MỞ ĐẦU Hoạt động sản xuá t chăn nuôi thò i gian qua tại Việt Nam đã đạt được những thành quả tích cực do có sự chung tay Chiń h phủ, các cơ quan bộ, ngành, của nhiều tập đoàn, doanh nghiệp lớn, xây dựng được các chuỗi liên kết khép kín, sản xuá t với chăn nuôi an toàn sinh học và các mô hình chăn nuôi có hiệu quả. Trong những năm gần đây ở nước ta việc sử dụng thiếu kiểm soát nhiều chế phẩm kích thích, chất tăng trọng, chất tạo nạc, các loại thuốc kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy hải sản đã không chỉ làm giảm chất lượng và giá trị của các sản phẩm chăn nuôi, mà còn gây ảnh hưởng không tốt lên sức khỏe người tiêu dùng và tạo ra rào cản đối với các mặt hàng thực phẩm chế biến quan trọng (thịt lợn, cá da trơn, tôm đông lạnh.) xuất khẩu ra thế giới. Khi bổ sung kháng sinh vào khẩu phần ăn thì khả năng kháng kháng sinh đối với mầm bệnh gia tăng [13]. Trước thực tra ̣ng đó, các nước thuô ̣c khối Liên minh Châu Âu đã cấm hoàn toàn viê ̣c sử du ̣ng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi [5].
Việc tìm kiếm các sản phẩm sinh học với các tính kháng sinh và tăng cường miễn dịch có nguồn gốc tự nhiên đang trở nên rất cần thiết. Chăn nuôi theo hướng an toàn sinh học ngày càng được chú trọng để tránh tồn dư kháng sinh, hoocmon và giảm hiện tượng kháng thuốc. Công nghệ sinh học ứng dụng trong chăn nuôi an toàn được công nhận rộng rãi như một mục tiêu quan trọng để ngăn chặn dịch bệnh. Trong bối cảnh dịch bệnh luôn thường trực, việc áp dụng các giải pháp sinh học là mấu chốt để đảm bảo an toàn trong chăn nuôi.
Các nhà khoa học phát hiện và bắt đầu nghiên cứu β-glucan từ những năm 1960. Bắt đầu từ việc nghiên cứu Zymosan, một hỗn hợp các thành phần từ thành tế bào nấm men bao gồm protein, lipid, polysaccharide được sử dụng khắp châu Âu để kích thích miễn dịch. Beta-1,3/1,6 D-glucan chính là loại 1 polysaccharide có tác dụng chính kích thích miễn dịch. Chiết xuất từ lúa mạch và các loại ngũ cốc là beta 1,3/1,4 D-glucan có hoạt tính kích hoạt miễn dịch kém hơn so với beta-1,3/1,6-D glucan.
Beta-glucan có công dụng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên, tăng cường sức khỏe hô hấp, giúp tăng cường hoạt động của các đại thực bào và kích thích tăng tiết nhiều cytokines (chất hoạt hóa tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhập từ bên ngoài, giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hóa, phòng các bệnh đường ruột, bệnh do vi khuẩn, vi rút [1]. Hiện nay, các nghiên cứu trong và ngoài nước nước đã được thực hiện chủ yếu từ β-glucan không tan, chủ yếu được tách từ thành tế bào nấm men bia, khối lượng phân tử (KLPT) cao, khó hòa tan, hiệu quả sử dụng chưa cao. Aureobasidium pullulans spp. là vi sinh vật sinh tổng hợp được exopolysaccharide ngoại bào (EPS) có cấu trúc dạng β-glucan tan.
Một số vi khuẩn lactic cũng có thể sinh tổng hợp được EPS nhưng không có cấu trúc β-glucan ngoại bào dạng tan. Gần đây, những hoạt tính sinh học khác nhau liên quan đến EPS như khả năng chống oxy hóa, chống ung thư, làm giảm cholesterol trên người cũng được nghiên cứu. Nhiều vi khuẩn có thể tổng hợp các polysaccharide ngoại bào và tiết chúng ra bên ngoài môi trường. Từ khi Lactic Acid Bacteria (LAB) được "công nhận là vi sinh vật an toàn”, việc cải thiện quá trình thu nhận, tách chiết EPS được coi là một phương pháp hữu ích để sản xuất EPS ứng dụng trong thực phẩm.
