101,2 106,0 23,0 10,0 Nội chuẩn

2. Khảo sát điều kiện sắc ký

  • Cột phân tích: XBridge C18 ($150 \times 4,6 \text{ mm}; 3,5 \ \mu\text{m}$).
  • Pha động gồm Kênh A (Acid formic 0,1% trong nước) và Kênh B (MeCN), tốc độ dòng $0,3 \text{ mL/phút}$, thể tích tiêm mẫu $10 \ \mu\text{L}$.
  • Chương trình rửa giải gradient tối ưu: $0 - 1,5 \text{ phút}$ giữ 5% B (tách hoàn toàn pic chất phân tích khỏi pic tạp nền); $1,5 - 2,5 \text{ phút}$ tăng 5% lên 100% B; $2,5 - 5,5 \text{ phút}$ giữ 100% B; $5,5 - 6,5 \text{ phút}$ giảm về 5% B; $6,5 - 8,0 \text{ phút}$ cân bằng cột ở 5% B. Áp suất hệ thống duy trì ổn định dưới 400 bar.

3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

  • Tác nhân tủa protein: Khảo sát MeCN thuần, TCA 1%/MeCN và TCA 2%/MeCN. Kết quả dung dịch TCA 1%/MeCN cho dịch trong nhất, tủa hoàn toàn protein, đường nền sạch và tỷ lệ đáp ứng tín hiệu diện tích pic ($A_S/A_{IS}$) cao nhất (đạt trung bình 0,657 đối với Colistin A và 1,015 đối với Colistin B ở mẫu $2 \ \mu\text{g/mL}$).
  • Dung môi chiết loại tạp: Khảo sát cloroform và n-hexan. Kết quả n-hexan giúp loại bỏ triệt để các hợp chất lipid/cholesterol kém phân cực mà không làm thất thoát colistin ở pha nước, tỷ lệ $A_S/A_{IS}$ đạt 0,749 (Colistin A) và 1,144 (Colistin B), cao hơn rõ rệt so với cloroform (0,654 và 0,962).

4. Khảo sát điều kiện thủy phân CMS

Thực nghiệm xác định điều kiện chuyển hóa tối ưu CMS thành colistin toàn phần:

  • Nồng độ acid: Khảo sát $\text{H}_2\text{SO}4$ ở các mức 0,2M; 0,5M; 1,0M; 2,0M. Nồng độ $0,5\text{M}$ cho đáp ứng tín hiệu $A_S/A{IS}$ cao nhất (1,075 với Colistin A và 0,396 với Colistin B).
  • Nhiệt độ ủ: Khảo sát ở $25^\circ\text{C}, 37^\circ\text{C}, 40^\circ\text{C}, 50^\circ\text{C}, 60^\circ\text{C}$. Mức nhiệt $50^\circ\text{C}$ cho tín hiệu tối ưu ($A_S/A_{IS}$ đạt 0,146 với Colistin A và 0,053 với Colistin B).
  • Thời gian ủ: Khảo sát ở 1, 2, 5, 10, 20 phút. Thời gian ủ 10 phút đạt tín hiệu cao nhất ($A_S/A_{IS}$ đạt 0,082 với Colistin A và 0,036 với Colistin B).

5. Kết quả thẩm định phương pháp (trên mẫu Colistin tự do)

  • Độ chọn lọc: Phân tích 6 lô huyết tương trắng độc lập cho thấy không có pic tạp trùng thời gian lưu của Colistin A ($t_R \approx 3,80 \text{ phút}$) và Colistin B ($t_R \approx 3,78 \text{ phút}$). Tỷ lệ tín hiệu mẫu LLOQ ($0,1 \ \mu\text{g/mL}$) so với mẫu trắng tại cùng thời gian lưu đều lớn hơn 5 lần.
  • Độ phù hợp hệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần mẫu chuẩn $5 \ \mu\text{g/mL}$ cho thấy độ biến thiên thời gian lưu $%CV = 0,166%$ (Colistin A) và $0,199%$ (Colistin B) (đạt yêu cầu $\le 1%$). Độ biến thiên tỷ lệ $A_S/A_{IS}$ đạt $%CV = 1,24%$ (Colistin A) và $1,59%$ (Colistin B) (đạt yêu cầu $\le 2%$).
  • Khoảng tuyến tính và đường chuẩn: Tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ $0,1 - 5,0 \ \mu\text{g/mL}$:
    • Colistin A: Phương trình hồi quy $y = 0,215x + 0,016$ với $R^2 = 0,999$; độ chệch các điểm chuẩn từ $-8,1%$ đến $16,0%$.
    • Colistin B: Phương trình hồi quy $y = 0,404x - 0,0129$ với $R^2 = 0,999$; độ chệch các điểm chuẩn từ $-12,0%$ đến $2,0%$.
  • Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): Đạt mức $0,1 \ \mu\text{g/mL}$ với độ đúng từ $81,3%$ đến $94,9%$ (Colistin A) và $103,0%$ đến $115,0%$ (Colistin B); hệ số biến thiên $%CV$ tương ứng là $5,988%$ và $4,501%$ (đều thỏa mãn tiêu chí $\le 20%$).

