CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi khuẩn Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes (L.1) là vi khuẩn gram dương thuộc chi Listeria. Vi khuẩn này có hình que, không bào tử, yếm khí, kích thước khoảng 0,5µm1,5µm.
monocytogenes có kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H, được chia thành 7 loại huyết thanh (từ I đến VII). Vi khuẩn Listeria monocytogenes Vi khuẩn L. monocytogenes được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong tự nhiên như đất, nước, thảm thực vật mục nát, trong các động vật hoang dã, các loại sản phẩm chế biến từ sữa, thịt cá tươi sống và các sản phẩm của thịt cá, rau xanh. Một số loại thực phẩm như ngô, sô cô la, xà lách, tôm và gạo đã được báo cáo có nhiễm vi khuẩn L.
Vi khuẩn này có sức đề kháng cao nên chúng tồn tại khá lâu ngoài môi trường. Con đường lây lan chủ yếu là qua đường tiêu hóa, ít gặp qua đường hô hấp. Ở trẻ sơ sinh, bệnh truyền qua rau thai hoặc lây lúc trẻ lọt qua đường sinh dục của người mẹ. monocytogenes có bảy yếu tố độc lực: (1) Protein bề mặt internalin, có hai dạng InlA và InlB đóng vai trò thậm nhập vào tế bào.
InlA thâm nhập vào các tế bào không thực bào như tế bào biểu mô, còn InlB thâm nhập vào các tế LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4 bào gan [20]; (2) Protein bề mặt p104 có khả năng bám dính vào tế bào ruột [49]; (3) Listeriolysin O là một hemolysins (ngoại độc tố có khả năng ly giải tế bào hồng cầu) có vai trò gây ra bệnh listeriosis [31]; (4) Protein ActA; (5) Metalloprotease; (6) Clp proteases và ATPases; (7) Protein P60 là enzyme hydrolase xúc tác trong phản ứng trong giai đoạn cuối cùng của sự phân chia tế bào. Các yếu tố độc lực này tham gia vào quá trình lây nhiễm theo những cách riêng và có thể gây ảnh hưởng tới dẫn truyền tín hiệu của tế bào chủ với mục đích tăng cường khả năng lây nhiễm. Như vậy, với tất cả các đặc điểm này L. monocytogenes có thể gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm cho con người.
Khi xâm nhập vào trong cơ thể, L. monocytogenes gây bệnh bằng cách sinh sản và phát triển. Nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn L. monocytogenes phát triển là từ 30°C đến 37°C.
Khác với các vi khuẩn khác, L.monocytogenes có thể tồn tại và phát triển ở nhiệt độ 4°C. Thậm chí chúng còn có thể tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt như pH thấp, nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp (-0,1oC) [41, 62]. Với những đặc điểm đó, L.monocytogenes thể gây ra ngộ độc cho con người từ những thực phẩm đông lạnh. Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm nhưng khi đi vào cơ thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội gây bệnh.
Một tỉ lệ lớn dân số, ước tính khoảng 3-10%, có mang vi khuẩn L. monocytogenes trong đường tiêu hóa của họ mà không thấy bất cứ dấu hiệu gì của bệnh tật [53]. Đối tượng mắc bệnh do vi khuẩn L. monocytogenes gây ra thường là những người có sức đề kháng yếu như phụ nữ mang thai, trẻ em và người già.
Khi xâm nhập vào cơ thể, vi khuẩn L. monocytogenes thường không phát bệnh ngay mà ủ bệnh sau một thời gian khá lâu, trung bình khoảng 3 tuần, thậm chí đến 2 tháng. Các triệu chứng của bệnh ban đầu giống như cúm (sốt, khó chịu, đau cơ…) [66]. Nếu độc tố đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính sau khi ăn thực phẩm bị ô nhiễm khoảng 24 - 72 giờ, với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau quặn bụng, nhức đầu.
Nguy cơ của loại vi khuẩn này không chỉ dừng lại ở việc gây ra ngộ độc thực phẩm, mà chúng còn gây ra những biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, nhiễm trùng huyết, sẩy thai tự nhiên hoặc bệnh listeriosis ở trẻ sơ sinh [66]. Bệnh listeriosis có nguy cơ gây tử vong cao hơn so với các bệnh do các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm khác gây ra. Tỉ lệ tử vong do vi khuẩn này là rất cao, 30% trường hợp tử vong trong các ca nhiễm bệnh [55, 66]. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 5 Vi khuẩn L.
monocytogenes đã gây ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm tại nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Canada, Pháp, Bỉ… Các vụ ngộ độc này thường dẫn tới tình trạng tử vong. Theo thống kê từ năm 2002 tại Mỹ, hàng năm tại nước này, số bệnh nhân nhiễm bệnh do vi khuẩn L. monocytogenes khoảng 2500 người, với gần 500 người chết. Tại Anh từ năm 2001-2005 có 1993 người mắc, với trên 300 ca tử vong.
Ở Canada, hàng năm vẫn thường xảy ra các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn L. monocytogenes gây ra. Gần đây, tại Trung Quốc cũng đã báo cáo vài vụ ngộ độc do vi khuẩn này. Ngoài ra, còn các trường hợp [61]; từ năm 1993-1997, mỗi năm Hoa Kỳ có 100 ca tử vong [10].
