MỞ ĐẦU Từ đầu thập niên 1950 việc nghiên cứu và phát triển các vacxin đã có được bước tiến bộ nhảy vọt nhờ phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro thành cong. Thoat ti¢n Goodpasture đã nuôi cấy tĩnh được màng phôi gà. Sau đó Maitland đã cải tiến nuôi tế bào thận gà trong chai thuỷ tính, dùng môi trường có huyết thanh gà và một số muối khoáng để cấy virut vacxin. Không lâu về sau, Gey đã có một đóng góp đáng kể : ông đề xuất phương pháp quay tròn liên tục các ống nghiệm nuôi tế bào đã cấy virut vacxin và bằng kỹ thuật này Gey đã thu hoạch được lượng virut lớn hơn gấp bội.
Cũng trong những năm 50, Enders, Wella và Robbins thực hiện nhiều thí nghiệm cấy virut trên tế bào người nuôi in vitro, chủ yếu là các nguyên bào xơ (fibroblast) từ tổ chức da và cơ của trẻ chết khi mới sinh. Bằng phương pháp này các tác giả đã đạt được những kết quả rất khả quan là được polyovirut týp II Langsing với khối lượng khá lớn trong tế bào nuôi. Thành công trong việc sử dụng tế bào nuôi in vitro để cấy virut gây bệnh cho người đã mở ra một kỷ nguyên mới nghiên cứu và phát triển một loạt các vacxIn mới phòng các bệnh bại liệt, dại, quai bị, thuỷ đậu, sởi, v. Công nghệ nuôi tế bào ở một quy mô lớn ngày càng được cải tiến và hoàn thiện sẽ tạo điều kiện thuận lợi hơn nữa cho việc sản xuất các vacxin và nghiên cứu sinh y học.
Bằng phương pháp trypsin hoá người ta đã tách được các tế bào riêng rẽ từ mô [3]. Trypsin là một trong những enzym phân giải protein đặc hiệu nhất sẵn có và cũng được sử dụng rộng rãi nhất [9]. Trypsin với nét đặc trưng của chuỗi peptit liên quan đến nhóm cacboxyl của các axit amin cơ bản [22]. Ở điều kiện thích hợp trypsin hoạt động rất hữu hiệu trong việc tách mô, nhưng trypsin sẽ phá huỷ tế bào nếu kéo dài thời gian trypsin hoá [26].
Từ yêu cầu thực tế cần lượng tế bào sống nhiều hơn, nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Dang trypsin thêm axit amin tách tế bào phôi gà và đánh giá sự phát triển của tế bào đó “*. Mục tiêu của đề tài bao gồm những vấn đề chính sau: L)Nghiên cứu ảnh hưởng của trypsin và trypsin có axit amin đến sự tách tế bào phôi gà. 2) Đánh giá sự phát triển của hai nhóm tế bào tách được theo các phương pháp trên. Chương l TỔNG QUAN 1.
Sơ lược lịch sử tế bào học. Tế bào được Robert Hook phát hiện lần đầu tiên vào năm 1665 nhờ kính hiển vi tự tạo với độ phóng đại 30X. Ông đã xuất bản cuốn “Kính hiển vi” mô tả nhiều đối tượng mà ông đã quan sát được. Ông mô tả cấu trúc của tiêu bản thực vật ở dạng các xoang rỗng có thành bao quanh và đặt tên là cella [4].
Antoni Van Leuvenhock (1674) với kính hiển vi có độ phóng dai 270X đã mô tả các tế bào động vật và đã xác định tế bào không phải là xoang rỗng mà có cấu trúc phức tạp. Từ quan điểm tế bào là “xoang rỗng” đã chuyển sang quan niệm tế bào là khối tế bào chất có chứa nhân (R. Brawn, 1831) và được giới hạn bởi màng tế bào [4]. Nhiều quá trình sinh lý quan trọng của tế bào được nghiên cứu làm cơ sở cho sự phát triển của di truyền học , sinh lý học và phôi sinh học ở cuối thế kỷ XIX và đầu thé ky XX [21].
