Đặt vấn đề Thạch tùng răng cƣa, tên khoa học là Huperzia serrata(Thunb.) Trev, là một loài thân thảo, thuộc họ Thông đất(Lycopidiaceae), sinh trƣởng và phát triển tốt ở những nơi ẩm ƣớt trong rừng ở độ cao 350 m – 1700 m, lƣợng mƣa trên 1500 mm, độ ẩm tƣơng đối cao 78%. Ở nƣớc ta chúng phân bố rải rác tại các vùng cao nhƣ Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cƣa là Huperzine A có tác dụng rất lớn trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer, là chứng bệnh gây tử vong ở ngƣời cao tuổi đứng hàng thứ 4 hiện nay. Hiện nay, trên thế giới số lƣợng ngƣời có vấn đề về suy giảm trí nhớ nói chung và ngƣời mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu cầu về những loại thuốc thảo dƣợc có chứa hoạt chất HupA vì thế cũng không ngừng gia tăng đây có thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức loài cây dƣợc liệu này trong tự nhiên.
Cùng với đó Thạch tùng răng cƣa có đặc tính sinh trƣởng chậm, khả năng sinh sản kém, nguồn cây trồng tự nhiên lại đang bị khai thác triệt để đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nƣớc ta, dẫn đến loài Thạch tùng răng cƣa chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu về nguồn nguyên liệu để phục vụ cho sản xuất dƣợc phẩm. Chính vì thế việc tìm ra phƣơng pháp nhân giống loài cây này hết sức cần thiết. Hiện nay việc nhân giống loài thạch tùng răng cƣa đang đƣợc nghiên cứu và chủ yếu nhân giống bằng bào tử và giâm hom thân. Tuy nhiên các phƣơng pháp trên chƣa thực sự đem lại hiệu quả về mặt nhân giống, tỉ lệ cây chết và hiệu số nhân giống thấp, độ đồng đều và sức sống kém, và mất rất nhiều thời gian.
Trong khi hiện nay phƣơng pháp nhân giống in vitro đang đƣợc áp phổ biến trên các loại cây trồng, phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, thời gian nhân giống ngắn, sức chống chịu tốt, độ 1 đồng đều cao.Từ những thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân nhanh và tạo rễ cây Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy in vitro tối ƣu để nhân nhanh và tạo rễ cây Thạch tùng răng cƣa. Yêu cầu - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cƣa.
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng tạo rễ của cây Thạch tùng răng cƣa. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cƣa (Huperzia serrata) 2. Phân loại Thạch tùng răng cƣa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.
Ex Murray) Trevis, (trƣớc đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 loài trên toàn thế giới (M. Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10 loài gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis.
Đây là những loài đƣợc đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh nhƣ Alzheimer, Parkinson, đau, sƣng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhƣợc cơ ở các nƣớc Đông Á (Võ Văn Chi, 2012). Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 loài có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 loài đƣợc phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông (Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cƣa (H.) Trevis); Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngƣợc (Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L. Serm); Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm); Thông đất song (Huperzia carinata (Desv.) Trevis ; Thạch tùng Ford (Huperzia fordii (Backer) R.
Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì). Bốn trong số 12 loài trên đã đƣợc đƣa vào danh mục cây 3 thuốc Việt Nam (2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch tùng răng cƣa. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cƣa (Hình 1) thuộc loài thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm - 40 cm, thân đơn hay lƣỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đƣờng kính khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tƣơng đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cƣa, rễ dạng chùm.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cƣa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là: thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thƣớc 2 – 3 cm x 0,40 cm, tƣơng đối mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng không đều. Bào tử nang ở nách lá không khác lá thƣờng, hình thận, màu vàng tƣơi. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu đến khi trƣởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trƣởng thành bao gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dƣỡng chất gọi là tapetum.
Do đó, túi bào tử của loài Thạch tùng răng cƣa thuộc loại túi bào tử dày (eusporangium). Bào tử đƣợc phát tán ra khi túi bào tử trƣởng thành. Mầm tập trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cƣa ít khi đƣợc nhân giống bằng mầm (H.
