CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Tính chất Chloramphenicol Danh pháp hóa học 2,2-Dichloro-N-[β-hydroxy-α-(hydroxymethyl)-4- nitrophenethyl]acetamide. Công thức phân tử: C11H12Cl2N2O5. Khối lượng phân tử: 323,13 g/mol.
Công thức cấu tạo: Hình 1. Cấu trúc phân tử gốc của Chloramphenicol (CAP) [1] Chloramphenicol (CAP) là một loại kháng sinh ban đầu được phân lập từ vi khuẩn Streptomyces venezuelae, sau đó được sản xuất bằng phương pháp tổng hợp, thuộc nhóm Phenicol [1]. Chloramphenicol tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng hoặc có ánh màu vàng; có vị đắng; ít tan trong nước, tan tốt trong Methanol, Ethanol, Acetone, Propylen Glycol; vững bền ở nhiệt độ thường, có khả năng chịu nhiệt lên đến 100 độ C; bền vững trong môi trường hơi Acid hay trung có khoảng pH từ 2 - 9. Chloramphenicol có tác dụng ức chế trên nhiều vi khuẩn hiếu khí (gram dương và gram âm), vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là đối với vi khuẩn Salmonella, trực khuẩn và vi khuẩn cúm ….
CAP ức chế sự hình thành protein của vi khuẩn nên có tác dụng kìm khuẩn khi được sử dụng ở nồng độ thấp và có thể có tác dụng diệt khuẩn khi được sử dụng ở nồng độ cao [2]. Chloramphenicol tan nhiều trong Alcohol, hấp thu tốt qua đường tiêu hóa và ngoại tiêu hóa, phân bố đồng đều trong dịch nội và ngoại bào. Do không có tính ion hóa nên chloramphenicol tan tốt trong Lipid, được phân bố rộng khắp các mô trong cơ thể. Chloramphenicol có tác dụng kìm khuẩn, gắn vào tiểu phần 50s của ribosom nên ngăn cản ARN m gắn vào ribosom, đồng thời ức chế transferase nên acid amin được mã hóa không gắn được vào 6 polypeptid.
Chloramphenicol cũng ức chế tổng hợp protein của ty thể ở tế bào động vật có vú (vì ribosom của ty thể cũng là loại 70s như vi khuẩn), hồng cầu động vật có vú đặc biệt nhạy cảm với Chloramphenicol [3]. Cơ chế tác dụng của Chloramphenicol (CAP). [3] Khi Chloramphenicol có mặt ở tế bào động vật, khoảng 60% gắn vào Protein huyết tương thấm dễ dàng vào các mô, nhất là các hạch mạc treo, nồng độ đạt được cao hơn trong máu, thấm tốt vào dịch não tuỷ, qua được rau thai. Chloramphenicol được chuyển hóa qua quá trình khử, phần lớn bị mất hoạt tính do quá trình chuyển hóa ở gan và được thải trừ chủ yếu qua thận dưới dạng chuyển hóa.
Tuy nhiên, nếu cơ thể không đào thải được hoặc lượng Chloramphenicol tích lũy trong cơ thể lớn thì gây ra những độc tính rất nguy hiểm. CAP có thể làm suy yếu hệ xương ở trẻ sơ sinh gây hội chứng "gray syndrome", là do trẻ chưa hình thành cơ chế khử độc (khả năng liên kết với glucuronide ở gan) [19]. Ngoài ra, CAP làm giảm huyết cầu toàn thể do suy tuỷ thực sự, tỷ lệ tử vong từ 50% - 80% và tần suất mắc từ 1: 150. Tình hình sử dụng Chloramphenicol và thực phẩm chứa tồn dư Choloramphenicol ở việt Nam trong những năm gần đây [15] 7 Việt Nam hiện có 567 nhà máy chế biến thủy sản quy mô công nghiệp đang đáp ứng các tiêu chuẩn an toàn thực phẩm như HACCP, GMP, SSOP; hơn 400 nhà máy đông lạnh có công suất 7.500 tấn; 415 nhà máy đủ tiêu chuẩn xuất khẩu sang EU, tăng 398 nhà máy so với năm 1999; và nhiều nhà máy, vùng nuôi đạt chứng nhận tự nguyện như GlobalGAP, ASC, BAP, BRC.