Cơ thể chỉ sống trong trường hợp nếu các hợp phần của nó được cấu tạo từ tế bào. Mô của tất cả các cơ thể đều bao gồm những tế bào gắn với nhau bằng những lực bám thông thường. Tất cả các mô và các cơ quan chỉ là các khối tế bào biến dạng khác nhau [II], tế bào sinh ra bằng cách chia đôi và có câu phát biểu nổi tiếng : “Ngoài tế bào không có sự sống” [4]. Học thuyết tế bào được Engels đánh giá là một trong mhững sự kiện lớn nhất của thế kỷ 19.
Học thuyết cho rằng: + Mỗi cơ thể sống đều có cấu tạo tế bào và sản phẩm hoạt động sống của tế bào. + Các tế bào mới được hình thành từ sự phân chia tế bào cũ + Thành phần hoá học và sự chuyển hoá của chúng rất giống nhau. Hoạt tính cơ thể toàn vẹn bao gồm hoạt tính và sự tác động tương hỗ của các đơn vị tế bào độc lập cấu tạo nên nó [Š]. Tế bào là đơn vị sống cơ bản được tạo thành bởi các thành phần quan trọng liên quan mật thiết với nhau gồm 3 thành phần cơ bản: màng, tế bào chất, nhân [4].
Màng bào tương Trong đề tài nghiên cứu này bằng phương pháp trypsin hoá chúng tôi đã tách được những tế bào riêng rẽ từ mô (phôi gà), để biết được những tác dụng tích cực cũng như không tích cực trong việc thuỷ phân protein màng tế bào của trypsin. Chúng tôi quan tâm rất nhiều đến cấu trúc của màng, đặc biệt đến các phần biệt hoá của màng nối giữa các tế bào với nhau. Màng bào tương là màng ngăn, giới hạn sự ngấm thu động dẫn đến kết quả là màng đó chỉ cho phép các chất đi qua theo gradien nồng độ, người ta thấy rằng nước và những chất có khối lượng phân tử nhỏ đi qua màng ngăn đó một cách tự do. Sự vận chuyển một số chất như đường, axit amin.
có sự tham gia của các enzym. Các enzym làm tăng tốc độ thẩm thấu của các chất đó qua màng. Hệ thống enzym này tham gia vào thành phần cấu tạo của chính màng và hoạt động như “chất chuyên chở” không phụ thuộc vào năng lượng [5] Màng tế bào là một màng rất mỏng , không thể nhìn thấy được dưới kính hiển vi quang học mà được nhìn thấy dưới kính hiển vi điện tử. Màng bào tương bọc quanh tế bào cũng được xác nhận nhờ các hiện tượng sau: — Các chất chứa trong tế bào bị chảy ra, đặc biệt là khi thiếu Ca'", khi tế bào bị tổn thương.
— Các loại phân tử ngấm vào tế bào không cùng tốc độ như nhau. — Những lon cũng như phân tử mang điện tích thâm nhập vào tế bào chậm hơn những phân tử không mang điện tích. — Những phân tử bé thâm nhập vào tế bào nhanh hơn những phân tử lớn. Cấn tạo của bào tương.
Overton (1902) nhận thấy những chất hoà tan trong lipit rất dễ xâm nhập vào tế bào, đồng thời ông ta nhận thấy rằng những dung môi của lipit và những men lipaza phá huỷ mặt tế bào. Từ đó ông kết luận màng bào tương có chất lipit. Giả thuyết được khẳng định sau khi người ta nhận thấy những hoạt động men ở mặt ngoài màng bào tương. Từ đó kết luận màng bào tương được tạo thành bởi lipit và protit.
