Luận án tiến sĩ nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ glucose cao đến lysyl oxidase trong tế bào nội mô mạch máu võng mạc, góp phần hiểu rõ bệnh lý tiểu đường.

• Tác giả: Nguyễn Ngân Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Huy Thịnh
• Trường học: Trường Đại học Y Hà Nội
• Chuyên ngành: Nhãn khoa
• Đề tài: Nghiên cứu lysyl oxidase trong tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở nồng độ glucose cao
• Loại tài liệu: luận án
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc
• 1.2. Lớp nội mô
• 1.3. Tế bào quanh mạch
• 1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường
• 1.5. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thương mao mạch võng mạc do tình trạng đường huyết cao
• 1.6. Dày màng đáy mao mạch võng mạc
• 1.7. Rối loạn kết nối tế bào-tế bào
• 1.8. Thay đổi cấu trúc ti thể
• 1.9. Đặc điểm lysyl oxidase
• 1.10. Các tình trạng bệnh lý liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện LOX
• 1.11. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm
• 2.5. Phương tiện nghiên cứu
• 2.6. Cách thức tiến hành
• 2.7. Các chỉ số nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu
• 2.9. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ
• 3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu
• 3.2. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao
• 3.3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu hiện của LOX
• 3.4. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX
• 3.5. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào
• 3.6. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao
• 3.7. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào
• 3.8. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX
• 4.2. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX
• 4.3. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện của LOX
• 4.4. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào
• HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về lysyl oxidase

Lysyl oxidase (LOX) là một enzyme quan trọng trong quá trình hình thành và duy trì cấu trúc của màng đáy mao mạch. Enzyme này xúc tác quá trình oxy hóa lysine và hydroxylysine trong collagen và elastin, dẫn đến hình thành các liên kết chéo giữa các sợi collagen, từ đó tạo ra tính ổn định cho màng đáy. Nghiên cứu cho thấy rằng sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX có thể ảnh hưởng đến chức năng của tế bào nội mô mạch máu, đặc biệt trong môi trường nồng độ glucose cao. Điều này có thể dẫn đến sự phát triển của các bệnh lý như bệnh võng mạc đái tháo đường. Theo một nghiên cứu gần đây, hàm lượng LOX tăng lên trong võng mạc của chuột đái tháo đường, cho thấy mối liên hệ giữa LOX và sự phát triển của bệnh lý võng mạc. Sự điều hòa của LOX có thể là một mục tiêu tiềm năng trong việc phát triển các phương pháp điều trị cho bệnh võng mạc đái tháo đường.

1.1. Chức năng của lysyl oxidase

Chức năng chính của LOX là xúc tác quá trình oxy hóa các amino acid trong collagen và elastin, tạo ra các aldehyd và dẫn đến hình thành các liên kết chéo. Quá trình này không chỉ giúp duy trì tính toàn vẹn của màng đáy mà còn ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào nội mô. Nghiên cứu cho thấy rằng sự thay đổi trong hoạt động của LOX có thể dẫn đến các rối loạn chức năng của tế bào, đặc biệt là trong các điều kiện bệnh lý như đái tháo đường. Sự gia tăng nồng độ glucose có thể làm tăng mức độ biểu hiện của LOX, từ đó ảnh hưởng đến sự phát triển của các mạch máu và gây ra các tổn thương trong võng mạc.

II. Tác động của nồng độ glucose cao đến lysyl oxidase

Môi trường nồng độ glucose cao có thể gây ra những thay đổi đáng kể trong mức độ biểu hiện của LOX trong tế bào nội mô mạch máu võng mạc. Nghiên cứu cho thấy rằng khi nồng độ glucose tăng, mức độ biểu hiện của LOX cũng tăng theo, dẫn đến sự gia tăng hoạt động của enzyme này. Điều này có thể góp phần vào sự phát triển của bệnh võng mạc đái tháo đường, khi mà màng đáy mao mạch trở nên dày hơn và gây ra các rối loạn chức năng. Sự thay đổi này không chỉ ảnh hưởng đến cấu trúc mà còn đến chức năng của tế bào nội mô, làm tăng tính thấm của mạch máu và dẫn đến hiện tượng rò rỉ mạch máu. Việc hiểu rõ cơ chế này có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh võng mạc đái tháo đường.

2.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của lysyl oxidase

Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX trong môi trường nồng độ glucose cao có thể được giải thích qua các cơ chế sinh học phức tạp. Nghiên cứu cho thấy rằng LOX không chỉ được tổng hợp và tiết ra từ tế bào nội mô mà còn có thể bị điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs). Khi nồng độ glucose tăng, các yếu tố này có thể kích thích sự biểu hiện của LOX, dẫn đến sự gia tăng hoạt động của enzyme này. Điều này có thể tạo ra một vòng lặp phản hồi, trong đó sự gia tăng LOX lại làm tăng tính thấm của mạch máu, từ đó góp phần vào sự phát triển của bệnh lý võng mạc.

III. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu về lysyl oxidase trong tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở nồng độ glucose cao có nhiều ứng dụng thực tiễn trong y học. Việc hiểu rõ cơ chế hoạt động của LOX có thể giúp phát triển các phương pháp điều trị mới cho bệnh võng mạc đái tháo đường. Các liệu pháp nhắm vào việc điều chỉnh mức độ biểu hiện của LOX có thể giúp ngăn ngừa hoặc làm chậm tiến triển của bệnh. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển các biomarker để chẩn đoán sớm bệnh võng mạc đái tháo đường, từ đó cải thiện chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân.

