Nghiên cứu môi trưởng nhân nhanh và tạo rễ cây thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cây in vitro

Nghiên cứu môi trường nhân nhanh và tạo rễ cây thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cây in vitro hiệu quả và ứng dụng thực tiễn.

• Tác giả: Phạm Đức Khoa
• Người hướng dẫn: PGS. Vũ Thị Thu Hiền
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
• Đề tài: Nghiên cứu môi trường nhân nhanh và tạo rễ cây thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy in vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• TÓM TẮT NỘI DUNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
• 1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Mục đích và yêu cầu
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata)
• 2.2. Phân loại Thạch tùng răng cưa
• 2.3. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa
• 2.4. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa
• 2.5. Đặc điểm sinh sản
• 2.6. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa
• 2.7. Nhân giống vô tính in vitro ở thực vật. Cơ sở khoa học
• 2.8. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.9. Những vấn đề trong nhân giống in vitro
• 2.10. Giai đoạn chính trong quá trình nhân giống in vitro
• 2.11. Nhân giống vô tính in vitro – Ưu nhược điểm của phương pháp
• 2.12. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở Việt Nam
• 2.12.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới
• 2.12.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam
• 3. PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Vật liệu nghiên cứu
• 3.3. Nội dung nghiên cứu
• 3.3.1. Nghiên cứu khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cưa
• 3.3.2. Nghiên cứu khả năng tạo rễ của chồi Thạch tùng răng cưa
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1
• 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2
• 3.5. Điều kiện nuôi cấy
• 3.6. Các chỉ tiêu theo dõi
• 3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Nghiên cứu khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cưa
• 4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng tạo chồi của Thạch tùng răng cưa
• 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng tạo chồi của Thạch tùng răng cưa
• 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin kết hợp với NAA đến khả năng tạo chồi của chồi Thạch tùng răng cưa
• 4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA kết hợp với Kinetin đến khả năng tạo chồi của chồi Thạch tùng răng cưa
• 4.6. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa in vitro
• 4.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi Thạch tùng răng cưa
• 4.8. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ của chồi Thạch tùng răng cưa
• 4.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IAA đến khả năng tạo rễ của chồi Thạch tùng răng cưa
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Nhân Giống Thạch Tùng Răng Cưa Invitro

Bài viết này tập trung vào nghiên cứu nhân giống cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Phương pháp này hứa hẹn giải quyết các vấn đề về bảo tồn và nhân giống loài cây dược liệu quý hiếm này. Thạch tùng răng cưa chứa hoạt chất Huperzine A, có giá trị trong điều trị các bệnh liên quan đến trí nhớ, đặc biệt là Alzheimer. Tuy nhiên, nguồn cung từ tự nhiên ngày càng khan hiếm do khai thác quá mức và khả năng sinh sản tự nhiên hạn chế. Do đó, nhân giống vô tính in vitro là một giải pháp hiệu quả, cho phép sản xuất hàng loạt cây giống chất lượng cao trong thời gian ngắn. Nghiên cứu này sẽ đi sâu vào các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống invitro, từ đó đề xuất quy trình tối ưu.

1.1. Giá Trị Dược Liệu của Cây Thạch Tùng Răng Cưa

Thạch tùng răng cưa là một loại cây dược liệu quan trọng, được biết đến với hàm lượng cao Huperzine A. Huperzine A được sử dụng rộng rãi trong y học để điều trị các bệnh suy giảm trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer. Nhu cầu về Thạch tùng răng cưa ngày càng tăng do sự gia tăng số lượng bệnh nhân Alzheimer trên toàn thế giới. Điều này đặt ra áp lực lớn lên nguồn cung từ tự nhiên, đòi hỏi các phương pháp nhân giống hiệu quả hơn.

1.2. Hiện Trạng Khai Thác và Bảo Tồn Thạch Tùng Răng Cưa

Việc khai thác quá mức Thạch tùng răng cưa từ tự nhiên đã dẫn đến sự suy giảm nghiêm trọng số lượng cá thể trong các quần thể tự nhiên. Thạch tùng răng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm và khả năng sinh sản hữu tính kém, làm cho việc tái tạo tự nhiên trở nên khó khăn. Điều này đặt loài cây này vào tình trạng nguy cấp, cần có các biện pháp bảo tồn và nhân giống chủ động để ngăn chặn nguy cơ tuyệt chủng. Nuôi cấy in vitro được xem là một giải pháp tiềm năng để bảo tồn đa dạng di truyền và đảm bảo nguồn cung cây dược liệu bền vững.

II. Thách Thức Trong Nhân Giống Thạch Tùng Răng Cưa Truyền Thống

Các phương pháp nhân giống truyền thống của Thạch tùng răng cưa, như sử dụng bào tử hoặc giâm hom, gặp nhiều hạn chế. Tỷ lệ nảy mầm của bào tử thấp và quá trình sinh trưởng của cây con diễn ra rất chậm. Giâm hom cũng cho tỷ lệ thành công không cao và đòi hỏi điều kiện chăm sóc đặc biệt. Ngoài ra, các phương pháp này thường cho ra đời cây giống không đồng đều về chất lượng và sức sống, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng của cây dược liệu. Do đó, cần có một phương pháp nhân giống hiệu quả hơn, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp truyền thống.