Bằng phương pháp hoá học tế bào, người ta còn chứng minh sự có mặt một lớp chất có tính chất của polysaccarit ở trên mặt tế bào. Phân tích hoá học, nhận thấy màng bào tương tách rời có lipit, protit với số lượng tương đương, đồng thời có thêm polisaccarit [28]. Màng bào tương là một máng đậm, dày cách màng tế bào bởi một vùng sáng nhỏ hơn đó là một trường hợp các desmosom đã được biệt hoá cao độ [6]. Màng tế bào có thể kết dính với lá trong.
Màng bào tương có thể cấu trúc kiểu màng, song song với mặt tế bào. Các màng này liên kết với nhau trong một khuôn có bản chất hoá hoc gần giống keratohyaline [18]. Các sợi nhỏ nội tế bào (tonofilaments) là những thành phần quan trọng nhất của vùng liên kết. Tonofilaments có đường kính [0Ø nm, xuyên qua các mảng bào tương, và chia ra thành các tiền sợi bám vào các tiểu thể protein nội màng.
Các tonofilaments là một thành phần của bộ xương tế bào, là chất sừng của tế bào (phân tử khối 50000 + 60000 daltons). Các desmosom có trong tất cả các biểu mô, các nội mô và trong mô, với độ biệt hoá khác nhau [20] (hình 1(a), 1(b)). À Màng bào tương xf lá trong bị dày lên~ khung || TB *————— Đường đậm giữa | Hình 1(a) - Cấu tạo của màng bào tương ‘ = Không mang ee ` Te ee ` ¬. mR MPA: b TÊ‹ : W2 j xã io 6 OPE — bao tương cà ˆ lên a Ry’! Dow’ CŸ UA mS: Mỹ ‘q a> a ' — ¬.
O 6 ct Le - Ó/%0 2 t= +2 Veco ip Hail wily? Vr y , aes 3 v TẢ. tt NM hh ‹ h M \ 6 va : a Ũ cn Pe Pit vs bx s, SSS % ) | alte `. Cac hat ANE EN See ES i* Demosom nội mang Mặt ngoài của lá trong Hình 1(b)- Cấu tạo của màng bào tương b.Thành phần hoá học của màng bào tương Những hiểu biết của chúng ta liên quan đến thành phần hoá học tế bào bắt đầu từ thí nghiệm trên màng hồng cầu và màng vi trùng [20]. Nếu như tế bào hồng cầu được cho vào dung dịch nhược trương thì sẽ còn lại những bong bóng nhỏ, cái mà nó chỉ bao gồm màng tế bào mà thôi.
Nếu như chúng ta phân tích thành phần hoá học màng này thì tỷ lệ giữa lipit va protehs là 1,0 + 1,7 thành phần protein đóng vai trò là khung có tính axit và là một chất có phân tử lượng rất lớn. Thành phần lipit chính là phospho lipit (55 + 75%), trước hết là becithin và cephalin. Mỗi một phân tử protein có từ 75 + 90 phân tử mỡ, mới đây người ta đánh giá rất cao giá trị của gangliosit có trên màng tế bào. Những chất này tương tự như photpholipit nó là một chuỗi kị nước, nhưng phần có cực thì dài và kết thúc bởi axit neuramin, cái mà có một nhóm cacboxyl tự do.
Cực cuối của phân tử chứa N-axetyllactosamil, glactosamil và đường glucose [17]. Điện tích bề mặt âm tính người ta cho rằng có liên quan đến nồng độ của đoạn cuối axit neuramin. Sau khi hoà tan nhẹ với neuraminidase đặc biệt thì axit neuramin tan ra từ tế bào sống và tính (—) của bề mặt giảm. Các thành phần quan trọng của gangliosit đóng vai trò trong vận chuyển ion và trong màng chứa neuron.
Bên cạnh việc tạo nên các nhóm cacboxyl ionogen trên bề mặt tế bào axit neuramin là thành phần quan trọng của một số kháng nguyên bề mặt (virut và kháng nguyên toxin). Những điều đó chỉ ra rằng các gangliosit là thành phần cấu trúc quan trọng của màng tế bào. Sự biệt hoá nàng bào tưong và sự kết dính.