Tổng quan nghiên cứu

Trong bối cảnh khoa học kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, việc ứng dụng các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưu tiên nhằm thay thế các hợp chất hóa học truyền thống. Pullulan, một polysaccharide sinh học được tổng hợp từ nấm Aureobasidium pullulans, đã thu hút sự quan tâm nhờ tính chất thân thiện môi trường, khả năng tạo màng mỏng, độ nhớt ổn định và ứng dụng đa dạng trong thực phẩm, dược phẩm và y sinh học. Đồng thời, công nghệ nano bạc (AgNPs) với kích thước từ 1-100 nm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn vượt trội so với bạc thông thường, mở ra nhiều hướng ứng dụng trong y tế, thực phẩm và công nghiệp.

Luận văn tập trung nghiên cứu quy trình tinh sạch pullulan từ quá trình lên men sinh học và tổng hợp các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử và chất ổn định (Pu-AgNPs), đồng thời đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm nano bạc thu được. Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2021, với mục tiêu nâng cao hiệu quả thu nhận pullulan tinh khiết và phát triển công nghệ tổng hợp nano bạc thân thiện môi trường, an toàn và hiệu quả.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển vật liệu sinh học ứng dụng trong y sinh học và công nghiệp, góp phần mở rộng ứng dụng của pullulan và nano bạc trong các lĩnh vực kháng khuẩn, bảo quản thực phẩm và dược phẩm. Các chỉ số như hiệu suất thu hồi pullulan, kích thước hạt nano bạc, phổ hấp thụ UV-Vis và hoạt tính kháng khuẩn được sử dụng làm metrics đánh giá hiệu quả nghiên cứu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên hai nền tảng lý thuyết chính: lý thuyết về cấu trúc và tính chất của pullulan, và cơ chế kháng khuẩn của nano bạc.

  1. Lý thuyết về pullulan: Pullulan là polysaccharide mạch thẳng gồm các đơn vị maltotriose liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside với tỷ lệ 3:2. Pullulan có khối lượng phân tử dao động khoảng 2,5×10^5 dalton, tan tốt trong nước, tạo dung dịch nhớt ổn định, có khả năng tạo màng film trong suốt, không độc hại và tương thích sinh học cao. Pullulan được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và y sinh học như làm vỏ bao thuốc, hệ phân phối thuốc, kỹ thuật mô và chuyển gen.

  2. Cơ chế kháng khuẩn của nano bạc: Nano bạc (AgNPs) có kích thước từ 1-100 nm, thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhờ ion Ag+ tương tác với màng tế bào vi khuẩn, vô hiệu hóa enzyme hô hấp, phá vỡ thành tế bào và ngăn cản sự sinh trưởng của vi khuẩn. Các cơ chế này giúp nano bạc tiêu diệt đa dạng vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn Gram âm, Gram dương, nấm và virus, với hiệu quả diệt khuẩn lên đến 99%. Nano bạc còn có ưu điểm không gây kháng thuốc và ít ảnh hưởng đến tế bào động vật.

  3. Khái niệm chính:

    • Pullulanase: enzyme đặc hiệu thủy phân pullulan thành maltotriose.
    • Phương pháp tẩy màu bằng H2O2: sử dụng oxy nguyên tử sinh ra trong môi trường kiềm để loại bỏ sắc tố và tạp chất.
    • Phương pháp kết tủa pullulan: sử dụng dung môi hữu cơ như isopropanol (IPA) bổ sung muối vô cơ để thu hồi pullulan tinh khiết.
    • Phổ hấp thụ UV-Vis: dùng để xác định sự hình thành nano bạc qua đỉnh hấp thụ plasmon bề mặt trong khoảng 400-450 nm.
    • Phương pháp phân tích FT-IR và SEM: xác định cấu trúc hóa học và kích thước hạt nano bạc.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng nguồn nguyên liệu pullulan sinh tổng hợp từ chủng nấm Aureobasidium pullulans nuôi cấy trong điều kiện lên men hiếu khí. Các bước nghiên cứu chính gồm:

  • Tinh sạch pullulan: Dịch lên men được lọc thô và tinh qua màng lọc 0,3-0,45 µm, khử trùng, siêu lọc bằng màng polycarbon kích thước <0,1 µm để loại bỏ tạp chất, protein và tế bào. Tẩy màu bằng H2O2 trong môi trường kiềm (pH 11-13) và nhiệt độ 80-90°C, tối ưu nồng độ H2O2 và thời gian xử lý dựa trên đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 320 nm theo định luật Beer. Thu hồi pullulan bằng phương pháp kết tủa với isopropanol bổ sung 0,1% CaCl2, so sánh hiệu suất với ethanol.

  • Tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs: Sử dụng pullulan làm chất khử và chất ổn định, phản ứng với AgNO3 trong các điều kiện khác nhau về nồng độ pullulan, nồng độ AgNO3 và thời gian phản ứng. Sản phẩm được xác định bằng phổ UV-Vis, FT-IR và kính hiển vi điện tử quét (SEM) để đo kích thước hạt.

  • Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật: Thử nghiệm khuếch tán giếng thạch để đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) và Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) của nano bạc Pu-AgNPs.

  • Cỡ mẫu và chọn mẫu: Các mẫu pullulan và nano bạc được lấy từ quá trình lên men và tổng hợp trong phòng thí nghiệm của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phân tích số liệu sử dụng các phương pháp định lượng chuẩn, đo quang phổ và phân tích hình ảnh.

  • Timeline nghiên cứu: Quá trình nghiên cứu kéo dài trong năm 2021, bao gồm các giai đoạn lên men, tinh sạch pullulan, tổng hợp nano bạc, phân tích và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Tinh sạch và thu nhận pullulan:

    • Hiệu suất thu hồi pullulan tối đa đạt khoảng 85% khi sử dụng isopropanol (IPA) với tỷ lệ thể tích IPA : dịch lên men là 2,5:1, bổ sung 0,1% CaCl2.
    • Quá trình tẩy màu bằng H2O2 đạt hiệu quả tối ưu ở pH 12, nhiệt độ 85°C và nồng độ H2O2 12%, giảm độ hấp thụ quang ở bước sóng 320 nm xuống dưới 0,1, cho thấy sản phẩm có màu sáng và ít tạp chất.
    • Độ nhớt dung dịch pullulan 10% đo được trong khoảng 132-179 mm²/s, phù hợp với các tiêu chuẩn pullulan thương mại.
    • Phổ FT-IR xác nhận cấu trúc pullulan với các nhóm chức đặc trưng như liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside.

  2. Tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs:

    • Đỉnh hấp thụ plasmon bề mặt của nano bạc Pu-AgNPs xuất hiện trong khoảng 410-460 nm, chứng tỏ sự hình thành hạt nano bạc.
    • Kích thước hạt nano bạc dao động từ 10 đến 55 nm, với hình dạng chủ yếu là hình cầu và phiến, được xác định bằng SEM.
    • Nồng độ pullulan và AgNO3 ảnh hưởng rõ rệt đến kích thước và ổn định của hạt nano; nồng độ AgNO3 12 mM và tỷ lệ pullulan thích hợp cho kết quả tổng hợp tốt nhất.
    • Nano bạc Pu-AgNPs ổn định trong dung dịch keo ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ phòng.

  3. Hoạt tính kháng vi sinh vật:

    • Nano bạc Pu-AgNPs thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn Gram âm và Gram dương với tỷ lệ ức chế phụ thuộc liều lượng.
    • Khuếch tán giếng thạch cho thấy vùng ức chế vi khuẩn E. coli và S. aureus đạt kích thước từ 12 đến 20 mm tùy nồng độ nano bạc.
    • Nano bạc cũng có hoạt tính kháng nấm đối với các chủng Aspergillus spp. và Penicillium spp., mở rộng phạm vi ứng dụng.

Thảo luận kết quả

Quá trình tinh sạch pullulan sử dụng phương pháp kết tủa với IPA bổ sung CaCl2 cho hiệu suất thu hồi cao hơn so với ethanol, đồng thời giảm thiểu tạp chất và độ nhớt phù hợp cho ứng dụng công nghiệp. Kết quả tẩy màu bằng H2O2 trong môi trường kiềm phù hợp với các nghiên cứu trước, cho thấy khả năng loại bỏ sắc tố hiệu quả mà không làm biến đổi cấu trúc pullulan.

Việc sử dụng pullulan làm chất khử và chất ổn định trong tổng hợp nano bạc là một bước tiến quan trọng, tận dụng tính chất sinh học và khả năng tạo màng của pullulan để tạo ra các hạt nano bạc kích thước nhỏ, phân bố đồng đều và ổn định lâu dài. Kích thước hạt nano bạc trong khoảng 10-55 nm phù hợp với vùng kích thước có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất theo báo cáo của ngành.

Hoạt tính kháng khuẩn của Pu-AgNPs được xác nhận qua thử nghiệm khuếch tán giếng thạch, phù hợp với cơ chế tác động của ion Ag+ lên màng tế bào vi khuẩn và enzyme hô hấp. So sánh với các nghiên cứu quốc tế, kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng của nano bạc tổng hợp bằng pullulan trong y sinh học và công nghiệp thực phẩm.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ phổ UV-Vis thể hiện đỉnh hấp thụ plasmon bề mặt, bảng so sánh hiệu suất thu hồi pullulan với các dung môi khác nhau, hình ảnh SEM minh họa kích thước hạt nano và biểu đồ vùng ức chế vi khuẩn theo nồng độ nano bạc.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Tối ưu hóa quy trình tinh sạch pullulan: Áp dụng phương pháp kết tủa với isopropanol bổ sung 0,1% CaCl2 để nâng cao hiệu suất thu hồi và chất lượng sản phẩm. Thời gian thực hiện trong vòng 12 giờ, chủ thể thực hiện là các phòng thí nghiệm công nghiệp và nghiên cứu.

  2. Phát triển công nghệ tổng hợp nano bạc xanh: Sử dụng pullulan làm chất khử và chất ổn định trong tổng hợp nano bạc nhằm giảm thiểu tác động môi trường và chi phí sản xuất. Thời gian nghiên cứu và ứng dụng trong 6-12 tháng, chủ thể là các viện nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học.

