Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh ngành chăn nuôi Việt Nam đang phát triển mạnh mẽ, việc sử dụng kháng sinh và các chất kích thích tăng trưởng không kiểm soát đã gây ra nhiều hệ lụy nghiêm trọng như giảm chất lượng sản phẩm, ảnh hưởng sức khỏe người tiêu dùng và tạo ra rào cản xuất khẩu. Theo ước tính, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi chiếm tỷ lệ lớn trong tổng lượng kháng sinh tiêu thụ, dẫn đến hiện tượng kháng thuốc gia tăng. Trước thực trạng này, việc tìm kiếm các sản phẩm sinh học có khả năng kích thích miễn dịch, thay thế kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi trở nên cấp thiết.

Luận văn tập trung vào phân lập và tuyển chọn chủng nấm Aureobasidium pullulans từ các loại quả như táo và nho tại Hà Nội và Hưng Yên, nhằm sản xuất β-glucan tan ngoại bào – một polysaccharide có hoạt tính sinh học cao, giúp tăng cường miễn dịch và sức khỏe vật nuôi. Mục tiêu cụ thể là chọn lọc được chủng A. pullulans có khả năng sinh tổng hợp β-glucan tan cao, đồng thời tối ưu hóa điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất sản xuất. Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn 2019-2021, tại phòng thí nghiệm Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với phạm vi tập trung vào các chủng phân lập từ quả táo và nho.

Ý nghĩa của nghiên cứu thể hiện qua việc cung cấp giải pháp sinh học thay thế kháng sinh trong chăn nuôi, góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm, bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng và thúc đẩy phát triển chăn nuôi bền vững. Sản phẩm β-glucan tan có khối lượng phân tử thấp, dễ hòa tan và hấp thu, mang lại hiệu quả kích thích miễn dịch vượt trội so với các dạng β-glucan không tan truyền thống.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sau:

  • Cấu trúc và hoạt tính của β-glucan: β-glucan là chuỗi polysaccharide gồm các đơn phân glucose liên kết β-glycoside, phổ biến nhất là dạng β-(1,3;1,6)-glucan có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt trong kích thích miễn dịch. β-glucan tan do A. pullulans sản xuất có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, dễ hòa tan và hấp thu, khác biệt với β-glucan không tan có khối lượng phân tử lớn (2000-5000 kDa) từ nấm men bia.

  • Mô hình sản xuất exopolysaccharide (EPS) từ vi sinh vật: EPS ngoại bào do A. pullulans tiết ra có cấu trúc β-glucan tan, được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và y sinh nhờ khả năng kích thích thực bào và tăng cường miễn dịch.

  • Lý thuyết tối ưu hóa điều kiện lên men: Thiết kế thí nghiệm Box-Behnken (BBD) và phương pháp tối ưu đáp ứng bề mặt được áp dụng để xác định ảnh hưởng của các biến độc lập như nồng độ sucrose, (NH4)2SO4 và KH2PO4 đến sản lượng β-glucan, từ đó xây dựng mô hình hồi quy đa thức bậc hai nhằm tối ưu hóa điều kiện sản xuất.

Các khái niệm chính bao gồm: β-glucan tan, exopolysaccharide (EPS), Aureobasidium pullulans, thiết kế thí nghiệm Box-Behnken, và tối ưu đáp ứng bề mặt.

Phương pháp nghiên cứu

  • Nguồn dữ liệu: Mẫu quả táo và nho được thu thập tại huyện Đan Phượng, Gia Lâm (Hà Nội) và huyện Văn Giang (Hưng Yên). Các chủng vi sinh vật phân lập được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

  • Phương pháp phân lập và tuyển chọn: Mẫu quả được xử lý, pha loãng và cấy trên môi trường PDA có bổ sung kháng sinh streptomycin để hạn chế vi khuẩn. Sau 2-3 ngày ủ, các khuẩn lạc giả nấm men được tách thuần chủng và đánh giá khả năng sinh tổng hợp β-glucan qua phương pháp tủa ethanol và định lượng bằng KIT Megazyme β-Glucan Assay.

  • Phương pháp định danh sinh học phân tử: DNA được tách chiết từ chủng chọn lọc, khuếch đại vùng ITS bằng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4, sau đó giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank để xác định loài.

  • Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men: Chủng A. pullulans được nuôi cấy trên 6 môi trường khác nhau để lựa chọn môi trường tối ưu. Thiết kế Box-Behnken với ba biến độc lập (nồng độ sucrose, (NH4)2SO4, KH2PO4) được sử dụng để tối ưu sản lượng β-glucan. Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần, dữ liệu phân tích bằng ANOVA và mô hình hồi quy đa thức bậc hai.