3.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo

Hướng nghiên cứu tiếp theo có thể tập trung vào việc phát triển các chất ức chế LOX nhằm giảm thiểu các tác động tiêu cực của enzyme này trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Ngoài ra, việc nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ giữa LOX và các yếu tố sinh học khác trong môi trường nồng độ glucose cao cũng sẽ giúp làm sáng tỏ hơn về cơ chế bệnh sinh của bệnh lý này. Các nghiên cứu lâm sàng có thể được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các liệu pháp mới trong việc điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến suy giảm thị lực và mù lòa ở nhóm dân số trong độ tuổi lao động. Các giai đoạn sớm của tổn thương vi mạch võng mạc được đặc trưng bởi hiện tượng thoái hóa mao mạch tạo thành mao mạch không có tế bào (acellular capillaries), chết tế bào quanh mạch (pericyte loss) và chết tế bào nội mô theo chương trình (apoptosis). Về mặt mô bệnh học, dày màng đáy mao mạch võng mạc là dấu hiệu kinh điển, trực tiếp phá vỡ hàng rào máu - võng mạc, làm tăng tính thấm thành mạch và gây rò rỉ dịch mạch máu võng mạc. Mặc dù các biểu hiện hình thái và biến đổi chức năng mạch máu đã được quan sát rõ trên lâm sàng và thực nghiệm, các cơ chế phân tử nội bào và ngoại bào kiểm soát sự biến đổi màng đáy cũng như rối loạn chức năng tế bào nội mô vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ.

Enzyme Lysyl oxidase (LOX) là một amine oxidase phụ thuộc đồng đóng vai trò khởi tạo các liên kết chéo cộng hóa trị giữa các phân tử collagen và elastin, quyết định sự ổn định và toàn vẹn của màng đáy mao mạch. Sự biến đổi nồng độ và hoạt tính enzyme này trong môi trường tăng đường huyết tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc là khoảng trống nghiên cứu sinh học phân tử cần được xác định. Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Ngân Hà (chuyên ngành Nhãn khoa, mã số 9720157, bảo vệ năm 2020 tại Trường Đại học Y Hà Nội) được thực hiện nhằm giải quyết các mục tiêu sau:

1. Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện Lysyl oxidase (LOX) của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.
2. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của Lysyl oxidase (LOX) với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột (Rat Retinal Endothelial Cells - RRECs). Mẫu nghiên cứu được chia thành hai nhóm: nhóm nghiên cứu gồm các tế bào RRECs nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (30 mmol/l) và nhóm đối chứng gồm các tế bào RRECs nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose sinh lý bình thường (5 mmol/l). Về phạm vi không gian, các thử nghiệm phân tử, nuôi cấy tế bào và phân tích hóa sinh được tiến hành tại Phòng nghiên cứu biến chứng mạch máu nhỏ do đái tháo đường thuộc Trường Y Đại học Boston (Boston University School of Medicine, bang Massachusetts, Hoa Kỳ) phối hợp cùng Bộ môn Mắt - Trường Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện Mắt Trung ương. Về phạm vi thời gian, các thí nghiệm đánh giá động học biểu hiện tế bào được theo dõi và phân tích theo các mốc thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày nuôi cấy.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các hướng nghiên cứu kinh điển và cập nhật về cấu trúc mô học mao mạch võng mạc, cơ chế bệnh sinh của biến chứng vi mạch do đái tháo đường và đặc điểm sinh học của enzyme LOX:

• Mô học màng đáy mao mạch võng mạc: Màng đáy mao mạch võng mạc là cấu trúc ngoại bào dày khoảng 50 nm nằm giữa lớp tế bào nội mô và tế bào quanh mạch, cấu thành từ bốn thành phần chính: Collagen type IV (Coll IV), Fibronectin (FN), Laminin và Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). Dữ liệu siêu cấu trúc cho thấy độ dày màng đáy có sự khác biệt rõ rệt giữa các mô trên cơ thể và giữa các loài sinh vật.

Loại mô trên cơ thể người	Độ dày màng đáy (nm)	Tài liệu tham khảo trích dẫn
Võng mạc	250 - 480	Cogan và CS (1961) [34]
Tiểu cầu thận	330 ± 50	Steffes và CS (1983) [35, 36]
Cơ xương	220	Williamson và CS (1971) [37]
Cơ tim	77 ± 4	Fischer và CS (1982) [38]
Cơ tứ đầu đùi	108 - 246	Jordan và CS (1972) [39]

Loài động vật	Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc (nm)	Tài liệu tham khảo trích dẫn
Chuột nhắt (Mouse)	93 ± 19	Hammes và CS (2002) [40]
Chuột cống (Rat)	51 - 112	Roy và CS (1993) [41]
Mèo (Cat)	72 ± 12	Rootman (1971) [42]
Chó (Dog)	90 - 140	Engerman và CS (1982) [43]
Người (Human)	250 - 450	Cogan và CS (1961) [34]