  3. Ứng dụng nano bạc Pu-AgNPs trong kháng khuẩn và bảo quản thực phẩm: Đề xuất sử dụng nano bạc trong bao bì thực phẩm, sản phẩm y tế và mỹ phẩm để tăng cường khả năng kháng khuẩn, kéo dài thời gian bảo quản. Chủ thể thực hiện là các công ty sản xuất thực phẩm và dược phẩm, thời gian triển khai 1-2 năm.

  4. Nghiên cứu sâu về độc tính và an toàn sinh học của nano bạc: Tiến hành các nghiên cứu đánh giá tác động lâu dài của nano bạc trên sức khỏe con người và môi trường nhằm đảm bảo sử dụng bền vững. Chủ thể là các tổ chức y tế và môi trường, thời gian nghiên cứu 2-3 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học, Công nghệ sinh học: Nghiên cứu về polysaccharide sinh học, công nghệ nano và ứng dụng trong y sinh học, giúp mở rộng kiến thức và phương pháp nghiên cứu.

  2. Doanh nghiệp sản xuất thực phẩm và dược phẩm: Áp dụng quy trình tinh sạch pullulan và công nghệ nano bạc xanh để phát triển sản phẩm mới có tính năng kháng khuẩn và bảo quản tốt hơn.

  3. Chuyên gia công nghệ nano và vật liệu sinh học: Tham khảo phương pháp tổng hợp nano bạc sử dụng polysaccharide tự nhiên, đánh giá hiệu quả và tính ổn định của hạt nano.

  4. Cơ quan quản lý và chính sách y tế, môi trường: Đánh giá tiềm năng và rủi ro của nano bạc trong ứng dụng thực tế, từ đó xây dựng các quy định an toàn và hướng dẫn sử dụng phù hợp.

Câu hỏi thường gặp

  1. Pullulan là gì và có đặc điểm gì nổi bật?
    Pullulan là polysaccharide sinh học được tổng hợp từ nấm Aureobasidium pullulans, có khả năng tạo màng mỏng, tan tốt trong nước, không độc hại và tương thích sinh học cao. Nó được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và y sinh học nhờ tính chất kết dính và tạo màng.

  2. Tại sao nano bạc có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn bạc thông thường?
    Nano bạc có kích thước nhỏ (1-100 nm) làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, giải phóng ion Ag+ hiệu quả hơn, tương tác mạnh với màng tế bào vi khuẩn, vô hiệu hóa enzyme và phá vỡ thành tế bào, dẫn đến khả năng diệt khuẩn vượt trội.

  3. Phương pháp tổng hợp nano bạc sử dụng pullulan có ưu điểm gì?
    Phương pháp này thân thiện môi trường, sử dụng pullulan làm chất khử và ổn định tự nhiên, giảm thiểu hóa chất độc hại, tạo hạt nano bạc kích thước nhỏ, phân bố đồng đều và ổn định lâu dài, phù hợp cho ứng dụng y sinh và thực phẩm.

  4. Làm thế nào để đánh giá hiệu quả tẩy màu pullulan?
    Hiệu quả tẩy màu được đánh giá bằng đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 320 nm theo định luật Beer. Giá trị hấp thụ giảm cho thấy sản phẩm có màu sáng hơn và ít tạp chất hơn.

  5. Nano bạc Pu-AgNPs có thể ứng dụng trong những lĩnh vực nào?
    Nano bạc Pu-AgNPs có thể ứng dụng trong y tế (kháng khuẩn, tráng thiết bị y tế), công nghiệp thực phẩm (bao bì bảo quản, khử trùng), mỹ phẩm và các sản phẩm tiêu dùng nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn và kéo dài thời gian sử dụng.

Kết luận

  • Đã phát triển thành công quy trình tinh sạch pullulan từ dịch lên men nấm Aureobasidium pullulans với hiệu suất thu hồi khoảng 85% và chất lượng phù hợp tiêu chuẩn.
  • Tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs sử dụng pullulan làm chất khử và ổn định, tạo hạt nano kích thước 10-55 nm, ổn định trong dung dịch keo ít nhất 3 tháng.
  • Nano bạc Pu-AgNPs thể hiện hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với vi khuẩn Gram âm, Gram dương và nấm, mở rộng tiềm năng ứng dụng trong y sinh và công nghiệp thực phẩm.
  • Phương pháp tổng hợp thân thiện môi trường, giảm thiểu hóa chất độc hại, phù hợp phát triển công nghệ xanh trong lĩnh vực nano sinh học.
  • Đề xuất tiếp tục nghiên cứu đánh giá độc tính và ứng dụng thực tế của nano bạc Pu-AgNPs trong các sản phẩm y tế và bảo quản thực phẩm trong vòng 1-3 năm tới.

Quý độc giả và các nhà nghiên cứu quan tâm có thể liên hệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để trao đổi và hợp tác phát triển ứng dụng công nghệ nano bạc xanh từ pullulan.