2.1. Hạn Chế của Phương Pháp Nhân Giống Bằng Bào Tử

Theo X. Ma và các cộng sự (2006), loài Thạch tùng răng cƣa có sự kết hợp cả hình thức sinh sản hữu tính (bằng bào tử) và sinh sản vô tính (bằng mầm). Cây trƣởng thành tạo ra các lá mới, túi bào tử từ tháng 2 đến tháng 3, và thƣờng túi bào tử mở để giải phóng bào tử vào tháng 12 và tháng 1 năm sau. Quá trình phát triển của bào tử và túi bào tử kéo dài hơn 1 năm

2.2. Nhược Điểm của Kỹ Thuật Giâm Hom Truyền Thống

Giâm hom là một phương pháp nhân giống vô tính đơn giản, nhưng cũng có những nhược điểm khi áp dụng cho Thạch tùng răng cưa. Tỷ lệ ra rễ của hom thường không cao và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi cây mẹ, điều kiện môi trường và chất lượng hom. Cây con từ hom thường có sức sống yếu và khả năng chống chịu kém so với cây con từ hạt hoặc nuôi cấy in vitro.

III. Giải Pháp Nuôi Cấy In Vitro Nhân Giống Thạch Tùng Răng Cưa

Nuôi cấy in vitro là một phương pháp nhân giống vô tính tiên tiến, cho phép sản xuất hàng loạt cây giống trong điều kiện kiểm soát. Phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống, như hệ số nhân giống cao, thời gian nhân giống ngắn, cây giống đồng đều và sạch bệnh. Nuôi cấy in vitro đặc biệt phù hợp với các loài cây quý hiếm, khó nhân giống bằng các phương pháp thông thường, như Thạch tùng răng cưa. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy in vitro Thạch tùng răng cưa, từ đó xây dựng quy trình nhân giống hiệu quả.

3.1. Ưu Điểm Vượt Trội của Phương Pháp Nhân Giống Invitro

Phương pháp nhân giống invitro mang lại nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống. Hệ số nhân giống cao cho phép sản xuất một số lượng lớn cây giống từ một mẫu vật ban đầu. Thời gian nhân giống ngắn giúp đáp ứng nhanh chóng nhu cầu thị trường. Cây giống đồng đều về chất lượng và sạch bệnh, đảm bảo năng suất và chất lượng của cây dược liệu. Độ thuần di truyền cũng được bảo tồn trong quá trình nhân giống vô tính.

3.2. Các Giai Đoạn Chính trong Quy Trình Nuôi Cấy In Vitro

Quy trình nuôi cấy in vitro bao gồm nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự thành công của quá trình nhân giống. Các giai đoạn chính bao gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu vật, tạo chồi, ra rễ và acclimatization. Việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy ở mỗi giai đoạn là yếu tố then chốt để đạt được hiệu quả nhân giống cao.

3.3. Yếu Tố Ảnh Hưởng đến Hiệu Quả Nhân Giống Invitro

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình nhân giống invitro, bao gồm: thành phần môi trường nuôi cấy, nồng độ hormone thực vật, điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp và điều chỉnh nồng độ hormone thực vật một cách chính xác là rất quan trọng để kích thích sự phát triển của chồi và rễ. Các yếu tố môi trường cũng cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển tốt của cây.

IV. Nghiên Cứu Tạo Chồi Thạch Tùng Răng Cưa Bằng Nuôi Cấy Invitro

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định môi trường nuôi cấy tối ưu để tạo chồi Thạch tùng răng cưa trong điều kiện in vitro. Các thí nghiệm được thực hiện với các loại môi trường khác nhau, bổ sung các loại hormone thực vật như BA (Benzyladenine) và Kinetin với các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy, một số công thức môi trường nhất định cho hệ số nhân chồi cao hơn so với các công thức khác. Việc lựa chọn đúng loại và nồng độ hormone thực vật là rất quan trọng để kích thích sự phát triển của chồi in vitro.

4.1. Ảnh Hưởng của Nồng Độ BA đến Khả Năng Tạo Chồi

Nồng độ BA (Benzyladenine) có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo chồi của Thạch tùng răng cưa trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu cho thấy, nồng độ BA tối ưu là 0,5 mg/l, cho hệ số nhân chồi cao nhất. Nồng độ BA quá cao hoặc quá thấp đều có thể ức chế sự phát triển của chồi.

4.2. Tác Động của Kinetin Lên Quá Trình Phát Triển Chồi

Kinetin cũng là một loại hormone thực vật quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình phát triển chồi của Thạch tùng răng cưa. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ Kinetin tối ưu là 1 mg/l, cho hệ số nhân chồi cao hơn so với các nồng độ khác. Kinetin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và phát triển chồi.

