Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây Nần Nghệ Cây Nần Nghệ có tên khoa học là Dioscorea collettii Hook F., theo hệ thống thực vật cây Nần Nghệ được phân loại như sau: Giới (regnum) Plantae Ngành (phylum) Angiospermae Lớp (class) Monocots Bộ (ordo) Dioscoreales Họ (familia) Dioscoreaceae Chi (genus) Dioscorea Loài (species) Dioscorea collettii Nần Nghệ loài thân leo quý hiếm có tên trong sách đỏ của Việt Nam. Toàn thân khi khô có màu đen. Cây có thân, rễ, thành củ nằm trong đất; thân vặn leo quấn qua bên phải, không lông. Lá mọc so le, có phiến hình tim tam giác, dài tới 10 cm, rộng 7 cm; gân từ gốc 7, mỏng, mặt trên không lông, mặt dưới có lông ở gân, cuống dài bằng phiến.
Cụm hoa cái gồm 1 – 5 bông ở nách lá. Quả nang cao 2 cm, với 3 cánh cao 1 cm. Hoa đực không cuống. Bao hoa 6 bộ phận bằng nhau hàn liền ở gốc, 6 thùy hình tam giác, đỉnh tròn, 3 nhị sinh sản, chỉ nhị chi đôi hình cái nạng, mỗi nhánh mang một số phấn, 3 nhị lép, hình dùi.
Cụm hoa cái chùm, dài 15 – 30 cm. Bao hoa 6 thùy, không có nhị lép, núm nhụy 3 thùy, quả nang quặt lại, có 3 cánh, 3 ô, mỗi ô có 2 hạt; hạt có cánh tròn (Sách đỏ Việt Nam, 2007).1 Hình dạng thân, lá, hoa, củ cây Nần vàng Dioscorea collettii Hook.2 Phân bố Loài phân bố ở Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Mianma và Bắc Việt Nam, chỉ gặp trong rừng núi cao một số nơi thuộc Bắc bộ của Việt Nam, ở độ cao 1000 – 3200 m so với mực nước biển.3 Dược tính Rễ chứa nhiều hợp chất có dược tính mạnh, trong đó có chứa 2 – 4% hợp chất diosgenin, đặc biệt hiệu quả trong điều trị các chứng bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa lipid, là thành phần chính điều chế các loại thuốc đặc trị hạ mỡ dư thừa trong máu, mỡ trong gan, mỡ nội tạng, giúp bình ổn huyết áp, điều hòa nhịp tim và chống viêm khớp. Trong y học cổ truyền bộ phân sử dụng chính của cây là thân và rễ có tên trong y học là Tỳ giải, được dùng trị đau khớp xương do phong thấp đau lưng gối, cảm nhiễm đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn… Đã có một số chế phẩm từ cây Nần Nghệ đã được thử nghiệm lâm sàng tại bệnh viện Y học Cổ Truyền Trung Ương.TS Trần Quốc Bình kết luận đây là dược liệu giúp hạ mỡ máu rõ rệt. Sau 30 ngày sử dụng đã có 71,6% người bệnh đã đạt hiệu 8 quả hạ mỡ máu, sau 60 ngày có 83,4% người bệnh giảm cholesterol, 88,3% giảm triglycerides, 66,7% giảm LDL – c, 33,3% tăng HDL – c.
hầu hết các bệnh nhân có huyết áp đều hạ về ổn định. Theo Jing và cộng sự (2017) trong nghiên cứu điều tra phân tích thành phần hóa học của Dioscorea collettii đã chiết tách được 29 hợp chất, bao gồm 6 saponin steroid, 13 monocyclic phenol, 2 flavonoids, 3 sterol, và 5 cyclodipeptides. Loài Dioscorea collettii trong một số phiên bản Dược điển của Cộng hòa Nhân dân Trung Hoa, đã được sử dụng như một vị thuốc y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị ung thư cổ tử cung, ung thư bàng quang và các khối u thận trong nhiều thế kỷ. Một số saponin steroid được phân lập từ cây này đã được thử nghiệm chống ung thư của Viện Ung thư Quốc gia (NCI).4 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Nần Nghệ 1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Hiện tại trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào về nhân giống in vitro cây Nần Nghệ được công bố (Theo phiếu khảo sát thông tin CESTI số: 136/2016 của Trung tâm thông tin Khoa học và Công nghệ TPHCM ngày: 12/12/2016) Trong nước cũng đã nghiên cứu về cây cùng họ với Nần Nghệ như cây khoai từ, nghiên cứu kỹ thuật tái sinh khoai từ (Dioscorea esculenta L.
Burkill) bằng phương pháp in vitro tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, kỹ thuật đó được thực hiện với môi trường MS – 1962 cải tiến, độ pH 5,8, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 18 phút, nhiệt độ phòng nuôi cấy 25oC, độ ẩm 65%, cường độ chiếu sáng 2000 lux, 16h sáng/8h tối. Vật liệu nghiên cứu là đoạn thân non được khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường MS số chồi tái sinh đạt 93,33%. Bổ sung GA3 với hàm lượng từ 0 – 1,5 mg/L vào môi trường MS cho thấy ở nồng độ 0,8 mg/L GA3 tỷ lệ tái sinh chồi khoai từ đạt 100%.
Ở giai đoạn nhân nhanh kết hợp BAP với Kinetine kết quả nghiên cứu cho thấy BAP 1,5 mg/L kết hợp với Kinetin 2 mg/L hệ số nhân nhanh chồi đạt 2,40 lần sau 4 tuần nuôi cấy. Thực nghiệm cho thấy rằng bổ sung 9 kết hợp NAA 2 mg/L với IBA 0,5 mg/L cho tỷ lệ chồi ra rễ đạt 95,6% số ra rễ đạt 4,00 rễ/chồi.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài Trên thế giới, tập trung ở Trung Quốc các tác giả đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro cây Nần Nghệ tuy nhiên quy trình nghiên cứu chỉ ở một giai đoạn là đánh giá ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự tăng sinh chồi của cây Nần Nghệ. Theo Zhang và cộng sự (1998) đã công bố môi trường tăng sinh chồi tốt nhất là MS + 1 mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA và MS + 2 mg/L Kinetin + 0,5 mg/L NAA. Tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu in vitro khác về các cây cùng họ như khoai mỡ thì Ezeibekwe và cộng sự (2009) đã đưa ra kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng nhân nhanh in vitro ở cây Discorea rotundata L.
(White Yam) bằng cách người ta tiến hành bổ sung vào môi trường MS lần lượt các nồng độ NAA (0; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 mg/L), BAP (0; 0,2; 0,4 mg/L) để cấy truyền cây con Discorea rotundata L., kết quả thu được với nồng độ 0,2 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA hầu hết các thông số đo cao nhất. Các nghiên cứu vi nhân đầu tiên của chi Dioscorea mục đích sử dụng làm dược phẩm đã được thực hiện bởi Chaturvedi (1975) sử dụng các nốt rễ loài D. floribunda nuôi cấy trong ống nghiệm trên môi trường MS có bổ sung 15 mg/L adenin sulphate và 0,1 mg/L NAA sau 4 tuần tuần cây con được 4 – 5 cm. Một số chất điều hòa sinh trưởng khác cũng được sử dụng trong vi nhân chi Dioscorea trong phòng thí nghiệm IAA, IBA, 2,4-D, BAP.
Phương pháp nhân giống vô tính đối với chi Dioscorea trong phòng thí nghiệm thường được sử dụng: mô phân sinh, mầm trên thân, mô sẹo, phôi soma. Năm 1971, Uduebo đã sử dụng củ, chồi nách lá loài D. bulbijera nhân giống thành công cây con trong ống nghiệm, sử dụng môi trường MS đều hình thành cây con có bổ sung 5 – 10 mg/L IAA. Theo nghiên cứu của Poornima và cộng sự (2007) trên loài D.
multiflora các đoạn thân được nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung với BAP (0,01; 0,1; 0,5; 10 1,0 và 3,0 mg/L) và môi trường MS bổ sung với 0,1 mg/L hoặc 0,5 mg/L BAP cộng nồng độ sucrose khác nhau (2; 4; 6; 8 và 10%). Đối với rễ, cành được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung IBA (0,1; 0,5; 1,0 và 3,0 mg/L) và môi trường MS bổ sung NAA (0,1; 0,5; 1,0 và 3,0 mg/L). Kết quả thu được tốt nhất trong môi trường MS + 0,1 mg/L BAP (80%) và trong môi trường MS + 1,0 mg/L IBA (42,6%). Không có sự khác biệt về tỉ lệ sống sót của cây con trong ống nghiệm và trong quá trình làm quen trước khi nuôi cấy ex vitro (75%).
EzeibeEkwe và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA và BAP đến khả năng nhân nhanh in vitro ở cây Discorea rotundata. Kết quả thu được với nồng độ 0,2 mg/L BAP và 0,5 mg/L NAA, các thông số đo là cao nhất. Ahanhanzo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về tác dụng phối hợp hai chất điều hòa sinh trưởng trong việc phát sinh hình thái của 3 kiểu gen của khoai lang trong ống nghiệm (Kounondakou, Gnon-boya và RB 89579). BAP và zeatin được thử nghiệm với nồng độ 0,5 mg/L với môi trường cơ bản galzy glutamine chứa 0,5 mg/L NAA.
Số lượng chồi và cành mọc có thân và rễ được lấy mẫu sau 2 tuần nuôi cấy. Hàm lượng chất khô, số lượng rễ và lá và chiều cao của mỗi mầm non được xác định sau 5 tuần nuôi cấy. Các kết quả thu được chỉ ra rằng không có sự phá vỡ sự phát triển lá đã được quan sát trên môi trường đối chứng (không có cytokinin) nhưng môi trường với BAP và zeatin đã cho thấy sự phát triển tốt của cây trồng. Một sự tương tác đáng kể (p < 0,05) được quan sát thấy giữa các kiểu gen và loại cytokinin.
Tuy nhiên, nảy mầm cao nhất và phát triển chồi đã thu được với BAP. Vì vậy, BAP có thể được coi là cytokinin có khả năng hình thái tốt khi so sánh với zeatin đối với nhân vi nhân giống. Theo Mantell và cộng sự (1978) nghiên cứu về chế độ ánh sáng đến quá trình nhân giống hai loài D. rotundata sử dụng đoạn thân mang chồi cho thấy thời gian chiếu sáng 16 giờ xuất hiện cây con nhanh hơn 3 – 5 ngày, có hiệu cao gấp bốn lần với thời gian chiếu sáng 12 giờ.
Năm 1981, Mathias thí nghiệm nuôi cấy đoạn thân loài D. rotundata sau hai tuần hình thành cây con trong môi trường MS có NAA và BA nồng độ 0,1 mg/L ở nhiệt độ 25oC. 11 Theo Grewal và Atal (1976) thu được mô sẹo từ thân mầm của loài D. deltoidea được nuôi cấy trên môi trường RT có chứa 1 mg/L 2,4-D.
Sinha và Chaturvedi (1979) nhân giống in vitro hai loài D. composita, sử dụng phương pháp cắt lá trên môi trường MS cơ bản với 0,5 mg/L BA, 50 mg/L adenin sulphate và 0,1 mg/L NAA. Jova và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về quá trình nhân giống loài D. alata trên các hệ thống nuôi cấy khác nhau cho kết quả kiểu hệ thống nuôi cấy trong môi trường lỏng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây.
Trong các hệ thống nuôi cấy, nuôi cấy trên môi trường bán rắn, hệ thống ngậm chìm tạm thời (Temporary Immersion System - TIS) và hệ thống ngậm chìm liên tục (Constant Immersion System - CIS), có sự thông khí bằng cách tạo bong bóng liên tục trong môi trường lỏng, kết quả tốt hơn đã được quan sát trên các chỉ số hình thái học và sinh lý của cây so với cây từ hệ thống nuôi cấy trên môi trường bán rắn hoặc hệ thống lỏng tĩnh (Static Liquid System - SLS).