  • Phân tích enzyme và hoạt tính kháng khuẩn: Hoạt tính enzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease, lipase) được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Khả năng kháng vi khuẩn và nấm được khảo sát bằng phương pháp đục lỗ thạch với các chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh phổ biến.

  • Timeline nghiên cứu: Quá trình phân lập, tuyển chọn và định danh chủng diễn ra trong năm 2019-2020; tối ưu hóa điều kiện lên men và đánh giá hoạt tính sinh học thực hiện trong năm 2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và tuyển chọn chủng A. pullulans có khả năng sinh β-glucan tan cao: Từ 57 chủng phân lập từ quả táo và nho, 6 chủng có khả năng sinh EPS cao được chọn (H5, H8, H12, H26, HY5, HY10). Chủng H8 đạt sản lượng β-glucan cao nhất với 17,25 ± 0,17 g/L sau 5 ngày lên men ở 28°C trên môi trường PM.

  2. Định danh sinh học phân tử: Chủng H8 được xác định là Aureobasidium pullulans với độ tương đồng trình tự ITS trên 99% so với dữ liệu GenBank.

  3. Tối ưu hóa điều kiện lên men: Môi trường PM (sucrose 30 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, KH2PO4 5 g/L) cho sản lượng β-glucan cao nhất (16,75 ± 0,56 g/L). Thiết kế Box-Behnken xác định mô hình hồi quy đa thức bậc hai với phương trình:

$$ Y = 15,4 + 1,47A + 1,97B + 1,88C + AB - 0,4375AC + 1,94BC - 7,2A^2 - 2,45B^2 - 1,26C^2 $$

trong đó A, B, C lần lượt là nồng độ sucrose, KH2PO4 và (NH4)2SO4.

  1. Hoạt tính enzyme và kháng khuẩn: Chủng H8 có khả năng sinh enzyme cellulase, lipase và protease ở mức yếu đến trung bình. Tuy nhiên, các chủng nấm men đen không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn và nấm gây bệnh được kiểm định.

Thảo luận kết quả

Sản lượng β-glucan tan của chủng H8 đạt mức cao so với nhiều nghiên cứu trước đây, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học cho chăn nuôi. Việc β-glucan có khối lượng phân tử thấp và tan trong nước giúp tăng khả năng hấp thu và hiệu quả kích thích miễn dịch, vượt trội so với β-glucan không tan từ nấm men bia có khối lượng phân tử lớn và khó tiêu hóa.

Môi trường PM với thành phần sucrose, (NH4)2SO4 và KH2PO4 được tối ưu hóa cho thấy vai trò quan trọng của nguồn cacbon và nitơ trong quá trình tổng hợp EPS. Mô hình hồi quy đa thức bậc hai giúp dự đoán và điều chỉnh các yếu tố môi trường để đạt sản lượng tối ưu, phù hợp với các nghiên cứu ứng dụng thiết kế thí nghiệm trong công nghệ sinh học.

Khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng H8 tuy yếu nhưng phù hợp với đặc tính của nấm men đen Aureobasidium pullulans, vốn không phải là nguồn enzyme công nghiệp chủ lực. Việc không phát hiện hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp cho thấy β-glucan có thể phát huy tác dụng thông qua cơ chế kích thích miễn dịch hơn là tác động trực tiếp lên mầm bệnh.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ đường bao và bề mặt phản ứng 3D minh họa ảnh hưởng của các biến môi trường đến sản lượng β-glucan, cũng như bảng so sánh sản lượng β-glucan giữa các chủng phân lập.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Ứng dụng chủng A. pullulans H8 trong sản xuất β-glucan tan: Khuyến nghị sử dụng chủng H8 với điều kiện lên men tối ưu trên môi trường PM để sản xuất β-glucan làm phụ gia thức ăn chăn nuôi, nhằm tăng cường miễn dịch và giảm sử dụng kháng sinh. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng, chủ thể: doanh nghiệp công nghệ sinh học và nhà máy sản xuất thức ăn chăn nuôi.

  2. Phát triển quy trình công nghiệp thân thiện môi trường: Áp dụng quy trình tách chiết β-glucan không sử dụng NaOH hay acid vô cơ, giảm thiểu tác động môi trường và chi phí sản xuất. Thời gian: 12 tháng, chủ thể: phòng thí nghiệm và nhà máy sản xuất.

  3. Nghiên cứu bổ sung về hiệu quả sinh học in vivo: Thực hiện các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng trên vật nuôi để đánh giá tác dụng kích thích miễn dịch, tăng trưởng và phòng bệnh của β-glucan tan. Thời gian: 12-18 tháng, chủ thể: viện nghiên cứu và trung tâm nghiên cứu chăn nuôi.