V. Nghiên Cứu Tạo Rễ Thạch Tùng Răng Cưa Trong Ống Nghiệm

Sau khi tạo chồi, giai đoạn tiếp theo là tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của các loại hormone thực vật như NAA (Acid naphtylacetique), IBA (Indolylbutyrique acid) và IAA đến khả năng tạo rễ của chồi. Kết quả cho thấy, IBA cho hiệu quả tạo rễ tốt nhất. Việc lựa chọn đúng loại và nồng độ hormone thực vật là rất quan trọng để kích thích sự hình thành rễ in vitro.

5.1. Ảnh Hưởng của NAA Đến Khả Năng Ra Rễ In Vitro

NAA (Acid naphtylacetique) là một loại auxin được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy in vitro để kích thích sự ra rễ. Nghiên cứu cho thấy, nồng độ NAA tối ưu là 0.6 mg/l. Nồng độ NAA cao có thể ức chế sự phát triển của rễ.

5.2. Tác Động Của IBA Lên Sự Hình Thành Rễ

IBA (Indolylbutyrique acid) được chứng minh là có hiệu quả cao trong việc kích thích sự ra rễ của Thạch tùng răng cưa trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, nồng độ IBA tối ưu là 0.6 mg/l.

VI. Kết Luận Ứng Dụng Nhân Giống Thạch Tùng Răng Cưa Invitro

Nghiên cứu này đã xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu để nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp in vitro. Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng để sản xuất hàng loạt cây giống chất lượng cao, phục vụ cho mục đích bảo tồn và khai thác bền vững nguồn cây dược liệu quý hiếm này. Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu về acclimatization và ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao hiệu quả của quy trình nhân giống.

6.1. Tối Ưu Hóa Quy Trình Acclimatization Cây Giống

Acclimatization là giai đoạn quan trọng để chuyển cây giống từ điều kiện in vitro sang điều kiện môi trường tự nhiên. Cần có các nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình acclimatization, đảm bảo tỷ lệ sống sót cao của cây giống.

6.2. Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Nâng Cao Hiệu Quả

Các ứng dụng công nghệ sinh học, như sử dụng các chất kích thích sinh trưởng tự nhiên hoặc cải thiện môi trường nuôi cấy, có thể giúp nâng cao hiệu quả của quy trình nhân giống invitro Thạch tùng răng cưa.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) là loài thực vật thân thảo thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae), phân bố tự nhiên tại các vùng rừng núi cao có độ ẩm lớn từ 350 m đến 1700 m (như Lâm Đồng, Lào Cai, Cao Bằng, Quảng Trị, Tam Đảo). Loài cây này chứa hoạt chất chính là Huperzine A (HupA) – một alkaloid có khả năng ức chế chọn lọc enzyme acetylcholinesterase, mang lại hiệu quả cao trong hỗ trợ điều trị các chứng suy giảm nhận thức và bệnh Alzheimer (căn bệnh gây tử vong hàng thứ 4 ở người cao tuổi). Do nhu cầu sử dụng HupA trong y dược ngày càng tăng, nguồn dược liệu Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên đang bị khai thác triệt để, dẫn đến nguy cơ suy kiệt nguồn gen quý.

Trong tự nhiên, Thạch tùng răng cưa có tốc độ sinh trưởng rất chậm, khả năng tái sinh thấp; cây con phát triển từ bào tử phải mất từ 15 đến 20 năm mới đạt chiều cao 10 – 30 cm. Cho đến nay, chưa có công trình nào nảy mầm bào tử thành công trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các phương pháp nhân giống truyền thống như gieo bào tử hoặc giâm hom thân có hệ số nhân thấp, tỷ lệ chết cao, cây con kém đồng đều và tốn nhiều thời gian. Trước thực trạng đó, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro là hướng đi cần thiết nhằm tạo ra nguồn giống đồng nhất, số lượng lớn và chủ động phục vụ sản xuất dược liệu.

Khóa luận được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu và nhiệm vụ cụ thể sau:

1. Mục đích: Xác định môi trường nuôi cấy in vitro tối ưu để nhân nhanh và tạo rễ cho cây Thạch tùng răng cưa.
2. Nhiệm vụ nghiên cứu:
   • Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng (BA, Kinetin đơn lẻ và tổ hợp Kinetin với NAA, IBA) đến khả năng tạo chồi và nhân nhanh chồi in vitro.
   • Đánh giá ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng nhóm auxin (α-NAA, IBA, IAA) ở các nồng độ khác nhau đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro.

• Đối tượng nghiên cứu: Chồi cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) nuôi cấy in vitro.
• Phạm vi không gian: Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 02/2022 đến tháng 07/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và nguyên lý sinh học

Nghiên cứu dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) do Haberlandt đề xuất (1902) và được thực nghiệm chứng minh bởi Miller và Skoog (1953), khẳng định mỗi tế bào thực vật đều chứa toàn bộ hệ gen cần thiết để tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện dinh dưỡng và hormone thích hợp. Quá trình nhân giống in vitro ứng dụng sự phân hóa và phản phân hóa tế bào dưới sự tác động tương hỗ giữa các nhóm chất điều hòa sinh trưởng:

• Nhóm Cytokinin (BA, Kinetin): Kích thích phân chia tế bào, giải phóng chồi nách khỏi ưu thế ngọn, thúc đẩy hình thành và nhân nhanh cụm chồi.
• Nhóm Auxin (NAA, IBA, IAA): Thúc đẩy kéo dài tế bào, phân chia tầng phát sinh và kích thích phân hóa mô rễ bất định từ gốc chồi.