Nhiều chủng LAB được biết đến là nguồn sản xuất EPS với những tác động liên quan đến việc cải thiện cấu trúc của các sản phẩm lên men như sữa chua, phomat,. Mặc dù có rất nhiều đóng góp quan trọng nhưng EPS từ vi khuẩn vẫn tồn tại một nhược điểm là năng suất thu nhận thấp, giá thành sản xuất EPS tương đối cao [4]. Sàng lọc các chủng Aureobasidium pullulans có năng suất cao và tối ưu hóa các điều kiện lên men của các chủng sẵn có để cải thiện sản xuất EPS là những phương pháp hữu hiệu để giải quyết vấn đề này. 2 Xuất phát từ nhu cầu sản xuất chế phẩm sinh học β-glucan tan bổ sung vào sản phẩm thức ăn cho vật nuôi để hỗ trợ tăng cường sức khỏe miễn dịch, phòng chống bệnh, giảm sử dụng thuốc và đặc biệt là giảm thiểu sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, đề tài của luận văn thạc sĩ này được xác định là “Phân lập và tuyển chọn chủng Aureobasidium pullulans từ một số loại quả sinh tổng hợp β-glucan tan ngoại bào để bổ sung trong sản xuất thức ăn chăn nuôi”.
Trong đề tài này, chủng giả nấm men thuộc chi Aureobasidium được nghiên cứu để lên men sản xuất β-glucan ngoại bào dạng tan có KLPT thấp, khác biệt với các sản phẩm đã được nghiên cứu β-glucan không tan (tách từ thành tế bào men bia) có khối lượng phân tử cao. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu về β-glucan tan 1. Khái niệm Theo định nghĩa, β-glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D (D- glucose), tạo nên bởi liên kết loại β-glycoside.
Vòng 6 D-glucose có thể gắn với phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D-glucose. Phân tử β- glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D-glucose. Hình thức phổ biến nhất của β-glucan đó là chứa các đơn nguyên D-glucose với các liên kết 1,3 và với chuỗi D-glucose gắn vào vị trí 1,6. Các loại này tạo thành β-glucan 1,3/1,6.
Các nghiên cứu đã cho thấy dạng hợp chất (1,3/1,6) β-glucan có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3/1,4) β-glucan. Một sự biến đổi khác đó là một vài hợp chất này tồn tại dưới dạng chuỗi sợi đơn, trong khi trục chính của những β(1,3)-glucan khác tồn tại ở dạng các chuỗi sợi đôi hoặc sợi ba. Trong một vài trường hợp, các protein gắn vào trục β(1,3)-glucans cũng có thể tạo nên hoạt tính kháng thể. β-glucan được biết đến như là chất bổ sung sinh học nhờ vào khả năng kích thích hệ thống kháng thể.
Các nhà nghiên cứu miễn dịch tại Đại học Louisville đã phát hiện ra rằng một cơ quan cảm quan trên bề mặt tế bào kháng thể bẩm sinh được gọi là cơ quan cảm quan bổ sung 3 (CR3 hoặc CD11b/CD18) giữ vai trò liên kết β- glucan, cho phép tế bào kháng thể nhận ra chúng. Exopolysaccharide (EPS) của chủng A. pullulans, được cấu tạo bởi chuỗi chính glucose liên kết β-(1,3) và mạch nhánh liên kết β-(1,6) có cấu trúc β- glucan tan với hoạt tính kích thích miễn dịch và được dùng ở nhiều quốc gia. Ngoài ra, dịch EPS ngoại bào của chủng A.
pullulans ức chế khối u, chống nhiễm trùng trên chuột. EPS là mucopolysacaride tan trong nước, có tính màng, cản khí tốt, xử lý dễ dàng, không độc hại vì sản phẩm được tạo ra từ: (i) lên men nguyên liệu thực vật; (ii) độ thấm oxy thấp, dễ bảo quản; (iii) không gây bệnh [36]. Cấu trúc của β-glucan tan EPS dạng glucan tan do A. pullulans tiết ra ngoại bào (khác biệt so với β- glucan không tan từ nấm đảm, thành tế bào nấm men), được sử dụng làm thực phẩm chức năng mà không cần quá trình chiết xuất phức tạp.1 trình bày cấu trúc dạng beta-1,3/1,6 D-glucan.