  4. Mở rộng phân lập và tuyển chọn chủng từ các nguồn nguyên liệu khác: Khuyến khích nghiên cứu thêm các chủng A. pullulans từ các loại quả và môi trường khác nhằm đa dạng hóa nguồn nguyên liệu và nâng cao hiệu quả sản xuất. Thời gian: liên tục, chủ thể: các cơ sở nghiên cứu và trường đại học.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Công nghệ thực phẩm và Công nghệ sinh học: Luận văn cung cấp kiến thức chuyên sâu về phân lập vi sinh vật, kỹ thuật lên men và tối ưu hóa sản xuất polysaccharide sinh học.

  2. Doanh nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: Tham khảo để phát triển sản phẩm thức ăn bổ sung β-glucan tan, nâng cao chất lượng và giá trị dinh dưỡng, đồng thời giảm thiểu sử dụng kháng sinh.

  3. Cơ quan quản lý và hoạch định chính sách trong lĩnh vực nông nghiệp và chăn nuôi: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng chính sách khuyến khích sử dụng sản phẩm sinh học thay thế kháng sinh trong chăn nuôi an toàn sinh học.

  4. Viện nghiên cứu và trung tâm phát triển công nghệ sinh học: Hướng dẫn quy trình phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện lên men vi sinh vật sản xuất polysaccharide có hoạt tính sinh học cao.

Câu hỏi thường gặp

  1. β-glucan tan là gì và có ưu điểm gì so với β-glucan không tan?
    β-glucan tan là polysaccharide có khả năng hòa tan trong nước, có khối lượng phân tử thấp (~100 kDa), dễ hấp thu và kích thích miễn dịch hiệu quả hơn so với β-glucan không tan có khối lượng phân tử lớn và khó tiêu hóa.

  2. Tại sao chọn Aureobasidium pullulans để sản xuất β-glucan?
    A. pullulans là nấm men đen có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide dạng β-glucan tan với hoạt tính sinh học cao, dễ nuôi cấy và thích nghi với nhiều điều kiện môi trường, phù hợp cho sản xuất công nghiệp.

  3. Phương pháp tối ưu hóa điều kiện lên men được áp dụng như thế nào?
    Thiết kế thí nghiệm Box-Behnken kết hợp phân tích đáp ứng bề mặt được sử dụng để xác định ảnh hưởng và tương tác của các yếu tố môi trường như sucrose, (NH4)2SO4 và KH2PO4 đến sản lượng β-glucan, từ đó xây dựng mô hình dự đoán và tối ưu hóa.

  4. β-glucan có tác dụng gì trong thức ăn chăn nuôi?
    β-glucan kích thích hệ miễn dịch tự nhiên, tăng hoạt động của đại thực bào, giúp phòng chống bệnh do vi khuẩn và virus, cải thiện tiêu hóa và tăng tốc độ tăng trưởng vật nuôi, đồng thời giảm nhu cầu sử dụng kháng sinh.

  5. Quy trình tách chiết β-glucan trong nghiên cứu có ưu điểm gì?
    Quy trình sử dụng xử lý nhiệt và tủa bằng ethanol, không dùng hóa chất độc hại như NaOH hay acid, thân thiện với môi trường, cho sản phẩm β-glucan có độ tinh khiết cao (>90%) và giữ nguyên hoạt tính sinh học.

Kết luận

  • Phân lập thành công 6 chủng Aureobasidium pullulans spp. có khả năng sinh tổng hợp β-glucan tan ngoại bào cao, trong đó chủng H8 đạt sản lượng tối đa 17,25 ± 0,17 g/L sau 5 ngày lên men.
  • Chủng H8 được định danh chính xác bằng phương pháp sinh học phân tử với độ tương đồng trên 99% so với dữ liệu GenBank.
  • Môi trường PM với thành phần sucrose, (NH4)2SO4 và KH2PO4 được tối ưu hóa bằng thiết kế Box-Behnken, giúp nâng cao sản lượng β-glucan lên mức tối ưu.
  • Chủng H8 có khả năng sinh enzyme ngoại bào yếu và không có hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp, phù hợp với vai trò sản xuất polysaccharide kích thích miễn dịch.
  • Nghiên cứu mở ra hướng phát triển sản phẩm β-glucan tan sinh học thân thiện môi trường, ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi để tăng cường miễn dịch và giảm sử dụng kháng sinh.

Next steps: Triển khai thử nghiệm ứng dụng β-glucan tan trong thức ăn chăn nuôi thực tế, mở rộng phân lập chủng từ các nguồn nguyên liệu khác và phát triển quy trình sản xuất công nghiệp.

Call-to-action: Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp trong lĩnh vực công nghệ sinh học và chăn nuôi được khuyến khích hợp tác để phát triển và ứng dụng sản phẩm β-glucan tan nhằm nâng cao hiệu quả và bền vững ngành chăn nuôi Việt Nam.