Thiết kế thí nghiệm và phương pháp bố trí

• Phương pháp bố trí: Thí nghiệm được thiết kế theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB). Mỗi nghiệm thức được tiến hành với 3 lần lặp lại; mỗi lần lặp lại gồm 3 bình nuôi cấy, mỗi bình cấy 5 chồi (tổng số 45 chồi/nghiệm thức).
• Môi trường cơ bản: Sử dụng môi trường khoáng 1/4 MS (Murashige & Skoog, 1962), bổ sung đường sucrose và agar; độ pH được chuẩn hóa ở mức 5,8 trước khi khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,1 atm trong 20 phút.
• Điều kiện buồng nuôi cấy:
  • Cường độ chiếu sáng: Khoảng 2000 lux (nguồn sáng đèn neon), chu kỳ chiếu sáng cố định trong ngày.
  • Nhiệt độ phòng nuôi: 25 – 26°C.
  • Độ ẩm không khí: 70 – 75%.

Chỉ tiêu theo dõi và phương pháp xử lý số liệu

Thời gian theo dõi và thu thập số liệu được thực hiện sau 60 ngày nuôi cấy:

• Giai đoạn nhân chồi: Tỷ lệ tạo cụm chồi (%), hệ số nhân chồi (tổng số chồi thu được / tổng số mẫu cấy ban đầu), chiều cao chồi (cm) và đặc điểm hình thái cảm quan (màu sắc thân lá, độ cứng cáp, hiện tượng thủy tinh hóa).
• Giai đoạn tạo rễ: Tỷ lệ chồi ra rễ (%), số lượng rễ trung bình (rễ/cây), chiều dài rễ trung bình (cm) và đặc điểm hình thái rễ.
• Xử lý số liệu: Thu thập và tính toán sơ bộ trên phần mềm Microsoft Excel 2016; phân tích phương sai (ANOVA) và so sánh sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép thử LSD ở mức ý nghĩa $P = 0,05$ cùng hệ số biến động CV(%) trên phần mềm chuyên dụng IRRISTAT 5.0.

---

Nội dung chính theo từng chương

Phần 1: Mở đầu

Trình bày tổng quan tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ giá trị dược liệu của loài Thạch tùng răng cưa chứa hoạt chất Huperzine A, thực trạng suy thoái nguồn gen ngoài tự nhiên do áp lực khai thác, những rào cản sinh học trong tái sinh tự nhiên và hạn chế của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống. Từ đó, xác định mục đích, đối tượng và hai nhiệm vụ khoa học trọng tâm của đề tài.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết hệ thống lý thuyết và y văn chuyên ngành gồm:

• Đặc điểm thực vật học và sinh thái học: Phân loại chi Huperzia (Việt Nam có 10 loài thuộc chi này); hình thái thân thảo cao 15 – 40 cm, phân nhánh lưỡng phân, lá mỏng có răng cưa, túi bào tử dày (eusporangium) hình thận ở nách lá; sinh thái ưa bóng mùn, độ ẩm cao >78%, lượng mưa >1500 mm, pH đất 4,57 – 5,31.
• Hoạt chất Huperzine A: Cấu trúc, cơ chế dược lý ức chế acetylcholinesterase, hàm lượng trong cây tự nhiên (0,0047 – 0,025% khối lượng khô), sự biến thiên hàm lượng HupA theo mùa (cao nhất vào giữa thu, thấp nhất vào đầu xuân) và theo cơ quan (lá non > thân > lá già > rễ).
• Cơ sở kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật: Nguyên lý vô trùng, các thành phần dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nguồn carbon, tác động sinh lý của auxin, cytokinin, gibberellin, ethylene; các hiện tượng bất lợi như nhiễm mẫu, hóa nâu mô cấy do phenol/tannin, và hiện tượng thủy tinh hóa.
• Tình hình nghiên cứu trong nước và quốc tế: Tổng thuật các công trình nhân giống in vitro Thạch tùng răng cưa trên thế giới (Yang et al., 2008; Zhou et al., 2009; Ma et al., 2015; Xu et al., 2018) và tại Việt Nam (Phan Xuân Bình Minh et al., 2018; Lê Thị Lan Anh, 2020).

