CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Nguồn gốc của chitosan Chitin là một trong những polymer sinh học có nhiều trong tự nhiên chỉ sau cellulose, được tìm thấy trong thành phần từ các nguồn khác nhau như vỏ động vật giáp xác (tôm, cua, sò), thành tế bào của nấm, côn trùng… [1]. Các nguồn nguyên liệu thô chiếm khoảng 20 – 30% chitin, 20 – 40% protein, 30 – 60% khoáng chất và gần 14% lipid [2]. Chitin có nguồn gốc từ vỏ động vật giáp xác đầu tiên được loại bỏ canxi cacbonat (CaCO3) bằng axit clohydric (HCl) loãng, sau đó khử protein bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH), tiếp tục tiến hành quá trình khử acetyl hóa bằng dung dịch NaOH 40 – 50%, mức độ acetyl hóa trên 50% [3].
Chitosan là sản phẩm deacetyl hoá của chitin, một polymer tự nhiên mạch thẳng có trọng lượng phân tử cao, bao gồm các D-glucosamine liên kết với các N- acetyl-D-glucosamine bằng liên kết β-1,4-glucoside được mô tả như hình 1.1, sự phân bố các tiểu đơn vị này phụ thuộc vào phương pháp điều chế chitosan [4, 5]. Chitosan và các dẫn xuất của nó được rất nhiều nhà nghiên cứu quan tâm bởi những tính chất độc đáo được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực như dược phẩm, y học, dệt may, nông nghiệp… [3]. Đặc biệt trong nông nghiệp, chitosan và dẫn xuất oligochitosan được tìm hiểu và nghiên cứu ứng dụng trong thuốc bảo vệ thực vật với những tính chất nổi bậc như khả năng tạo màng, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa trong bảo quản nông sản và kích thích phản ứng phòng vệ của cây trồng chống lại vi sinh vật [6]. Cấu trúc hóa học của phân tử chitin (a) và chitosan (b) [2].
Tính chất của chitosan 2 1. Tính chất lý hoá của chitosan Khả năng hòa tan của chitosan trong môi trường acid yếu như acid acetic, acid lactic, acid citric… được giải thích dựa trên sự có mặt của các nhóm -NH2 được proton hóa, khi đó giá trị pKa xấp xỉ 6,5. Khi số nhóm amin được proton hóa lớn hơn 50%, chitosan trở nên dễ hòa tan hơn [7]. Ngoài ra, khả năng hòa tan của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như khối lượng phân tử, mức độ acetyl hóa, độ pH, nhiệt độ và độ kết tinh của polymer [8].2 mô tả các nhóm chức trong cấu trúc phân tử chitosan, mỗi đơn vị monomer bao gồm một nhóm amin (C2), hai nhóm hydroxyl (C6, C3), liên kết glycosidic và nhóm acetamide cũng được xem là một nhóm chức trong cấu trúc hoá học.
Các nhóm chức này cho phép thực hiện một số phản ứng tạo ra các dẫn xuất khác của chitosan với các đặc tính hoàn toàn mới [8]. Các nhóm chức trong cấu trúc hoá học của chitosan [8]. Tính kháng khuẩn của chitosan Chitosan với hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng được ứng dụng rất nhiều trong nông nghiệp để bảo vệ thực vật [6]. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan được mô tả như hình 1.3, do sự tương tác giữa các nhóm amine điện tích dương và các nhóm carboxylate điện tích âm trên bề mặt tế bào vi khuẩn đã phá vỡ cấu trúc màng tế bào và tính toàn vẹn, gây rò rỉ các thành phần nội bào và chất điện giải ra môi trường bên ngoài làm chết vi sinh vật.