Đến nay, sản phẩm thủy sản Việt Nam vươn tới hơn 170 thị trường, trong đó những thị trường chính là EU, Mỹ, Nhật, Úc; kim ngạch xuất khẩu nămna 2013 đạt hơn 6,7 tỷ USD, gấp hơn 32 lần so năm 1990, trở thành một trong những nước xuất khẩu thủy sản lớn trên thế giới. Tuy đạt được những thành tựu nhất định, xuất khẩu Việt Nam cũng gặp không ít khó khăn. Từ việc cạnh tranh của những nước xuất khẩu thuỷ sản khác đến vấn đề an toàn thực phẩm trong xuất khẩu thuỷ sản. Trong đó, việc sử dụng kháng sinh bừa bãi, mất kiểm soát trong khâu nuôi trồng đã làm mất uy tín trầm trọng của thuỷ sản Việt Nam trên thị trường thế giới.
Theo kết quả báo cáo của Tổ chức Phát triển Công nghiệp của Liên Hợp Quốc (UNIDO) ở 4 thị trường lớn là EU, Hoa Kỳ, Nhật Bản, Úc thì Việt Nam là một trong ba nước đứng đầu về số vụ bị từ chối nhập khẩu sản phẩm thủy sản giai đoạn 2006-2010 cao hơn so với các nước nhập khẩu khác. Tính trung bình từ 2006- 2010, mỗi năm Việt Nam thiệt hại hơn 14 triệu USD do hàng xuất khẩu thuỷ sản bị trả lại (Chiếm 0,39% doanh thu trung bình từ 2006-2010 là 3,2 tỉ USD). Mức độ và số lượng lô hàng bị nước ngoài cảnh báo năm 2011 không có dấu hiệu giảm trong bối cảnh Cục NAFIQAD đã áp dụng các biện pháp kiểm soát tăng cường nhằm vào thành phẩm trước xuất khẩu, đặc biệt là hơn một nửa số cảnh báo do lây nhiễm kháng sinh cấm có nguồn gốc từ khâu nuôi trồng, nhất là tôm. Điều đáng lưu ý là các cảnh báo nhiễm kháng sinh của nước ngoài có cả các loại kháng sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi trồng từ trước đó như Chloramphenicol, Trifluralin.
Việc cho phép sử dụng một số loại kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, kiểm soát không tốt việc sản xuất, lưu thông các chất đã bị cấm và thiếu kiểm soát đồng đều của Nhà nước trên “chuỗi sản xuất”, nhưng doanh nghiệp lại là chủ thể phải chịu sự trừng phạt (xử lý vi phạm) khi bị phát hiện cảnh báo trong bối cảnh đã tuân thủ đầy đủ theo yêu cầu lấy mẫu kiểm nghiệm & cấp Chứng thư của Cục NAFIQAD. Điều này không chỉ mất công bằng, mà còn đặt ra một câu hỏi lớn về tính 8 hiệu quả của biện pháp kiểm soát An toàn thực phẩm kháng sinh cần phải được xem lại. Điển hình là trong 6 tháng cuối năm 2016, có 43 lô hàng thủy sản Việt Nam xuất khẩu sang Nhật Bản đã bị trả về do chứa dư lượng kháng sinh cấm trong đó có tới 41 lô nhiễm CAP [6]. Tình trạng hàng thủy sản xuất khẩu bị trả về đã gây thiệt hại khá nhiều cho bà con và làm giảm uy tín của ngành thủy sản Việt Nam.