Phần 3: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết bố trí 7 thí nghiệm thực nghiệm trên nền môi trường 1/4 MS:

• Thí nghiệm nhân chồi (Thí nghiệm 1 đến 4):
  • TN1: Đánh giá ảnh hưởng của BA ở các nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l.
  • TN2: Đánh giá ảnh hưởng của Kinetin ở các nồng độ 0; 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 mg/l.
  • TN3: Đánh giá ảnh hưởng phối hợp giữa Kinetin cố định (1,0 mg/l) với NAA ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 mg/l.
  • TN4: Đánh giá ảnh hưởng phối hợp giữa Kinetin cố định (1,0 mg/l) với IBA ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 mg/l.
• Thí nghiệm tạo rễ (Thí nghiệm 5 đến 7 trên chồi kích thước 2 – 3 cm):
  • TN5: Đánh giá ảnh hưởng của α-NAA ở các nồng độ 0; 0,1; 0,3; 0,6; 0,8 mg/l.
  • TN6: Đánh giá ảnh hưởng của IBA ở các nồng độ 0; 0,1; 0,3; 0,6; 0,8 mg/l.
  • TN7: Đánh giá ảnh hưởng của IAA ở các nồng độ 0; 0,1; 0,3; 0,6; 0,8 mg/l.

Phần 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày kết quả đo đếm, phân tích thống kê và nhận xét hình thái học sau 60 ngày nuôi cấy:

1. Khả năng nhân nhanh chồi Thạch tùng răng cưa

• Ảnh hưởng của BA (Bảng 4.1): Nồng độ BA 0,5 mg/l cho kết quả vượt trội với hệ số nhân đạt 4,64 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 1,59 cm, cụm chồi phát triển tốt, lá xanh đậm (đánh giá ++++). Đối chứng không bổ sung BA đạt hệ số nhân thấp nhất (2,33 chồi/mẫu, chiều cao 0,91 cm).
• Ảnh hưởng của Kinetin: Nồng độ Kinetin 1,0 mg/l cho hiệu quả tối ưu trong dãy nồng độ thử nghiệm với hệ số nhân đạt 5,11 chồi/mẫu.
• Ảnh hưởng phối hợp Kinetin và NAA: Tổ hợp 1,0 mg/l Kinetin + 0,3 mg/l NAA cho hệ số nhân đạt 5,01 chồi/mẫu.
• Ảnh hưởng phối hợp Kinetin và IBA: Tổ hợp 1,0 mg/l Kinetin + 0,4 mg/l IBA cho hệ số nhân cao nhất trong toàn bộ các thí nghiệm tạo chồi, đạt 5,16 chồi/mẫu.

Nghiệm thức tối ưu	Thành phần môi trường bổ sung	Hệ số nhân (chồi/mẫu)	Chiều cao chồi (cm)	Đặc điểm cảm quan cụm chồi
Đối chứng	1/4 MS (không chất ĐTST)	2,33	0,91	Tạo cụm chồi chậm, chồi ít, sinh trưởng yếu
Bổ sung BA	1/4 MS + 0,5 mg/l BA	4,64	1,59	Cụm chồi phát triển mạnh, xanh đậm, khỏe
Bổ sung Kinetin	1/4 MS + 1,0 mg/l Kinetin	5,11	—	Cụm chồi phát triển nhanh, chồi nhiều
Phối hợp Kinetin + NAA	1/4 MS + 1,0 mg/l Ki + 0,3 mg/l NAA	5,01	—	Chồi phát triển tốt, đồng đều
Phối hợp Kinetin + IBA	1/4 MS + 1,0 mg/l Ki + 0,4 mg/l IBA	5,16	—	Khả năng đâm chồi mạnh nhất, chồi mập

2. Khả năng tạo rễ in vitro của chồi Thạch tùng răng cưa

Chồi trên môi trường nhân nhanh hoàn toàn không có khả năng tự phát sinh rễ. Khi cấy chồi đơn (dài 2 – 3 cm) sang môi trường tạo rễ chứa các auxin riêng lẻ:

• Bổ sung α-NAA: Công thức bổ sung 0,6 mg/l α-NAA cho kết quả ra rễ tốt nhất trong nhóm NAA với số rễ trung bình đạt 1,75 rễ/cây và chiều dài rễ đạt 1,01 cm.
• Bổ sung IBA: Công thức bổ sung 0,6 mg/l IBA cho hiệu quả ra rễ tốt nhất trong toàn bộ thí nghiệm tạo rễ, đạt 1,78 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình đạt 1,15 cm.
• Bổ sung IAA: Công thức bổ sung 0,8 mg/l IAA cho kết quả cao nhất trong nhóm IAA, đạt 1,43 rễ/cây và chiều dài rễ đạt 0,91 cm.

Chất kích thích tạo rễ	Nồng độ tối ưu (mg/l)	Số rễ trung bình (rễ/cây)	Chiều dài rễ trung bình (cm)	Đánh giá khả năng cảm ứng tạo rễ
α-NAA	0,6	1,75	1,01	Ra rễ tốt, rễ phát triển ổn định
IBA	0,6	1,78	1,15	Tối ưu nhất; rễ dài, số lượng rễ nhiều nhất
IAA	0,8	1,43	0,91	Ra rễ trung bình, chỉ số thấp hơn IBA và NAA

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp các thông số môi trường tối ưu cho hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ, đồng thời đưa ra các đề xuất về việc tiếp tục hoàn thiện quy trình đưa cây ra vườn ươm.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