Ngoài ra, tính chất kháng khuẩn của chitosan còn phụ thuộc vào khối lượng phân tử, cho phép chitosan xuyên qua màng tế bào, vào tế bào 3 và cản trở sự tổng hợp các chức năng của DNA và RNA dẫn đến cái chết của vi sinh vật. Trong khi đó, chitosan có khối lượng phân tử cao bao bọc bề mặt tế bào và ngăn cản các chất dinh dưỡng vào tế bào vi sinh vật, làm tế bào đói và gây chết tế bào [9]. Cơ chế kháng khuẩn gram âm (trái) và gram dương (phải) của chitosan [6]. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan như trọng lượng phân tử, nồng độ, nguồn gốc nguyên liệu, độ pH, chủng loài và số lượng vi khuẩn… cũng được khảo sát.
Cụ thể, chitosan có mức độ deacetyl hóa cao hơn có tác dụng kháng khuẩn tốt hơn. Bên cạnh đó, tính kháng khuẩn của chitosan tăng lên khi có giá trị pH thấp do sự proton hóa và khả năng hòa tan cao hơn trong môi trường axit [5]. Hơn nữa những nghiên cứu về mức độ kháng khuẩn tương ứng với khối lượng phân tử khác nhau của chitosan cũng được tiến hành để đánh giá. Trong thử nghiệm kháng khuẩn trên dâu tây cho kết quả nghiên cứu màng chitosan có khối lượng phân tử cao và hàm lượng chitosan cao có khả năng kháng khuẩn hai loại vi khuẩn là Staphylococcus aureus (S.
aureus) và Escherichia coli (E. Từ những công trình nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu khác nhau giữa các loài từ 10– 1000 ppm. Các dẫn xuất amoni bậc bốn của chitosan bao gồm N,N,N- trimethylchitosan, N–propyl–N,N-dimethylchitosan và N-furfuryl-N,N- dimethylchitosan đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của E.
coli, đặc biệt là trong môi trường axit. Tương tự, một số dẫn xuất 4 khác của chitin và chitosan đã được chứng minh là có khả năng ức chế các vi khuẩn E. aureus và một số loài Bacillus [11]. Tính kháng nấm của chitosan Chitosan có khả năng kháng nhiều loại nấm gây bệnh cho thực vật như Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Lasiodiplodia theobromae, Alternaria tenuissima và Fusarium oxysporum.
Ngoài khả năng kích thích sức đề kháng của thực vật, chitosan tác động trực tiếp như một chất ngăn ngừa và diệt nấm bằng cách liên kết với bề mặt tế bào của nấm dẫn đến sự thẩm thấu của màng sinh chất và rò rỉ các vật liệu nội bào. Nhiều loài Aspergillus có khả năng gây thối rữa trái cây, gây bệnh cho cây trồng và dẫn đến thiệt hại về mặt kinh tế trong nông nghiệp [12]. Nồng độ ức chế tăng trưởng tối thiểu của các loài từ 10 đến 5000 ppm, khả năng kháng nấm tối đa của chitosan thường được quan sát thấy xung quanh giá trị pKa của nó (pH=6. Với tỷ lệ 1 mg/mL, chitosan có thể làm giảm sự phát triển trong môi trường in vitro của một số loại nấm và oomycetes ngoại trừ Zygomycetes [13].
Một số nghiên cứu cho thấy khả năng kháng nấm gây hại cho thực vật của chitosan như nấm Colletotrichum gloeosporides gây thối rữa xoài, nấm Penicillium expansum gây bệnh mốc xanh ở táo, nấm Phytophthora capsici gây bệnh bạc lá và thối trái của ớt, nấm Physalospora piricola và nấm Alternaria kikuchianaTanaka trên lê, nấm Botrytis cinerea gây thối chùm nho, nấm Cladosporium spp. và Rhizopus spp. ở dâu ngoài ra còn có một số vi khuẩn như E. Khả năng kích thích phản ứng phòng vệ của thực vật Ngoài khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, chitosan còn giúp kích thích phản ứng phòng vệ của thực vật chống lại vi sinh vật.