Cây Thạch tùng răng cƣa H. 4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cƣa ở khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hƣớng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trƣởng thành là những cây có khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tƣơi, hình thận với kích thƣớc 0,8 mm mọc ở nách lá. Ngƣợc lại, cây tái sinh thƣờng chƣa sản sinh bào tử nang, chiều cao và đƣờng kính nhỏ hơn cây trƣởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đƣờng kính 0,75mm. Đối với cây trƣởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình 11,89 cm - 14,25 cm, đƣờng kính thân trung bình 1,80 mm.
Lá có hình dạng lƣỡi mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ, mép lá có răng cƣa không đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây (Trần Mạnh Đạt & Nguyễn Tân Hiếu, 2016). Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa Theo nghiên cứu của Wang & cộng sự (2011), thạch tùng răng cƣa phân bố trên toàn thế giới nhƣng tập trung nhiều nhất ở khu vực ôn đới phía đông, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á, cũng nhƣ Châu Đại Dƣơng và Trung Mỹ. Chúng sống bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe núi với đất mùn ẩm ƣớt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lƣợng mƣa trên 1500 mm, độ ẩm tƣơng đối cao 78%, hàm lƣợng nƣớc trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lƣợng chất hữu cơ 6,18% - 9,75%. Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cƣa chủ yếu đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia, Nga, Đài Loan, Úc và Cuba.
Ấn Độ phát hiện đƣợc 21 loài thuộc chi Huperzia. Trong đó, 6 loài bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis. cryptomerina sensu Dixit), H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H.
vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. Ex Schrenk & Mart subsp arctica (Grossh ex. (Phlegmariurus Plegmaria (Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cƣa chủ yếu đƣợc tìm thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông Bắc của Ấn Độ nhƣ West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri của Tamilnadu.
Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cƣa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng thƣờng xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sông Dƣơng Tử; nơi đây, lƣợng mƣa hàng năm trên 1000 mm và chúng thƣờng sinh trƣởng trong các môi trƣờng đƣợc che bóng, ẩm ƣớt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến 2700 m. Ở nƣớc ta, cây Thạch tùng răng cƣa thƣờng bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá. Cây thƣờng phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nƣớc biển (Nguyễn Quang Hiệu và cộng sự, 2017). Cây phát triển tốt trong môi trƣờng bóng mờ, ẩm ƣớt và rất ẩm ƣớt, đất có nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế môi trƣờng sống của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam.
Chúng phân bố rải rác tại các vùng cao nhƣ Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo. Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo tồn thiên nhiên đã đƣợc xác định ở Việt Nam bao gồm Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên (tỉnh Lào Cai), Vƣờn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc gia Ngọc Linh (giữa Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum) và Vƣờn Quốc gia Bidoup (tỉnh Lâm Đồng). Trong năm 2013 và 2016, nghiên cứu định danh tại hiện trƣờng đã xác định đƣợc 100 - 300 cá thể còn lại ở mỗi khu vực nghiên cứu. Kết quả ghi nhận này cho thấy, kích thƣớc của quần thể và sự tái sinh khan hiếm của loài cây Thạch tùng răng cƣa trở thành một mối đe dọa lớn đối với sự tồn tại của loài, thông qua sự suy giảm đa dạng di truyền.
Bên cạnh đó, tại khu bảo tồn 6 thiên nhiên Bắc Hƣớng Hóa (Quảng Trị), Trần Mạnh Đạt và cộng sự (2019) đã nghiên cứu và xác định loài Thạch tùng răng cƣa tại đây phân bố ở đai cao từ 1.500 m so với mặt nƣớc biển, chủ yếu ở vị trí sƣờn dốc và địa hình ven khe suối, tập trung nhất ở vị trí ven khe suối (78,09%) ở vùng Pa Thiên với độ dốc dƣới 30o và những vị trí sƣờn dốc cũng thấy sự xuất hiện phân bố của loài nhƣng ít hơn chỉ đạt 21,91% với độ dốc địa hình lớn hơn 30o, chƣa bắt gặp cá thể nào phân bố ở đỉnh núi.