• Cơ chế sinh bệnh mao mạch võng mạc do đường huyết cao: Tăng đường huyết kích thích tăng tổng hợp Coll IV, FN và laminin, dẫn đến hiện tượng dày màng đáy dạng "miếng pho mát Thụy Sỹ" (Swiss-cheese appearance) [72]. Nghiên cứu của Oshitari và cộng sự [22, 74] chứng minh việc dùng antisense oligonucleotide ức chế biểu hiện protein chất nền ngoại bào giúp làm giảm độ dày màng đáy, giảm hình thành mao mạch không có tế bào và ngăn chặn rò rỉ dịch mạch máu võng mạc. Tình trạng tăng đường huyết còn làm giảm biểu hiện Connexin 43 (Cx43) - protein cấu tạo liên kết khe (gap junction) giữa các tế bào nội mô và tế bào quanh mạch [Fernandes và CS, 93; Tien và CS, 99, 102], đồng thời làm rối loạn trao đổi chất giữa tế bào mạch máu và tế bào đệm Muller [Muto và CS, 106]. Ngoài ra, đường huyết cao gây biến đổi hình thái ti thể, tăng phân mảnh, giảm hợp nhất, giải phóng Cytochrome C gây chết tế bào theo chương trình [Trudeau và CS, 100].
• Đặc tính sinh học và bệnh học của Lysyl oxidase: LOX (protein-lysine 6-oxidase) được mã hóa bởi gen nằm trên nhiễm sắc thể 5q23.2, được tổng hợp dưới dạng tiền chất glycosyl hóa pro-LOX (50 kDa), sau đó được phân cắt ngoại bào bởi enzyme procollagen C-proteinases và BMP-1 tạo thành LOX hoạt tính (32 kDa) và đoạn peptide propeptide LOX-PP (18 kDa) [Kagan và Li, 14; Trackman và CS, 112]. LOX xúc tác phản ứng khử amin oxy hóa các gốc lysyl và hydroxylysyl trong chuỗi polypeptide của collagen và elastin tạo thành các aldehyde phản ứng, tự ngưng tụ hình thành liên kết chéo ngoại bào không hòa tan [14, 15]. Hoạt động của LOX bị ức chế không thuận nghịch bởi $\beta$-aminopropionitrile (BAPN) và được điều hòa tăng bởi TGF-$\beta$, HIF-1$\alpha$ [114, 117]. Rối loạn LOX liên quan đến nhiều bệnh lý: giảm LOX gây bệnh Menkes, hội chứng sừng chẩm, lathyrism, khí phế thũng [11, 133], giả bong bao và giác mạc chóp [119, 135]; tăng LOX thúc đẩy xâm lấn và di căn ung thư vú, ung thư phổi, ung thư đại trực tràng và gây xơ hóa tim, gan, thận [Erler và CS, 12; 138-143].
• Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết: Nghiên cứu của Song và cộng sự (2020) [19] ghi nhận hàm lượng LOX tăng trong võng mạc chuột đái tháo đường. Nghiên cứu dịch kính ở bệnh nhân võng mạc đái tháo đường tăng sinh (PDR) cũng cho thấy nồng độ LOX tăng cao [20]. Các công trình của Le Pape và CS [148], Ortoland [123], Paszek [152] đã chỉ ra sự biến đổi liên kết chéo collagen trong bệnh đái tháo đường. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện, sự phân bố ngoại bào/nội bào và động học bám dính của LOX với các protein cấu trúc màng đáy (Coll IV, Fibronectin) ở cấp độ tế bào nội mô mạch máu võng mạc dưới tác động trực tiếp của nồng độ glucose cao chưa từng được làm rõ. Luận án giải quyết trực tiếp khoảng trống này bằng các thử nghiệm định lượng và hóa sinh chuyên sâu.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án xây dựng trên khung lý thuyết sinh học màng đáy mạch máu và enzymology: nồng độ glucose cao kích hoạt sự gia tăng biểu hiện và bài tiết enzyme LOX trưởng thành (32 kDa); LOX ngoại bào tăng cường tương tác và liên kết chéo quá mức với Collagen IV và Fibronectin, làm tăng tính thấm tế bào nội mô và khởi động con đường tín hiệu chết tế bào theo chương trình (thông qua ức chế quá trình phosphoryl hóa AKT).

Thiết kế nghiên cứu là nghiên cứu thử nghiệm can thiệp in vitro có đối chứng. Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định theo phương pháp "Resource equation" áp dụng cho nghiên cứu thử nghiệm trong phòng thí nghiệm: $$n = \frac{E}{k + 1}$$ Trong đó:

• $n$ là số thử nghiệm cần thực hiện.
• $E$ là sai lệch giữa các đối tượng (khoảng chấp nhận từ 10 đến 20).
• $k$ là số đĩa tế bào trong mỗi thử nghiệm ($k = 2 - 4$). Từ công thức trên, giá trị tính toán đạt $n = 2 - 7$. Luận án thiết kế mỗi thử nghiệm định lượng được lặp lại độc lập 6 lần ($n = 6$) và mỗi thử nghiệm định tính được chọn ngẫu nhiên 6 vi trường quan sát. Tổng cộng có 104 thử nghiệm được thực hiện (bao gồm 102 thử nghiệm định lượng và 2 thử nghiệm định tính).

Phương tiện, hóa chất và quy trình kỹ thuật:

• Nuôi cấy và xử lý tế bào: Tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột (RRECs) được nuôi cấy trong đĩa 35 mm và 60 mm với môi trường DMEM bổ sung FBS, Amphotericin B, Anti/Anti, Gentamycin. Nhóm đối chứng (N) có nồng độ glucose 5 mmol/l; nhóm glucose cao (HG) được bổ sung dung dịch Glucose 2M để đạt nồng độ 30 mmol/l. Thời gian nuôi cấy kéo dài 1, 3, 5 và 7 ngày. Để ức chế biểu hiện gen và hoạt tính LOX, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật can thiệp RNA nhỏ (LOX small interfering RNA - LOXsiRNA) và chất ức chế hóa học $\beta$-aminopropionitrile (BAPN).
• Phân lập các phân đoạn protein: Phân lập protein tế bào bằng Trypsin-EDTA; phân lập protein chất nền ngoại bào (ECM) bám đáy đĩa bằng dung dịch Ammonium Hydroxide ($NH_4OH$). Để thu thập protein tiết trong môi trường nuôi cấy, tế bào được thay thế bằng môi trường không chứa phenol và không có huyết thanh (serum-free) trong 24 giờ trước khi thu dịch.
• Kỹ thuật Lắng đọng miễn dịch (Immunoprecipitation - IP) và Western Blot (WB): Định lượng nồng độ protein thu được bằng phương pháp BCA. Sử dụng kỹ thuật lắng đọng miễn dịch với kháng thể đặc hiệu để tách phức hợp protein LOX. Điện di protein trên gel polyacrylamide SDS-PAGE, chuyển màng PVDF, ủ kháng thể sơ cấp (kháng thể kháng LOX dòng thỏ, kháng Coll IV dòng thỏ, kháng FN dòng thỏ, kháng AKT) và kháng thể thứ cấp gắn enzyme phát hiện qua phim X-quang và hệ thống đọc hình ảnh Western Blot.
• Nhuộm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescence): Sử dụng kháng thể kháng LOX dòng chuột, kháng thể kháng Coll IV và kháng FN dòng thỏ, kết hợp kháng thể thứ cấp kháng chuột gắn FITC và kháng thỏ gắn Rhodamine Red, nhuộm nhân bằng DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Quan sát và ghi hình bằng kính hiển vi phát huỳnh quang, kính hiển vi đồng tiêu (confocal laser scanning microscopy) và sinh hiển vi điện tử. Định lượng mật độ và diện tích huỳnh quang bằng phần mềm xử lý ảnh Image J.
• Đo độ thẩm thấu qua hàng rào tế bào nội mô: Đánh giá tính thấm của lớp đơn tế bào nội mô bằng phương pháp đo huỳnh quang FITC-dextran khuếch tán qua màng bán thấm trên máy quang phổ tử ngoại SpectraMax Gemini (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ).
• Đánh giá chết tế bào theo chương trình (Apoptosis): Nhuộm kép huỳnh quang bằng acridine orange và ethidium bromide, đếm số lượng tế bào chết theo chương trình trên tổng số 1000 tế bào quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày chi tiết cơ sở giải phẫu vi thể của mao mạch võng mạc, phân tích ba lớp cấu trúc từ trong ra ngoài: lớp tế bào nội mô (nối với nhau bằng liên kết khe, có lỗ nội mô và không bào vi ẩm), lớp màng đáy (chứa Coll IV, Fibronectin, Laminin, HSPGs) và lớp tế bào quanh mạch có chức năng co bóp điều hòa dòng máu. Luận án phân tích tiến trình tổn thương vi mạch trên mô hình động vật gặm nhấm đái tháo đường: sau vài tuần tăng đường huyết xuất hiện phản ứng tăng sinh thần kinh đệm; sau 2-4 tháng xuất hiện hiện tượng tăng tính thấm, rò rỉ thành mạch và dày màng đáy mao mạch; sau 6-9 tháng xuất hiện mao mạch không có tế bào và mất tế bào ngoại mạch.

Về cơ chế bệnh sinh phân tử, chương này phân tích mối liên hệ tương hỗ giữa ba trục bệnh lý chính dưới tác động của tăng đường huyết:

1. Trục biến đổi chất nền ngoại bào: Sự tăng tổng hợp vượt mức Coll IV, FN và Laminin làm dày màng đáy mao mạch võng mạc.
2. Trục liên kết tế bào - tế bào: Giảm biểu hiện connexin-43 (Cx43) và các protein liên kết vòng bịt (tight junction như occludin, ZO-1), gây phá vỡ tính liên tục của hàng rào máu - võng mạc và làm mất kết nối chuyển hóa giữa tế bào nội mô, tế bào quanh mạch và tế bào đệm Muller.
3. Trục rối loạn chức năng ti thể: Sự phân mảnh ti thể, tổn thương màng ti thể và giải phóng Cytochrome C kích hoạt dòng thác caspase gây apoptosis tế bào vi mạch.

Đồng thời, chương tổng quan phân tích sâu cấu trúc phân tử của LOX, cơ chế chuyển hóa từ tiền chất pro-LOX (50 kDa) thành LOX trưởng thành (32 kDa), vai trò liên kết chéo collagen/elastin cũng như bệnh học liên quan đến tăng hoặc giảm biểu hiện LOX trên các cơ quan và trong nhãn khoa.

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình chuẩn hóa thiết kế thực nghiệm in vitro tại Trường Y Đại học Boston. Tác giả trình bày tường tận công thức pha chế 50 ml môi trường nuôi cấy đối chứng (5 mmol/l glucose) và môi trường glucose cao (30 mmol/l glucose có bổ sung 650 $\mu$l Glucose 2M). Quy trình cấy truyền tế bào được chuẩn hóa theo từng mốc thời gian thí nghiệm: thử nghiệm 1 ngày (cấy 750.000 tế bào/đĩa), 3 ngày (500.000 tế bào/đĩa), 5 ngày (125.000 tế bào/đĩa) và 7 ngày (30.000 tế bào/đĩa) nhằm đảm bảo khi thu hoạch mật độ tế bào đạt trạng thái đồng nhất khoảng 2 triệu tế bào/đĩa.

Chương này quy định chi tiết quy trình chiết xuất từng phân đoạn protein:

• Sử dụng dung dịch $NH_4OH$ để làm tan hoàn toàn lớp tế bào mà không phá hủy cấu trúc protein chất nền ngoại bào bám đáy đĩa.
• Sử dụng dung dịch Trypsin-EDTA để thu hồi riêng khối tế bào nội bào.
• Kỹ thuật tạo gel polyacrylamide SDS (dung dịch đệm Tris, acrylamide 30%, APS 10%, TEMED), điều kiện điện di, chuyển màng PVDF và nồng độ pha loãng kháng thể sơ cấp đặc hiệu (kháng thể kháng LOX dòng thỏ tỷ lệ 2.5 $\mu$l trong 5 ml dung dịch BSA 5%).
• Giao thức nhuộm miễn dịch huỳnh quang kép và quy trình đo độ thẩm thấu FITC-dextran trên hệ thống SpectraMax Gemini.
• Toàn bộ 104 thử nghiệm đều được thiết kế chặt chẽ, tuân thủ các quy chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương 3: Kết quả

Chương 3 trình bày toàn bộ các phát hiện thực nghiệm định lượng và định tính thu được từ 104 thử nghiệm:

• Sự thay đổi mức độ biểu hiện và hoạt tính của LOX trong môi trường glucose cao:

  • Phân tích Western Blot cho thấy trong môi trường glucose cao (30 mmol/l) kéo dài 7 ngày, hàm lượng protein LOX trưởng thành (32 kDa) tăng đáng kể trong mẫu protein toàn phần, trong phân đoạn protein chất nền ngoại bào (ECM) và trong dịch môi trường nuôi cấy tế bào so với nhóm đối chứng glucose 5 mmol/l.
  • Phân tích động học bài tiết LOX ngoại bào theo các mốc thời gian 1, 3, 5 và 7 ngày ghi nhận hàm lượng LOX tiết vào môi trường nuôi cấy tăng dần theo thời gian tiếp xúc với nồng độ glucose cao.
  • Đánh giá hoạt tính enzyme cho thấy hoạt tính xúc tác của LOX trong môi trường glucose cao tăng rõ rệt so với môi trường đối chứng bình thường.
  • Khi xử lý tế bào bằng LOXsiRNA, mức độ biểu hiện protein LOX bị ức chế giảm rõ rệt. Khi xử lý bằng chất ức chế hóa học BAPN, hoạt tính xúc tác của enzyme LOX bị ức chế hiệu quả.

• Tác động của thay đổi biểu hiện LOX tới hoạt động chức năng tế bào nội mô:

  • Độ thẩm thấu tế bào nội mô: Môi trường nồng độ glucose cao làm tăng đáng kể độ thẩm thấu của lớp đơn tế bào nội mô võng mạc (đo bằng sự rò rỉ FITC-dextran). Khi ức chế LOX bằng LOXsiRNA hoặc bằng BAPN, mức độ tăng tính thấm tế bào nội mô giảm đi đáng kể.
  • Hiện tượng chết tế bào theo chương trình (Apoptosis): Số lượng tế bào chết theo chương trình/1000 tế bào tăng cao rõ rệt ở nhóm nuôi cấy trong môi trường glucose cao so với nhóm đối chứng. Việc can thiệp giảm mức biểu hiện LOX (bằng LOXsiRNA) hoặc ức chế hoạt tính LOX (bằng BAPN) giúp làm giảm số lượng tế bào nội mô bị apoptosis.
  • Con đường truyền tín hiệu sinh tồn AKT: Môi trường glucose cao làm suy giảm mức độ phosphoryl hóa AKT trong tế bào nội mô; can thiệp ức chế LOX giúp phục hồi hoạt động của con đường AKT, hỗ trợ duy trì sự sống còn của tế bào.

• Sự thay đổi mức độ bám dính và liên kết của LOX với Collagen IV và Fibronectin:

  • Kỹ thuật lắng đọng miễn dịch kết hợp Western Blot chứng minh trong môi trường glucose cao, lượng enzyme LOX gắn kết với Collagen IV và Fibronectin tăng lên rõ rệt trong cả phân đoạn protein toàn phần và phân đoạn protein chất nền ngoại bào.
  • Hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang trên kính hiển vi phát huỳnh quang, kính hiển vi đồng tiêu và sinh hiển vi điện tử xác nhận sự gia tăng mật độ và độ bao phủ của phức hợp liên kết LOX - Collagen IV và LOX - Fibronectin tại mạng lưới chất nền ngoại bào xung quanh tế bào nội mô võng mạc.
  • Sự gia tăng bám dính này dẫn tới hiện tượng liên kết chéo quá mức các sợi chất nền ngoại bào, làm biến đổi tính chất cơ sinh học của màng đáy mao mạch.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 bàn luận và phân tích sâu sắc các cơ chế sinh học phân tử giải thích cho các kết quả quan sát được:

• Tác giả lập luận rằng sự gia tăng tổng hợp và bài tiết LOX dưới tác động của nồng độ glucose cao là một mắt xích bệnh sinh trung tâm dẫn đến biến chứng vi mạch võng mạc đái tháo đường. Glucose cao kích hoạt các yếu tố phiên mã nội bào, thúc đẩy biểu hiện gen LOX và đẩy mạnh quá trình cắt tiền chất pro-LOX thành dạng hoạt tính 32 kDa bài tiết ra khoang ngoại bào.
• Việc LOX ngoại bào tăng cường bám dính và xúc tác tạo liên kết chéo quá mức giữa các phân tử Collagen IV và Fibronectin giải thích cho hiện tượng màng đáy mao mạch võng mạc bị dày lên, mất tính co giãn đàn hồi và trở nên xơ cứng bất thường trên mô bệnh học. Mặc dù màng đáy dày lên, mật độ sắp xếp sợi bất thường lại tạo ra các lỗ rò vi thể, làm suy yếu tính toàn vẹn của hàng rào chọn lọc, dẫn đến rò rỉ dịch mạch máu võng mạc trên lâm sàng.
• Bàn luận làm rõ mối quan hệ giữa tăng biểu hiện LOX và cái chết theo chương trình của tế bào nội mô: sự thay đổi cơ sinh học chất nền ngoại bào do dư thừa liên kết chéo LOX gửi các tín hiệu bất lợi qua thụ thể integrin vào nội bào, ức chế con đường sinh tồn AKT, kích hoạt quá trình apoptosis tế bào nội mô.
• Kết quả ức chế biểu hiện bằng LOXsiRNA hoặc ức chế hoạt tính bằng BAPN giúp phục hồi hàng rào tế bào, giảm apoptosis và cải thiện tín hiệu AKT là bằng chứng khẳng định vai trò bệnh sinh trực tiếp của LOX, mở ra cơ sở lý thuyết cho các can thiệp đích phân tử.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã tự công bố các đóng góp mới về mặt khoa học lý luận và giá trị thực tiễn:

1. Đóng góp về mặt lý luận:

   • Luận án là công trình đầu tiên xác định một cách hệ thống sự thay đổi mức độ biểu hiện gen, hàm lượng protein và hoạt tính của enzyme Lysyl oxidase (LOX) ở tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong điều kiện môi trường glucose cao.
   • Chứng minh được động học tăng tiết của LOX ngoại bào theo thời gian và sự gia tăng bám dính đặc hiệu của LOX với các protein cấu trúc màng đáy là Collagen IV và Fibronectin trong phân đoạn chất nền ngoại bào.
   • Làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh mới: nồng độ glucose cao gây tăng biểu hiện LOX $\rightarrow$ tăng liên kết chéo màng đáy quá mức $\rightarrow$ ức chế con đường tín hiệu AKT $\rightarrow$ thúc đẩy apoptosis tế bào nội mô và làm tăng tính thấm thành mạch võng mạc.