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

  • Xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời colistin A, colistin B và colistin toàn phần (chuyển hóa từ CMS) trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS với thời gian phân tích một mẫu là 8,0 phút.
  • Thiết lập quy trình xử lý mẫu kết hợp tủa protein bằng TCA 1%/MeCN và làm sạch dịch chiết bằng n-hexan, giúp loại bỏ triệt để tạp chất nền lipid và bảo vệ áp suất cột sắc ký ổn định.
  • Tối ưu hóa phản ứng thủy phân định lượng CMS trong huyết tương với điều kiện: $\text{H}_2\text{SO}_4 \ 0,5\text{M}$, ủ nhiệt $50^\circ\text{C}$ trong thời gian 10 phút.
  • Thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu phân tích sinh học theo tiêu chuẩn US-FDA với các thông số đạt độ tin cậy cao:
Chỉ tiêu thẩm định Tiêu chuẩn chấp nhận (US-FDA) Kết quả Colistin A Kết quả Colistin B Kết luận
Độ chọn lọc Đáp ứng LLOQ/Blank $> 5$ lần Đạt ($> 5$ lần) Đạt ($> 5$ lần) Đạt
Độ ổn định hệ thống (CV %) $t_R \le 1%$; Diện tích $\le 2%$ $t_R: 0,166%$; Tín hiệu: $1,24%$ $t_R: 0,199%$; Tín hiệu: $1,59%$ Đạt
Khoảng tuyến tính $0,1 - 5,0 \ \mu\text{g/mL}$ ($R^2 > 0,99$) $y = 0,215x + 0,016$ ($R^2 = 0,999$) $y = 0,404x - 0,0129$ ($R^2 = 0,999$) Đạt
Độ chệch đường chuẩn $\le \pm 15%$ (LLOQ $\le \pm 20%$) $-8,1%$ đến $16,0%$ $-12,0%$ đến $2,0%$ Đạt
Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) $0,1 \ \mu\text{g/mL}$ ($\text{CV} \le 20%$) $\text{CV} = 5,988%$ $\text{CV} = 4,501%$ Đạt

Đóng góp của đề tài

  • Là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh đầu tiên tại Việt Nam xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng colistin A/B và CMS trong huyết tương bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC-MS/MS theo hướng dẫn quốc tế US-FDA.
  • Cung cấp quy trình phân tích có độ chọn lọc cao, loại bỏ được sai số lớn do sự chuyển hóa không ổn định của CMS vốn thường gặp ở các phương pháp thử nghiệm vi sinh hoặc HPLC đầu dò quang học thông thường.
  • Tạo tiền đề kỹ thuật trực tiếp phục vụ công tác giám sát nồng độ thuốc trong điều trị (TDM), giúp bác sĩ lâm sàng tối ưu hóa và cá thể hóa chế độ liều colistin trên bệnh nhân nhiễm trùng nặng do vi khuẩn Gram âm đa kháng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

  • Khoảng tuyến tính thực nghiệm được thẩm định dừng ở mức $0,1 - 5,0 \ \mu\text{g/mL}$; chưa mở rộng xuống mức $0,01 \ \mu\text{g/mL}$ hoặc nâng lên mức $10,0 \ \mu\text{g/mL}$ như khoảng nồng độ kỳ vọng ban đầu.
  • Quy trình mới được thẩm định chuyên sâu trên các mẫu huyết tương thêm chuẩn (spiked plasma) và bước đầu xử lý mẫu thực tế trong phạm vi phòng thí nghiệm, chưa thực hiện khảo sát trên cỡ mẫu lớn bệnh nhân lâm sàng tại các khoa hồi sức tích cực.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Ứng dụng quy trình LC-MS/MS đã thẩm định vào phân tích thường quy các mẫu huyết tương bệnh nhân đang điều trị bằng CMS tại các bệnh viện để đánh giá tương quan PK/PD thực tế.
  • Khảo sát mở rộng giới hạn định lượng dưới (LLOQ) xuống thấp hơn nhằm phục vụ nghiên cứu dược động học ở các bệnh nhân dùng CMS dạng khí dung hoặc ở các mô/dịch sinh học khác.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Cán bộ y tế, dược sĩ lâm sàng tại các đơn vị Hồi sức tích cực (ICU) và trung tâm Dược lâm sàng - Thông tin thuốc cần triển khai dịch vụ TDM colistin.
    • Kiểm nghiệm viên, nghiên cứu viên chuyên ngành Hóa phân tích, Kiểm nghiệm thuốc và Độc chất học tại các viện nghiên cứu, trường đại học y dược và trung tâm kiểm nghiệm.
    • Học viên sau đại học và sinh viên ngành Dược tham khảo phương pháp luận xây dựng, tối ưu hóa và thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học theo hướng dẫn US-FDA.
  • Nội dung giá trị:
    • Bộ thông số vận hành MS/MS chi tiết (các mảnh ion Q1, Q3, thế phân nhóm DP, năng lượng va chạm CE, điện thế lối ra CXP) trên hệ thống Sciex Triple Quad.
    • Quy trình xử lý mẫu 2 bước đơn giản, chi phí hợp lý (tủa protein bằng TCA 1%/MeCN kết hợp chiết lỏng - lỏng loại tạp bằng n-hexan) không cần sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) đắt tiền.
    • Thông số thực nghiệm chuẩn hóa cho phản ứng thủy phân CMS ($\text{H}_2\text{SO}_4 \ 0,5\text{M}$, $50^\circ\text{C}$, 10 phút).