Tăng sức đề kháng của thực vật đối với mầm bệnh thông qua việc điều tiết các enzyme liên quan đến hệ thống phòng vệ và thúc đẩy hoạt động của các protein chống lại bệnh (PR – protein) thông qua việc kích hoạt các thụ thể trên bề mặt tế bào hoặc màng từ các tác động bên trong lên DNA của thực vật, từ đó cấu trúc ảnh hưởng đến quá trình phiên mã gen. Ngoài ra, các tác nhân bên ngoài cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây, kích thích tính kháng sinh của cây bằng cách mô phỏng sự hiện diện của mầm bệnh trên thực vật [14]. Bên cạnh việc điều tiết các enzyme, chitosan còn thúc đẩy hoạt động của các protein chống lại bệnh như chitinase và β-1,3-glucanase (hai loại protein PR) tham gia 5 vào quá trình chống lại mầm bệnh do khả năng làm phân hủy một phần thành phần tế bào các tác nhân gây bệnh [15]. Sự gia tăng hoạt động của chitinase và β-1,3- glucanase bởi chitosan được chứng minh trong các nghiên cứu như bảo quản trái cây, quả cam sau 24 giờ xử lý với chitosan cho thấy hoạt động của enzyme đã góp phần làm giảm đốm đen trên quả [16].
Một nghiên cứu cho thấy chitosan có khả năng kháng nấm F. oxysporum ở những cây cà chua khi được bón gốc hoặc phun lá bằng cách hạn chế sự phát triển của mầm bệnh đối với các mô rễ bên ngoài và tạo ra một số phản ứng phòng vệ. Hiệu ứng này được giải thích dựa trên sự tích tụ lớn của các hợp chất nấm gây độc tại vị trí xâm nhập và do tính chất tạo màng của chitosan cũng có thể hoạt động như một hàng rào cản trở chất dinh dưỡng ra bên ngoài. Do đó, làm giảm tối đa việc cung cấp các chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển của mầm bệnh [17].
Tính chất của nanochitosan Chitosan thể hiện tính chất chelate hóa đối với các hợp chất vô cơ và hữu cơ khác nhau tạo thành lớp màng sinh học với đặc tính nổi bật về độ ổn định, độ hòa tan và hoạt tính diệt khuẩn phổ rộng đáng kể. Tuy nhiên, chitosan kích thước lớn có độ hòa tan thấp hơn trong các dung môi có nước làm hạn chế hoạt động diệt khuẩn trên phạm vi rộng của nó. So với chitosan dạng khối, các hạt nano chitosan thể hiện tính linh hoạt cao trong các tính chất sinh học do các đặc tính hóa lý bị thay đổi như: kích thước, diện tích bề mặt, hiệu quả bao bọc, bản chất cation, các nhóm chức hoạt động đơn lẻ hoặc pha trộn với các hợp chất khác… [6]. Hiệu quả kháng nấm của nanochitosan đối với chủng nấm Cercospora sp.
và Corticium salmonicola Berk. được báo cáo rằng trên 97% và thấp hơn đối với chủng Phanerochaete salminicolor là 76,86% [18]. Do đó, các hạt nanochitosan có tiềm năng sử dụng làm chất kháng khuẩn và kháng nấm tự nhiên, hiệu quả cao và an toàn [19]. Phương pháp tổng hợp nanochitosan Nanochitosan được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau bao gồm gel hóa ion, vi nhũ tương, khuếch tán dung môi nhũ hóa, phức hợp polyelectrolyte và phương pháp micell đảo.
Trong đó, phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là gel 6 hóa ion với ưu điểm đơn giản và không áp dụng lực cắt cao hoặc sử dụng dung môi hữu cơ [20]. Phương pháp gel ion hóa: dựa trên sự tương tác giữa các nhóm điện tích trái dấu bao gồm nhóm amin tích điện dương của chitosan và nhóm polyanion tích điện âm của tripolyphosphat được mô tả như hình 1. Các hạt nanochitosan được hình thành dưới sự khuấy trộn cơ học mạnh mẽ ở nhiệt độ phòng. Kích thước và điện tích bề mặt của các hạt có thể được điều chỉnh bằng cách thêm chất ổn định [21].
Cơ chế tổng hợp nanochitosan bằng phương pháp gel ion [22].