2. Đóng góp về mặt thực tiễn và định hướng can thiệp:

   • Chứng minh thực nghiệm rằng việc can thiệp ức chế biểu hiện gen LOX (bằng LOXsiRNA) hoặc ức chế hoạt tính enzyme LOX (bằng BAPN) có khả năng làm giảm tính thấm tế bào nội mô, ngăn ngừa hiện tượng chết tế bào theo chương trình và bảo vệ tính toàn vẹn của hàng rào tế bào vi mạch.
   • Đề xuất hướng tiếp cận điều trị mới nhắm đích vào enzyme Lysyl oxidase nhằm phòng ngừa và làm giảm mức độ nghiêm trọng của các tổn thương vi mạch võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường giai đoạn sớm.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Nghiên cứu được thực hiện chủ yếu dưới dạng mô hình thử nghiệm tế bào in vitro trên dòng tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột (RRECs), chưa phản ánh toàn diện các tương tác đa bào phức tạp (giữa tế bào nội mô, tế bào quanh mạch, tế bào Muller và tế bào miễn dịch) trong nhãn cầu sống hoàn chỉnh.
  • Các thử nghiệm can thiệp ức chế LOX (LOXsiRNA, BAPN) mới dừng lại ở đánh giá đáp ứng tế bào ngắn ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm.

• Hướng nghiên cứu tiếp theo (trang 102 của luận án):

  1. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tín hiệu phân tử nội bào trực tiếp điều hòa sự gia tăng biểu hiện của enzyme LOX trong điều kiện đường huyết cao.
  2. Xác định các yếu tố phiên mã và thụ thể màng tham gia điều hòa trục tín hiệu LOX - Collagen IV/Fibronectin.
  3. Đánh giá hiệu quả của các chất ức chế chọn lọc LOX trên mô hình động vật đái tháo đường in vivo dài hạn nhằm kiểm định khả năng ngăn ngừa sự hình thành mao mạch không có tế bào, mất tế bào quanh mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc trước khi tiến hành các thử nghiệm tiền lâm sàng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành có giá trị học thuật cao đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên sau đại học và bác sĩ chuyên khoa Nhãn khoa, Nội tiết - Đái tháo đường: Cung cấp hệ thống tài liệu tổng quan toàn diện về vi cấu trúc màng đáy mao mạch võng mạc, cơ chế bệnh sinh phân tử của biến chứng vi mạch đái tháo đường và vai trò sinh học của họ enzyme Lysyl oxidase.
• Các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực Y sinh học, Sinh học phân tử và Dược lý học: Tham khảo quy trình chuẩn hóa kỹ thuật nuôi cấy tế bào nội mô vi mạch võng mạc (RRECs), phương pháp tách biệt phân đoạn protein tế bào nội bào và protein chất nền ngoại bào bằng dung dịch hóa chất chuyên biệt ($NH_4OH$, Trypsin-EDTA), kỹ thuật lắng đọng miễn dịch (IP), Western Blot định lượng protein màng đáy, kỹ thuật nhuộm huỳnh quang đồng tiêu phân tích bám dính phân tử và mô hình đo độ thẩm thấu qua màng lọc FITC-dextran.

Câu hỏi thường gặp

1. Trong nghiên cứu này, nồng độ glucose được sử dụng cho nhóm nghiên cứu và nhóm đối chứng là bao nhiêu?
Nhóm đối chứng (N) được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose bình thường là 5 mmol/l (pha trong môi trường DMEM tiêu chuẩn). Nhóm nghiên cứu (HG) được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao là 30 mmol/l (bổ sung thêm 650 $\mu$l Glucose 2M vào 50 ml môi trường DMEM).

2. Enzyme Lysyl oxidase (LOX) được tổng hợp dưới dạng tiền chất nào và có kích thước phân tử hoạt tính là bao nhiêu kDa?
LOX được tổng hợp dưới dạng tiền enzyme glycosyl hóa pro-LOX có trọng lượng phân tử 50 kDa. Tiền chất này sau đó được bài xuất ra khoang ngoại bào và phân cắt bởi các enzyme procollagen C-proteinases và BMP-1 để tạo thành dạng enzyme LOX hoạt tính có kích thước 32 kDa và đoạn propeptide LOX-PP 18 kDa.

3. Tác giả sử dụng những chất/công cụ nào để ức chế biểu hiện và hoạt tính của LOX trong các thử nghiệm?
Để ức chế mức độ biểu hiện gen LOX ở cấp độ dịch mã, tác giả sử dụng đoạn RNA can thiệp nhỏ đặc hiệu (LOXsiRNA). Để ức chế hoạt tính xúc tác của enzyme LOX, tác giả sử dụng chất ức chế hóa học không thuận nghịch $\beta$-aminopropionitrile (BAPN).