Theo số liệu thống kê [5], đã phát hiện 43/63 mẫu tôm, cá, mực (thu mua ngẫu nhiên tại các chợ và siêu thị) bị nhiễm CAP ở mức dưới 10 mg/kg. Tháng 8, 9 năm 2017 Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đã phát hiện 2/56 mẫu thủy sản chứa tồn dư CAP. Như vậy, việc sử dụng CAP ở Việt Nam hiện ở mức đáng báo động. Tại Hội nghị bàn giải pháp phát triển ngành tôm 2022 và ký quy chế phối hợp quản lý tôm giống, Cục quản lý chất lượng nông lâm sản và thủy sản (Nafiqad) - Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho biết, trong năm ngoái, Nafiqad đã thực hiện lấy 1.768 mẫu tôm nuôi (tôm thẻ chân trắng và tôm sú) tại 111 vùng nuôi tập trung để phân tích dư lượng hóa chất, kháng sinh; thì có 13 mẫu tôm vi phạm.
Theo đó, các lô tôm vi phạm liên quan đến chỉ tiêu hóa chất kháng sinh, bao gồm Chloramphenicol, Ciprofloxacin, Oxytetracycline, Ormetoprim, Enrofloxacin và SEM. Cho đến nay trên thế giới đã có khá nhiều phương pháp được phát triển và thẩm định để xác định dư lượng CAP trong thực phẩm như phương pháp quang phổ tử ngoại, phương pháp ELISA, phương pháp sắc ký khí với đầu dò bắt điện tử (GC-ECD), phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò tia tử ngoại (HPLC-UV), phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ kép (LC- MS/MS) [9 -13]. Tại Việt Nam cũng đã một số nghiên cứu như phát hiện Chloramphenicol bằng phương pháp vi sinh, ELISA, LC-MS/MS [14,16]. Tuy nhiên các phương pháp trắc quang, HPLC-UV, GC- ECD, ELISA nhìn chung đều có LOD cao hơn nhiều so với quy định thế giới.
Một số nước hiện đã ban hành phương pháp tiêu chuẩn cho phép định lượng 9 Chloramphenicol với giới hạn thấp (ví dụ: ở Canada là 2,5 ppb; ở EU là 0,3 ppb; ở Mỹ là 5 ppb). Công tác kiểm soát dư lượng Chloramphenicol trong sản phẩm thực phẩm ở nước ta còn có những vấn đề bất cập, chưa đáp ứng yêu cầu của thế giới do các phương pháp phân tích CAP tiêu chuẩn hiện hành ở Việt Nam có giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) cao hơn so với quy định quốc tế. Chẳng hạn, phương pháp TCVN 8140 : 2009 - Định lượng Chloramphenicol trong thịt và sản phẩm thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò tia tử ngoại) có LOD > 6,5 mg/kg [7]; phương pháp TCN 186 : 2003 - Định lượng Chloramphenicol trong thủy sản bằng phương pháp sắc ký khí với dầu dò bắt điện tử) có LOD = 0,3 mg/kg [8]. Điều này gây khó khăn cho các cơ quan chức năng Việt Nam trong việc quản lý chất lượng sản phẩm động vật lưu hành nội địa, đặc biệt là các mặt hàng thủy sản xuất khẩu.
Các phương pháp phân tích Chloramphenicol (CAP) trong thực phẩm.1 Phương pháp Elisa ELISA (Enzymee - Linked Immunosorbent Assay) - gắn kết enzzym cộng hợp được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên cứu, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một lượng vật chất rất nhỏ. Xét nghiệm ELISA có thể được tiến hành với một số phương pháp như ELISA “trực tiếp’’, “gián tiếp’’, “sandwic’’ và “cạnh tranh“. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene). Quá trình này có thể là trực tiếp hoặc thông qua một kháng thể.
Khi huyết thanh được thêm vào, các kháng thể có thể kết hợp với kháng nguyên ở pha đặc (solid phase). Xét nghiệm ELISA được thực hiện trong đĩa plastic kích thước 8cm x 12cm, chứa 8x12 giếng (giếng có chiều cao khoảng 1cm và đường kính là 0,7cm). Đĩa ELISA 96 giếng được sử dụng nhiều nhất trong ELISA thường là polystyrene hoặc các dẫn xuất của polystyrene thu 10 được bằng cách biến đổi hóa học hoặc chiếu xạ bề mặt. Phổ biến nhất là đĩa 96 giếng được tổ chức thành 8 hàng và 12 cột.
Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng liên kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme.