ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị lực trong dân số trong độ tuổi lao động [1-2]. Các giai đoạn đầu của bệnh võng mạc đái tháo đường được đặc trưng bởi sự hiện diện của mao mạch không có tế bào và sự chết tế bào ngoại mạch, tiếp đó là sự chết tế bào mạch máu võng mạc theo chương trình [3-4]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng đáy mao mạch dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường [5-6] và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu [7-8]. Ngoài ra, màng đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc [4], một dấu hiệu lâm sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường.
Cơ chế bệnh sinh của bệnh lý vi mạch do đái tháo đường bị ảnh hưởng bởi những thay đổi về chất lượng và số lượng của màng đáy mao mạch. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá rõ [9], nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng của bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn chưa rõ ràng. Ức chế enzyme này có thể gây ra bệnh loãng xương [11], nhưng đồng thời, các loại tế bào khối u gây tăng lượng enzyme này có thể thúc đẩy sự di căn của khối u hiện có, khiến nó trở nên ác tính [12-13]. LOX được tổng hợp và tiết ra dưới dạng tiền enzyme glycosyl hóa (proLOX, 50 kDa), tiếp tục trải qua quá trình phân giải protein ngoại bào thành dạng trưởng thành (LOX 32 kDa) [14].
LOX trưởng thành một phần quay trở lại tế bào, một phần bám vào chất nền ngoại bào thực hiện chức năng sinh học. Enzym LOX xúc tác quá trình khử luan an 2 oxy hóa lượng peptidyllysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất collagen và lượng lysine dư thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các phản ứng tự ngưng tụ dẫn đến hình thành chất nền ngoại bào [14-15]. Vì vậy, LOX đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn vẹn của màng đáy.
LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ, tim, phổi, gan, sụn, xương, thận, vú, võng mạc và não [16-18]. Có khá nhiều nghiên cứu về LOX tại tim, xương, vú, phổi,. đem lại những hiểu biết sâu hơn về cơ chế sinh bệnh và mở ra các hướng nghiên cứu biện pháp can thiệp hiệu quả. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa tổn thương võng mạc do đái tháo đường [19].
Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường [12]. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Tuy nhiên, cơ chế gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào còn chưa rõ ràng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao" với 2 mục tiêu: 1.
Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. luan an 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có lớp nội mô, màng đáy và tế bào quanh mạch.
Lớp nội mô Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao mạch. Phần bào tương chứa nhân lồi vào lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tế bào toả thành lá mỏng. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên kết khe. Dưới sinh hiển vi điện tử có thể thấy ở lá bào tương tế bào nội mô có những cửa sổ (lỗ nội mô), màng bào tương ở cả hai mặt tế bào có những vết lõm siêu vi, trong bào tương có những không bào vi ẩm.
Những bào quan như lưới nội bào, ti thể, ribosom nằm rải rác nhưng tập trung nhiều quanh nhân, bộ Golgi nhỏ, thường nằm sát nhân [6-21-23]. Cấu trúc mao mạch võng mạc [24] A. Thiết đồ cắt ngang luan an 4 1. Cấu trúc Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào nội mô và tế bào ngoại mạch của mạch máu [25].
Màng đáy mạch máu chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để hình thành giá đỡ cho tế bào [25]. Màng đáy là nơi thực hiện nhiều chức năng quan trọng của tế bào do đó nó rất quan trọng với sự sống còn của tế bào và cân bằng nội môi võng mạc. Màng đáy mạch máu cung cấp môi trường vi mô, tại đó tín hiệu hai chiều thông qua các integrin điều chỉnh sự gắn kết và chức năng của tế bào. Chức năng chính của màng đáy là tạo bộ khung gắn kết tế bào [26], tạo điều kiện cho kết nối tế bào-tế bào [27], và điều khiển việc chữa lành vết thương [28].
Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV (Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn của màng đáy. Ở võng mạc, chất nền ngoại bào được sản xuất chủ yếu bởi các tế bào nội mô mạch máu và tế bào ngoại mạch [6-21-22]. Các loại tế bào khác cũng sản xuất một lượng nhỏ chất nền ngoại bào là tế bào Muller [29], tế bào hình sao [30], tế bào hạch [31] và các tế bào biểu mô võng mạc [32]. Bằng phương pháp đo lường siêu cấu trúc sử dụng sinh hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về độ dày màng đáy mạch máu giữa các mô (bảng 1) và giữa các lớp động vật (bảng 2).
Màng đáy bao gồm 2 vùng riêng biệt là lá sáng (lamina lucida) và lá đặc (lamina densa), nơi tiếp giáp phía trước với màng tế bào, phía sau liên tục với mô liên kết của chất nền ngoại bào [33]. luan an 5 Bảng 1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể ngƣời [6] Loại mô Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Võng mạc 250-480 [34] Tiểu cầu thận 330±50 [35-36] Cơ xương 220 [37] Cơ tim 77±4 [38] Cơ tứ đầu đùi 108-246 [39] Bảng 1. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau [6] Loài Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Chuột nhắt 93±19 [40] Chuột cống 51-112 [41] Mèo 72±12 [42] Chó 90-140 [43] Người 250-450 [34] 1.
Thành phần Màng đáy bao gồm nhiều thành phần sắp xếp một cách có tổ chức. Một số thành phần chính tạo nên bộ khung của màng bao gồm Coll IV, FN, laminin và heparan sulfate proteoglycan. Ngoài ra màng cũng chứa các thành luan an 6 phần khác như nidogen, tenascin, perlecan, agrin collagen I, II, III và chondroitin sulfate proteoglycan [44-45]. Collagen IV là thành phần phong phú nhất trong chất nền ngoại bào, và chỉ được tìm thấy trong màng tế bào.
Coll IV có trọng lượng phân tử khoảng 500 kD với chiều dài trung bình 400 nm [46] và cấu trúc bộ ba xoắn ốc nguồn gốc từ 3 chuỗi α, bao gồm 2 chuỗi α1 giống hệt nhau và 1 chuỗi α2 [47]. Mỗi chuỗi chứa 3 vùng riêng biệt: đầu amino giàu cysteine và lysin, vùng amino axit với chuỗi Gly-X-Y lặp lại khoảng 1400 lần và đầu carboxyl chứa khoảng 230 amino axit [48]. Tổng thể cấu trúc của Coll IV sắp xếp dạng như mạng tinh thể được tổng hợp khi vùng gen khởi động tương tác với vị trí NC1 tại đầu tận carboxyl tạo nên các dimer [49]. Các dimer này sau đó được liên kết chéo với nhau tại vùng 7S nằm tại đầu tận amino [33].
Collagen có các vị trí kết dính tương tác trực tiếp với các intergrin α1β1 và α2β1 cho phép tế bào kết nối với màng tế bào và khởi động các tín hiệu tế bào [50]. Coll IV cũng tạo thành một giá đỡ để liên kết các thành phần chất nền ngoại bào khác [51]. Cấu trúc màng đáy mao mạch [24] luan an 7 Fibronectin, 1 glycoprotein lớn, là thành phần quan trọng của màng đáy được biết đến với khả năng hoạt động như một chất keo phân tử và duy trì cấu trúc phân tử ổn định của màng đáy. FN là một dimer bao gồm 2 tiểu đơn vị lớn, giống hệt nhau, mỗi đơn vị nặng khoảng 250 kD được liên kết cộng hoá trị thông qua liên kết disulfide ở đầu tận C [26-52-53].
Sau khi được tổng hợp, FN tập hợp thành 1 mạng lưới sợi phụ thuộc integrin [26], sử dụng vị trí RGD (Arg-Gly-Asp) bám vào vị trí α5β1 của integrin [52]. FN tạo điều kiện cho sự kết dính của tế bào, di chuyển, tăng trưởng tế bào và biệt hoá thông qua các tương tác đặc hiệu bao gồm các vị trí kết dính cho collagen, heparan và các proteoglycan khác. FN gắn kết các thành phần chất nền ngoại bào thành một cấu trúc có tổ chức, do đó đóng góp vào sự toàn vẹn và chức năng của chất nền ngoại bào [52-54]. Laminin là 1 glycoprotein không chứa collagen, được tìm thấy chủ yếu trong lớp lá sáng [55].
Laminin có trọng lượng phân tử khoảng 820 kD và chứa 3 chuỗi polypeptid: α, β, và γ. Cả 3 chuỗi đều chứa nhánh dài xoắn ốc (dài khoảng 75 nm), ngoài ra chuỗi α có thêm nhánh ngắn (dài khoảng 35 nm) [56]. Phần cơ bản của nhánh dài là miền G chứa các chuỗi tương tự yếu tố tăng trưởng biểu bì [56]. Chuỗi ba lần lặp đầu tiên, gọi là G1-3 chịu trách nhiệm kết dính với các integrin, trong khi chuỗi 2 lần lặp cuối cùng (ví dụ G4- 5) chịu trách nhiệm kết dính với các heparan [57].
Laminin tương tác với collagen IV bằng cách cùng bám dính vào nhiều thành phần khác của chất nền ngoại bào bao gồm FN và integrin [58].