Cấu trúc EPS dạng β-(1,3;1,6) 1. Ứng dụng của β-glucan tan Exopolysaccharide dạng β-glucan tan được sản xuất bởi A. pullulans có một loạt các ứng dụng trong công nghiệp và thương mại trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, chăm sóc sức khỏe và y sinh. EPS đã được sử dụng làm màng sinh học và chất kết dính trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
EPS dạng β-glucan có vai trò kích thích quá trình thực bào (phagocytosis) của tiểu thực bào (microphage) và đại thực bào (macrophage). Trong quá trình này, oxy được chuyển thành các anion oxy hóa mạnh như superoxide (O2-) và nitrogen oxide (NO) để diệt vi khuẩn và virus. Đại thực bào được hoạt hóa bởi β- glucan gắn với thụ thể (receptor) kích hoạt miễn dịch của tế bào (Kumari and Sahoo, 2006). Exo-polysaccharide (EPS) dạng β-glucan là sản phẩm có tác dụng tăng cường sức đề kháng, chống lại dịch bệnh gây ra bởi các nhóm vi khuẩn gây bệnh, ngăn chặn tác động của virus.
EPS có tác dụng giúp tăng cường bổ thể, interferon (IFN) và hoạt tính lysozyme tiêu diệt mầm bệnh khi xâm nhập. 5 Việc sử dụng β-glucan bổ sung hàng bữa vào thức ăn chăn nuôi với lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích tiêu diệt các hại khuẩn và các virus gây bệnh, triệt tiêu các mầm bệnh và đồng thời tạo cơ hội cho lợi khuẩn trong đường ruột, bao gồm cả các lợi khuẩn bổ sung vào đường tiêu hoá theo thức ăn và cả hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột phát triển mạnh hơn. Điều trị bệnh bằng kháng sinh làm giảm nghiêm trọng hệ vi sinh vật bản địa trong đường ruột. Cơ chế hỗ trợ sức khoẻ vật nuôi của β-glucan được mô tả bao gồm: i/ Tạo ra các bạch cầu để phá huỷ nguồn bệnh; ii/ Huy động tế bào tới vùng tổn thương; iii/ Tạo ra các trung gian, hoạt hoá oxy và các nhân tố khác giết chết vật thể lạ.
Trong thuỷ sản, người ta dùng β-glucan thành công trong việc tăng cường miễn dịch với khuẩn gây bệnh thuộc nhóm Vibrio, thậm chí với virus đốm trắng trên một số loài tôm biển, tôm sú Penaeus môndon, tôm he Nhật bản Marsupenaeusjaponicas, tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei, tôm he Ấn độ Fenneropenaeus chnensis, tôm thẻ chân vàng Farfantepenaeus californiensis và tôm SaoPaulo Farfantepennaeus paulensis. Bổ sung 0,2% β-glucan trong khẩu phần có tác dụng tăng khả năng miễn dịch của tôm, tăng tỷ lệ sống với lóc bông, tăng tốc độ tăng trưởng và hệ số miễn dịch tăng. Tăng tỷ lệ sống với cá hồi đại dương khi sử dụng hàng ngày chỉ với liều 1g/ kg thức ăn. Trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta dùng β-glucan bổ sung thức ăn cho gà tỷ lệ 0,1% hạn chế được sự xâm nhập và phát triển Samonella trong gan và lá lách, thậm chí có khả năng hỗ trợ tăng trọng và hệ số chuyển hoá thức ăn của gà.
β-glucan có tác động tích cực tới heo. Cho heo cai sữa ăn 0,025% cải thiện được tốc độ tăng trưởng và chống lại Steptococcus sui, E. Ngày nay việc bổ sung β-glucan vào thức ăn cho vật nuôi đã được phổ biến rộng rãi. Chất lượng chế phẩm phụ thuộc nguồn gốc và phương pháp trích ly.
Nấm Aureobasidium pullulans Chi Aureobasidium thuộc ngành Ascomycota, bộ Dothideales, họ Dothideaceae. Đến nay, Aureobasidium spp.