4. Môi trường glucose cao ảnh hưởng như thế nào đến độ thẩm thấu và sự chết tế bào nội mô mạch máu võng mạc?
Môi trường glucose cao (30 mmol/l) làm tăng đáng kể độ thẩm thấu của lớp tế bào nội mô đối với FITC-dextran và làm tăng số lượng tế bào chết theo chương trình (apoptosis)/1000 tế bào. Khi can thiệp ức chế LOX bằng LOXsiRNA hoặc BAPN, độ thẩm thấu màng tế bào giảm rõ rệt và tỷ lệ apoptosis tế bào nội mô giảm đi đáng kể.

5. Cỡ mẫu nghiên cứu thực nghiệm của luận án được tính toán theo công thức nào và tổng cộng có bao nhiêu thử nghiệm?
Cỡ mẫu được tính theo công thức Resource equation áp dụng cho nghiên cứu thử nghiệm: $n = E / (k + 1)$ (với $E = 10 - 20, k = 2 - 4$), cho ra $n = 2 - 7$. Tác giả chọn lặp lại 6 lần cho mỗi thử nghiệm định lượng và chọn ngẫu nhiên 6 vi trường cho thử nghiệm định tính, thực hiện tổng cộng 104 thử nghiệm (102 thử nghiệm định lượng và 2 thử nghiệm định tính).

Kết luận

Luận án tiến sĩ y học của tác giả Nguyễn Ngân Hà đã chứng minh một cách thực nghiệm rằng môi trường nồng độ glucose cao làm gia tăng đáng kể mức độ biểu hiện, sự bài tiết ngoại bào, hoạt tính xúc tác và mức độ gắn kết của enzyme Lysyl oxidase (LOX) với Collagen IV và Fibronectin tại chất nền ngoại bào của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột. Sự biến đổi bệnh lý này trực tiếp gây tăng tính thấm thành mạch, ức chế đường truyền tín hiệu AKT và thúc đẩy quá trình chết tế bào nội mô theo chương trình. Việc can thiệp ức chế biểu hiện và hoạt tính LOX bằng LOXsiRNA hoặc BAPN giúp phục hồi tính toàn vẹn của hàng rào tế bào và bảo vệ tế bào nội mô, khẳng định LOX là một mục tiêu phân tử tiềm năng trong phòng ngừa và điều trị sớm bệnh võng mạc đái tháo đường.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị lực trong dân số trong độ tuổi lao động [1-2]. Các giai đoạn đầu của bệnh võng mạc đái tháo đường được đặc trưng bởi sự hiện diện của mao mạch không có tế bào và sự chết tế bào ngoại mạch, tiếp đó là sự chết tế bào mạch máu võng mạc theo chương trình [3-4]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng đáy mao mạch dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường [5-6] và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu [7-8]. Ngoài ra, màng đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc [4], một dấu hiệu lâm sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường.

Cơ chế bệnh sinh của bệnh lý vi mạch do đái tháo đường bị ảnh hưởng bởi những thay đổi về chất lượng và số lượng của màng đáy mao mạch. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá rõ [9], nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng của bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn chưa rõ ràng. Ức chế enzyme này có thể gây ra bệnh loãng xương [11], nhưng đồng thời, các loại tế bào khối u gây tăng lượng enzyme này có thể thúc đẩy sự di căn của khối u hiện có, khiến nó trở nên ác tính [12-13]. LOX được tổng hợp và tiết ra dưới dạng tiền enzyme glycosyl hóa (proLOX, 50 kDa), tiếp tục trải qua quá trình phân giải protein ngoại bào thành dạng trưởng thành (LOX 32 kDa) [14].

LOX trưởng thành một phần quay trở lại tế bào, một phần bám vào chất nền ngoại bào thực hiện chức năng sinh học. Enzym LOX xúc tác quá trình khử luan an 2 oxy hóa lượng peptidyllysine và hydroxylysine dư thừa trong tiền chất collagen và lượng lysine dư thừa trong elastin. Các aldehyd này trải qua các phản ứng tự ngưng tụ dẫn đến hình thành chất nền ngoại bào [14-15]. Vì vậy, LOX đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn vẹn của màng đáy.

LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ, tim, phổi, gan, sụn, xương, thận, vú, võng mạc và não [16-18]. Có khá nhiều nghiên cứu về LOX tại tim, xương, vú, phổi,. đem lại những hiểu biết sâu hơn về cơ chế sinh bệnh và mở ra các hướng nghiên cứu biện pháp can thiệp hiệu quả. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa tổn thương võng mạc do đái tháo đường [19].

Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường [12]. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường [20]. Tuy nhiên, cơ chế gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào còn chưa rõ ràng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu "Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao" với 2 mục tiêu: 1.

Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. luan an 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có lớp nội mô, màng đáy và tế bào quanh mạch.

Lớp nội mô Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao mạch. Phần bào tương chứa nhân lồi vào lòng mạch, phần bào tương ở ngoại vi tế bào toả thành lá mỏng. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên kết khe. Dưới sinh hiển vi điện tử có thể thấy ở lá bào tương tế bào nội mô có những cửa sổ (lỗ nội mô), màng bào tương ở cả hai mặt tế bào có những vết lõm siêu vi, trong bào tương có những không bào vi ẩm.

Những bào quan như lưới nội bào, ti thể, ribosom nằm rải rác nhưng tập trung nhiều quanh nhân, bộ Golgi nhỏ, thường nằm sát nhân [6-21-23]. Cấu trúc mao mạch võng mạc [24] A. Thiết đồ cắt ngang luan an 4 1. Cấu trúc Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào nội mô và tế bào ngoại mạch của mạch máu [25].

Màng đáy mạch máu chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để hình thành giá đỡ cho tế bào [25]. Màng đáy là nơi thực hiện nhiều chức năng quan trọng của tế bào do đó nó rất quan trọng với sự sống còn của tế bào và cân bằng nội môi võng mạc. Màng đáy mạch máu cung cấp môi trường vi mô, tại đó tín hiệu hai chiều thông qua các integrin điều chỉnh sự gắn kết và chức năng của tế bào. Chức năng chính của màng đáy là tạo bộ khung gắn kết tế bào [26], tạo điều kiện cho kết nối tế bào-tế bào [27], và điều khiển việc chữa lành vết thương [28].

Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV (Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn của màng đáy. Ở võng mạc, chất nền ngoại bào được sản xuất chủ yếu bởi các tế bào nội mô mạch máu và tế bào ngoại mạch [6-21-22]. Các loại tế bào khác cũng sản xuất một lượng nhỏ chất nền ngoại bào là tế bào Muller [29], tế bào hình sao [30], tế bào hạch [31] và các tế bào biểu mô võng mạc [32]. Bằng phương pháp đo lường siêu cấu trúc sử dụng sinh hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về độ dày màng đáy mạch máu giữa các mô (bảng 1) và giữa các lớp động vật (bảng 2).

Màng đáy bao gồm 2 vùng riêng biệt là lá sáng (lamina lucida) và lá đặc (lamina densa), nơi tiếp giáp phía trước với màng tế bào, phía sau liên tục với mô liên kết của chất nền ngoại bào [33]. luan an 5 Bảng 1. Độ dày màng đáy mạch máu ở các mô khác nhau trên cơ thể ngƣời [6] Loại mô Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Võng mạc 250-480 [34] Tiểu cầu thận 330±50 [35-36] Cơ xương 220 [37] Cơ tim 77±4 [38] Cơ tứ đầu đùi 108-246 [39] Bảng 1. Độ dày màng đáy mao mạch võng mạc ở các loài khác nhau [6] Loài Độ dày (nm) Tài liệu tham khảo Chuột nhắt 93±19 [40] Chuột cống 51-112 [41] Mèo 72±12 [42] Chó 90-140 [43] Người 250-450 [34] 1.

Thành phần Màng đáy bao gồm nhiều thành phần sắp xếp một cách có tổ chức. Một số thành phần chính tạo nên bộ khung của màng bao gồm Coll IV, FN, laminin và heparan sulfate proteoglycan. Ngoài ra màng cũng chứa các thành luan an 6 phần khác như nidogen, tenascin, perlecan, agrin collagen I, II, III và chondroitin sulfate proteoglycan [44-45]. Collagen IV là thành phần phong phú nhất trong chất nền ngoại bào, và chỉ được tìm thấy trong màng tế bào.

Coll IV có trọng lượng phân tử khoảng 500 kD với chiều dài trung bình 400 nm [46] và cấu trúc bộ ba xoắn ốc nguồn gốc từ 3 chuỗi α, bao gồm 2 chuỗi α1 giống hệt nhau và 1 chuỗi α2 [47]. Mỗi chuỗi chứa 3 vùng riêng biệt: đầu amino giàu cysteine và lysin, vùng amino axit với chuỗi Gly-X-Y lặp lại khoảng 1400 lần và đầu carboxyl chứa khoảng 230 amino axit [48]. Tổng thể cấu trúc của Coll IV sắp xếp dạng như mạng tinh thể được tổng hợp khi vùng gen khởi động tương tác với vị trí NC1 tại đầu tận carboxyl tạo nên các dimer [49]. Các dimer này sau đó được liên kết chéo với nhau tại vùng 7S nằm tại đầu tận amino [33].

Collagen có các vị trí kết dính tương tác trực tiếp với các intergrin α1β1 và α2β1 cho phép tế bào kết nối với màng tế bào và khởi động các tín hiệu tế bào [50]. Coll IV cũng tạo thành một giá đỡ để liên kết các thành phần chất nền ngoại bào khác [51]. Cấu trúc màng đáy mao mạch [24] luan an 7 Fibronectin, 1 glycoprotein lớn, là thành phần quan trọng của màng đáy được biết đến với khả năng hoạt động như một chất keo phân tử và duy trì cấu trúc phân tử ổn định của màng đáy. FN là một dimer bao gồm 2 tiểu đơn vị lớn, giống hệt nhau, mỗi đơn vị nặng khoảng 250 kD được liên kết cộng hoá trị thông qua liên kết disulfide ở đầu tận C [26-52-53].

Sau khi được tổng hợp, FN tập hợp thành 1 mạng lưới sợi phụ thuộc integrin [26], sử dụng vị trí RGD (Arg-Gly-Asp) bám vào vị trí α5β1 của integrin [52]. FN tạo điều kiện cho sự kết dính của tế bào, di chuyển, tăng trưởng tế bào và biệt hoá thông qua các tương tác đặc hiệu bao gồm các vị trí kết dính cho collagen, heparan và các proteoglycan khác. FN gắn kết các thành phần chất nền ngoại bào thành một cấu trúc có tổ chức, do đó đóng góp vào sự toàn vẹn và chức năng của chất nền ngoại bào [52-54]. Laminin là 1 glycoprotein không chứa collagen, được tìm thấy chủ yếu trong lớp lá sáng [55].

Laminin có trọng lượng phân tử khoảng 820 kD và chứa 3 chuỗi polypeptid: α, β, và γ. Cả 3 chuỗi đều chứa nhánh dài xoắn ốc (dài khoảng 75 nm), ngoài ra chuỗi α có thêm nhánh ngắn (dài khoảng 35 nm) [56]. Phần cơ bản của nhánh dài là miền G chứa các chuỗi tương tự yếu tố tăng trưởng biểu bì [56]. Chuỗi ba lần lặp đầu tiên, gọi là G1-3 chịu trách nhiệm kết dính với các integrin, trong khi chuỗi 2 lần lặp cuối cùng (ví dụ G4- 5) chịu trách nhiệm kết dính với các heparan [57].

Laminin tương tác với collagen IV bằng cách cùng bám dính vào nhiều thành phần khác của chất nền ngoại bào bao gồm FN và integrin [58].