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cần định lượng riêng biệt cả colistin tự do và tiền thuốc CMS trong huyết tương?

Colistin dùng đường tiêm dưới dạng tiền thuốc CMS không có hoạt tính. Trong cơ thể, CMS chuyển hóa liên tục và không ổn định thành colistin có hoạt tính diệt khuẩn nhưng đồng thời có độc tính cao trên thận. CMS thải trừ chủ yếu qua thận, còn colistin thải trừ qua con đường ngoài thận. Ở bệnh nhân suy giảm chức năng thận, CMS tích lũy làm gia tăng nồng độ colistin tạo thành. Việc định lượng riêng biệt cả hai thành phần giúp đánh giá chính xác dược động học, phát hiện sớm nguy cơ quá liều gây độc thận hoặc thiếu liều dẫn đến thất bại điều trị và kháng thuốc.

2. Chất chuẩn nội (IS) được lựa chọn trong nghiên cứu là chất nào và vì sao?

Nghiên cứu lựa chọn Polymyxin B làm chất chuẩn nội. Cơ sở lựa chọn là do polymyxin B và colistin (polymyxin E) đều là các kháng sinh lipopeptid có cấu trúc phân tử tương đồng, chỉ khác nhau duy nhất một acid amin trong vòng heptapeptid. Do đó, polymyxin B có tính chất hóa lý, khả năng ion hóa trong nguồn ESI và hiệu suất chiết tách tương đương với chất phân tích, đáp ứng tốt yêu cầu chuẩn hóa tín hiệu trong phân tích LC-MS/MS.

3. Quy trình xử lý mẫu huyết tương có điểm gì đặc biệt để loại bỏ tạp chất nền?

Sau khi tủa protein huyết tương bằng dung dịch TCA 1% trong MeCN, nghiên cứu bổ sung thêm bước chiết lỏng - lỏng với $200 \ \mu\text{L}$ dung môi n-hexan. Dung môi n-hexan giúp hòa tan và loại bỏ các thành phần thân dầu kém phân cực (như acid béo, cholesterol) lên lớp trên, trong khi colistin phân cực được giữ lại ở lớp dịch trong phía dưới đem tiêm sắc ký. Kỹ thuật này giúp làm sạch nền mẫu, loại bỏ hiện tượng nhiễu đường nền và tránh hiện tượng tăng áp suất cột khi phân tích nhiều mẫu.

4. Điều kiện tối ưu hóa cho phản ứng thủy phân chuyển đổi CMS thành colistin toàn phần là gì?

Điều kiện tối ưu được xác định qua thực nghiệm gồm: sử dụng tác nhân acid hóa $\text{H}_2\text{SO}_4$ nồng độ $0,5\text{M}$, ủ mẫu ở nhiệt độ $50^\circ\text{C}$ trong thời gian 10 phút, sau đó trung hòa bằng lượng $\text{NaOH}$ tương đương trước khi tiến hành tủa protein và làm sạch mẫu.

5. Khoảng tuyến tính và giới hạn định lượng dưới (LLOQ) của phương pháp đạt được là bao nhiêu?

Phương pháp đạt khoảng tuyến tính từ $0,1 \ \mu\text{g/mL}$ đến $5,0 \ \mu\text{g/mL}$ với hệ số tương quan $R^2 = 0,999$ cho cả colistin A và colistin B. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) đạt $0,1 \ \mu\text{g/mL}$, đáp ứng đầy đủ yêu cầu về độ đúng ($80 - 120%$) và độ chính xác ($\text{CV} \le 20%$) theo hướng dẫn của US-FDA.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Thành Lâm đã hoàn thành việc xây dựng và thẩm định toàn diện quy trình định lượng colistin A, colistin B và colistin toàn phần (CMS) trong huyết tương người bằng phương pháp LC-MS/MS trên hệ thống Sciex 6500+. Phương pháp đạt độ chọn lọc cao, độ lặp lại tốt, khoảng tuyến tính $0,1 - 5,0 \ \mu\text{g/mL}$ ($R^2 = 0,999$) và giới hạn định lượng dưới đạt $0,1 \ \mu\text{g/mL}$, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn thẩm định phân tích sinh học của US-FDA. Quy trình xử lý mẫu hai bước kết hợp tủa protein bằng TCA 1%/MeCN và làm sạch bằng n-hexan vừa bảo đảm hiệu suất thu hồi cao vừa rút ngắn thời gian chuẩn bị mẫu, cung cấp một công cụ phân tích tin cậy và có tính khả thi cao phục vụ công tác giám sát nồng độ thuốc trong máu (TDM) colistin tại các cơ sở điều trị.