1. Giai đoạn nhân nhanh:
   • Xác định được môi trường tối ưu khi sử dụng cytokinin đơn lẻ là 1/4 MS + 0,5 mg/l BA (hệ số nhân 4,64 chồi/mẫu, chiều cao 1,59 cm) và 1/4 MS + 1,0 mg/l Kinetin (hệ số nhân 5,11 chồi/mẫu).
   • Xác định được môi trường nhân chồi hiệu quả nhất khi phối hợp cytokinin và auxin là 1/4 MS + 1,0 mg/l Kinetin + 0,4 mg/l IBA, mang lại hệ số nhân cao nhất đạt 5,16 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy.
2. Giai đoạn tạo rễ:
   • Xác định được môi trường tạo rễ tối ưu là 1/4 MS bổ sung 0,6 mg/l IBA, giúp chồi đạt số lượng 1,78 rễ/cây và chiều dài rễ trung bình 1,15 cm sau 60 ngày nuôi cấy.

Giải pháp kỹ thuật và đóng góp khoa học

• Giải pháp kỹ thuật: Thiết lập được thành phần môi trường khoáng và nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho từng pha phát triển (nhân chồi và cảm ứng tạo rễ) của chồi Thạch tùng răng cưa trên nền khoáng giảm tải dinh dưỡng (1/4 MS).
• Đóng góp so với các nghiên cứu trước: Khóa luận cung cấp hệ thống số liệu thực nghiệm so sánh chi tiết, có xử lý thống kê chuẩn mực (ANOVA, LSD 0,05) giữa các loại hormone đơn lẻ (BA, Kinetin, NAA, IBA, IAA) và các tổ hợp hormone (Kinetin + NAA, Kinetin + IBA), làm sáng tỏ phản ứng phát sinh hình thái của đối tượng Thạch tùng răng cưa trong điều kiện nuôi cấy mô vô trùng tại Việt Nam.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Nghiên cứu mới dừng lại ở phạm vi hoàn thiện hai công đoạn in vitro (nhân nhanh cụm chồi và kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trong bình nuôi cấy sau 60 ngày); chưa tiến hành theo dõi giai đoạn luyện cây, chuyển cây con ra giá thể vườn ươm tự nhiên (ex vitro) và chưa phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất Huperzine A trong sinh khối tái sinh.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Khảo sát các loại giá thể (giá thể dớn, rong rêu, đất mùn rừng ẩm) và điều kiện vi khí hậu để thuần hóa cây con in vitro ra môi trường vườn ươm đạt tỷ lệ sống cao.
  • Nghiên cứu định lượng hàm lượng Huperzine A trong mô chồi và rễ tái sinh in vitro bằng các phương pháp sắc ký chuyên sâu nhằm đánh giá tiềm năng chiết xuất dược liệu.

---

Giá trị tham khảo

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học thực vật, Nông học, Di truyền và Chọn giống cây trồng, Dược liệu học và Bảo tồn tài nguyên sinh vật.
• Nội dung có giá trị ứng dụng:
  • Quy trình thiết lập nồng độ các chất kích thích sinh trưởng (BA, Kinetin, IBA, NAA) trên nền khoáng 1/4 MS cho cây thuộc nhóm Thông đất (Lycopodiaceae).
  • Phương pháp bố trí thí nghiệm khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB) và các tiêu chí đánh giá sinh trưởng hình thái chồi/rễ in vitro.
  • Dẫn liệu tài liệu tổng quan chi tiết về đặc điểm phân loại học, sinh thái, sinh sản và hoạt chất Huperzine A của loài Thạch tùng răng cưa.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Nồng độ BA nào cho hiệu quả nhân nhanh chồi Thạch tùng răng cưa cao nhất trong thí nghiệm?

Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ BA từ 0 đến 1,5 mg/l trên nền môi trường 1/4 MS, công thức bổ sung 0,5 mg/l BA cho hiệu quả cao nhất với hệ số nhân đạt 4,64 chồi/mẫu và chiều cao chồi trung bình đạt 1,59 cm sau 60 ngày nuôi cấy, chồi xanh đậm và phát triển tốt.

2. Tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng nào mang lại hệ số nhân chồi cao nhất trong toàn bộ khóa luận?

Tổ hợp giữa cytokinin và auxin trên nền môi trường 1/4 MS bổ sung 1,0 mg/l Kinetin + 0,4 mg/l IBA mang lại hệ số nhân chồi cao nhất, đạt 5,16 chồi/mẫu sau 60 ngày nuôi cấy.

3. Chất điều hòa sinh trưởng nào tối ưu nhất cho quá trình tạo rễ của chồi in vitro?

IBA ở nồng độ 0,6 mg/l (trên nền môi trường 1/4 MS) cho kết quả tạo rễ tốt nhất trong số các chất auxin được thử nghiệm (NAA, IBA, IAA), đạt trung bình 1,78 rễ/cây với chiều dài rễ trung bình đạt 1,15 cm sau 60 ngày nuôi cấy.

4. Điều kiện buồng nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu được kiểm soát ở các thông số nào?

Mẫu nuôi cấy được duy trì dưới ánh sáng đèn neon cường độ khoảng 2000 lux, nhiệt độ phòng nuôi từ 25 – 26°C, độ ẩm không khí đạt 70 – 75%, môi trường nuôi cấy được chỉnh pH = 5,8 và hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1,1 atm trong thời gian 20 phút.

5. Vì sao việc nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng bào tử trong tự nhiên và phòng thí nghiệm lại rất khó khăn?

Bào tử Thạch tùng răng cưa có túi bào tử dày (eusporangium), quá trình phát triển của túi bào tử kéo dài hơn 1 năm. Sau khi bào tử nảy mầm, cây con mất từ 15 đến 20 năm để đạt chiều cao 10 – 30 cm trong điều kiện tự nhiên giàu mùn và ẩm độ cao; đồng thời cho đến nay chưa có công trình nào nảy mầm bào tử thành công trong môi trường vô trùng phòng thí nghiệm.

---

Kết luận

Khóa luận của tác giả Phạm Đức Khoa đã xác định thành công các thông số môi trường dinh dưỡng in vitro tối ưu cho hai giai đoạn nhân nhanh và tạo rễ loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata). Kết quả thực nghiệm khẳng định môi trường 1/4 MS bổ sung 1,0 mg/l Kinetin kết hợp 0,4 mg/l IBA cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 5,16 chồi/mẫu, và môi trường 1/4 MS bổ sung 0,6 mg/l IBA cho khả năng cảm ứng ra rễ tốt nhất đạt 1,78 rễ/cây với chiều dài 1,15 cm sau 60 ngày nuôi cấy. Đây là cơ sở khoa học và thực tiễn có giá trị phục vụ công tác nhân giống vô tính, bảo tồn nguồn gen và phát triển nguồn dược liệu sản xuất hoạt chất Huperzine A.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thạch tùng răng cƣa, tên khoa học là Huperzia serrata(Thunb.) Trev, là một loài thân thảo, thuộc họ Thông đất(Lycopidiaceae), sinh trƣởng và phát triển tốt ở những nơi ẩm ƣớt trong rừng ở độ cao 350 m – 1700 m, lƣợng mƣa trên 1500 mm, độ ẩm tƣơng đối cao 78%. Ở nƣớc ta chúng phân bố rải rác tại các vùng cao nhƣ Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cƣa là Huperzine A có tác dụng rất lớn trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer, là chứng bệnh gây tử vong ở ngƣời cao tuổi đứng hàng thứ 4 hiện nay. Hiện nay, trên thế giới số lƣợng ngƣời có vấn đề về suy giảm trí nhớ nói chung và ngƣời mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu cầu về những loại thuốc thảo dƣợc có chứa hoạt chất HupA vì thế cũng không ngừng gia tăng đây có thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức loài cây dƣợc liệu này trong tự nhiên.

Cùng với đó Thạch tùng răng cƣa có đặc tính sinh trƣởng chậm, khả năng sinh sản kém, nguồn cây trồng tự nhiên lại đang bị khai thác triệt để đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nƣớc ta, dẫn đến loài Thạch tùng răng cƣa chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu về nguồn nguyên liệu để phục vụ cho sản xuất dƣợc phẩm. Chính vì thế việc tìm ra phƣơng pháp nhân giống loài cây này hết sức cần thiết. Hiện nay việc nhân giống loài thạch tùng răng cƣa đang đƣợc nghiên cứu và chủ yếu nhân giống bằng bào tử và giâm hom thân. Tuy nhiên các phƣơng pháp trên chƣa thực sự đem lại hiệu quả về mặt nhân giống, tỉ lệ cây chết và hiệu số nhân giống thấp, độ đồng đều và sức sống kém, và mất rất nhiều thời gian.

Trong khi hiện nay phƣơng pháp nhân giống in vitro đang đƣợc áp phổ biến trên các loại cây trồng, phƣơng pháp này có nhiều ƣu điểm nhƣ hệ số nhân giống cao, thời gian nhân giống ngắn, sức chống chịu tốt, độ 1 đồng đều cao.Từ những thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân nhanh và tạo rễ cây Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp nuôi cấy in vitro”. Mục đích và yêu cầu 1. Mục đích Xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy in vitro tối ƣu để nhân nhanh và tạo rễ cây Thạch tùng răng cƣa. Yêu cầu - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cƣa.

- Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều tiết sinh trƣởng tới khả năng tạo rễ của cây Thạch tùng răng cƣa. 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cƣa (Huperzia serrata) 2. Phân loại Thạch tùng răng cƣa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.

Ex Murray) Trevis, (trƣớc đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 loài trên toàn thế giới (M. Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10 loài gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis.

Đây là những loài đƣợc đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh nhƣ Alzheimer, Parkinson, đau, sƣng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhƣợc cơ ở các nƣớc Đông Á (Võ Văn Chi, 2012). Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 loài có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 loài đƣợc phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông (Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cƣa (H.) Trevis); Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngƣợc (Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L. Serm); Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm); Thông đất song (Huperzia carinata (Desv.) Trevis ; Thạch tùng Ford (Huperzia fordii (Backer) R.

Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì). Bốn trong số 12 loài trên đã đƣợc đƣa vào danh mục cây 3 thuốc Việt Nam (2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch tùng răng cƣa. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cƣa (Hình 1) thuộc loài thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm - 40 cm, thân đơn hay lƣỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đƣờng kính khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tƣơng đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cƣa, rễ dạng chùm.

Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cƣa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là: thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thƣớc 2 – 3 cm x 0,40 cm, tƣơng đối mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng không đều. Bào tử nang ở nách lá không khác lá thƣờng, hình thận, màu vàng tƣơi. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu đến khi trƣởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trƣởng thành bao gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dƣỡng chất gọi là tapetum.

Do đó, túi bào tử của loài Thạch tùng răng cƣa thuộc loại túi bào tử dày (eusporangium). Bào tử đƣợc phát tán ra khi túi bào tử trƣởng thành. Mầm tập trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cƣa ít khi đƣợc nhân giống bằng mầm (H.

Cây Thạch tùng răng cƣa H. 4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cƣa ở khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hƣớng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trƣởng thành là những cây có khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tƣơi, hình thận với kích thƣớc 0,8 mm mọc ở nách lá. Ngƣợc lại, cây tái sinh thƣờng chƣa sản sinh bào tử nang, chiều cao và đƣờng kính nhỏ hơn cây trƣởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đƣờng kính 0,75mm. Đối với cây trƣởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình 11,89 cm - 14,25 cm, đƣờng kính thân trung bình 1,80 mm.

Lá có hình dạng lƣỡi mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ, mép lá có răng cƣa không đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây (Trần Mạnh Đạt & Nguyễn Tân Hiếu, 2016). Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa Theo nghiên cứu của Wang & cộng sự (2011), thạch tùng răng cƣa phân bố trên toàn thế giới nhƣng tập trung nhiều nhất ở khu vực ôn đới phía đông, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á, cũng nhƣ Châu Đại Dƣơng và Trung Mỹ. Chúng sống bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe núi với đất mùn ẩm ƣớt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lƣợng mƣa trên 1500 mm, độ ẩm tƣơng đối cao 78%, hàm lƣợng nƣớc trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lƣợng chất hữu cơ 6,18% - 9,75%. Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cƣa chủ yếu đƣợc tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia, Nga, Đài Loan, Úc và Cuba.

Ấn Độ phát hiện đƣợc 21 loài thuộc chi Huperzia. Trong đó, 6 loài bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis. cryptomerina sensu Dixit), H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H.

vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. Ex Schrenk & Mart subsp arctica (Grossh ex. (Phlegmariurus Plegmaria (Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cƣa chủ yếu đƣợc tìm thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông Bắc của Ấn Độ nhƣ West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri của Tamilnadu.

Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cƣa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng thƣờng xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sông Dƣơng Tử; nơi đây, lƣợng mƣa hàng năm trên 1000 mm và chúng thƣờng sinh trƣởng trong các môi trƣờng đƣợc che bóng, ẩm ƣớt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến 2700 m. Ở nƣớc ta, cây Thạch tùng răng cƣa thƣờng bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá. Cây thƣờng phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nƣớc biển (Nguyễn Quang Hiệu và cộng sự, 2017). Cây phát triển tốt trong môi trƣờng bóng mờ, ẩm ƣớt và rất ẩm ƣớt, đất có nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế môi trƣờng sống của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam.

Chúng phân bố rải rác tại các vùng cao nhƣ Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo. Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo tồn thiên nhiên đã đƣợc xác định ở Việt Nam bao gồm Vƣờn Quốc gia Hoàng Liên (tỉnh Lào Cai), Vƣờn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc gia Ngọc Linh (giữa Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum) và Vƣờn Quốc gia Bidoup (tỉnh Lâm Đồng). Trong năm 2013 và 2016, nghiên cứu định danh tại hiện trƣờng đã xác định đƣợc 100 - 300 cá thể còn lại ở mỗi khu vực nghiên cứu. Kết quả ghi nhận này cho thấy, kích thƣớc của quần thể và sự tái sinh khan hiếm của loài cây Thạch tùng răng cƣa trở thành một mối đe dọa lớn đối với sự tồn tại của loài, thông qua sự suy giảm đa dạng di truyền.

Bên cạnh đó, tại khu bảo tồn 6 thiên nhiên Bắc Hƣớng Hóa (Quảng Trị), Trần Mạnh Đạt và cộng sự (2019) đã nghiên cứu và xác định loài Thạch tùng răng cƣa tại đây phân bố ở đai cao từ 1.500 m so với mặt nƣớc biển, chủ yếu ở vị trí sƣờn dốc và địa hình ven khe suối, tập trung nhất ở vị trí ven khe suối (78,09%) ở vùng Pa Thiên với độ dốc dƣới 30o và những vị trí sƣờn dốc cũng thấy sự xuất hiện phân bố của loài nhƣng ít hơn chỉ đạt 21,91% với độ dốc địa hình lớn hơn 30o, chƣa bắt gặp cá thể nào phân bố ở đỉnh núi.