Nhằm hạn chế tình trạng nhiễm khuẩn L. monocytogenes, cơ quan y tế các nước châu Âu, châu Mỹ, nước Úc, Nhật Bản. thường xuyên đưa ra những lời cảnh báo, đồng thời đưa ra các biện pháp kiểm tra nghiêm ngặt các nguồn nguyên liệu thực phẩm. Với đặc điểm dịch tễ học phức tạp, vi khuẩn L.
monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm. Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7000-10000 nạn nhân, trong đó có 100-200 ca tử vong, gây thiệt hại cho Nhà nước hàng tỉ đồng. Tuy nhiên, với điều kiện phát triển nhanh các loại thức ăn công nghiệp cũng như việc kinh doanh tràn lan nhiều loại thực phẩm không rõ nguồn gốc như hiện nay, thì thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn này không phải là ngoại lệ. Mặt khác, công tác điều tra dịch tễ và sàng lọc tác nhân gây bệnh chưa được đúng mức (phần lớn các tỉnh, thành chưa có đủ điều kiện xét nghiệm loại vi khuẩn này), vì vậy biện pháp tuyên truyền để phòng ngừa vẫn là cách tốt nhất.
Gần đây, Việt Nam cũng đã có nhiều ca nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes bị tử vong do không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp phát hiện nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes nói riêng và các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói chung là rất cần thiết. Các phương pháp phát hiện vi khuẩn Listeria monocytogenes Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes như phương pháp nuôi cấy [22], phương pháp miễn dịch [51, 58], phương pháp phân tử [63] cảm biến sinh học [32]….
Sau đây, chúng tôi trình bày một số phương pháp điển hình trên. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail. Phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes bằng phương pháp nuôi cấy Nuôi cấy là phương pháp truyền thống để phát hiện vi khuẩn L.
Phương pháp này thường rất nhạy và luôn là “tiêu chuẩn vàng” cho các phương pháp khác. Phương pháp nuôi cấy dựa trên việc làm giàu chọn lọc (selective enrichment) và đĩa cấy chọn lọc (selective plating) để phân lập các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng thuần khiết, từ đó khảo sát và định loại vi khuẩn. Việc xác định vi khuẩn dựa vào các đặc trưng của vi khuẩn như hình thái khuẩn lạc, lên men đường và thuộc tính tán huyết [22]. Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy.
Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng. Đối với hầu hết các vi khuẩn thì điều kiện nhiệt độ để vi khuẩn sinh trưởng và phát triền tốt là 37oC trong 16 giờ, nhưng đối với vi khuẩn L.monocytogenes lại có sự khác biệt, chúng có thể phát triển ngay khi nhiệt độ xuống tới 4 oC và thường được nuôi ở 30oC đến 35oC trong 24 giờ đến 48 giờ. Hai phương pháp nuôi cấy được sử dụng nhiều nhất để phát hiện vi khuẩn L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm là FDA BAM (Food and Drug Administration Bacteriological and Analytical Method – Phương pháp phân tích vi sinh của Cục quản lý thuốc và thực phẩm) và ISO 11290 (International Organization of Standards–các tiêu chuẩn của tổ chức quốc tế) [22].
Cả hai phương pháp này đều yêu cầu ủ 25g mẫu thực phẩm trong dung dịch chọn lọc (selective broth) để làm chậm sự phát triển của các sinh vật cạnh tranh, trước khi cấy lên môi trường thạch và sinh hóa chọn lọc (thạch Oxford, PALCAM, MOX hoặc LPM). Đối với FDA BAM, mẫu được ủ trong 48h ở 30oC trong môi trường tăng sinh chọn lọc như acriflavin, naladixic acid. Đối với phương pháp ISO 11290, quá trình làm giàu vi khuẩn L. monocytogenes trải qua hai giai đoạn: (1) các mẫu thực phẩm được làm giàu trong 24h trong môi trường Fraser; (2) mẫu thực phẩm được ủ trong môi trường Fraser pha loãng 2 lần trong 24 giờ, sau đó mẫu được chia ra làm nhiều phần, mỗi phần lại được ủ tiếp trong môi trường Fraser không pha loãng để làm giàu vi khuẩn.
Dung dịch Fraser chứa các tác nhân tăng sinh chọn lọc acriflavin và naladixic acid. LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 7 Năm 2002, các nhà khoa học Anh đã nuôi cấy phân lập vi khuẩn L.monocytogenes từ mẫu phân sau khi các mẫu được giữ ở 4oC với các thời gian khác nhau [15]. Kết quả báo cáo này cho thấy kỹ thuật nuôi cấy sau khi mẫu được ủ lạnh (4oC) cho kết quả tốt hơn khi mẫu không được ủ lạnh. Báo cáo cũng đưa ra kết quả là sau khi mẫu vi khuẩn được làm giàu lạnh ở tuần thứ 3 đến tuần thứ 7 cho kết quả phân lập tốt nhất.
Năm 2005, Odumeru cùng cộng sự đã công bố là sau 24h được cấy và ủ ở 35oC trong môi trường BBL HROMagar Listeria, vi khuẩn L. monocytogenes phát triển thành những khuẩn lạc tròn riêng biệt và có màu xanh lơ (Hình 1. monocytogenes sau 24h nuôi cấy ở 35 oC trên môi trường BBL CHROMagar Listeria Phương pháp nuôi cấy vi sinh mất khá nhiều thời gian (khoảng 5 ngày) [29] và cần các môi trường tăng sinh và phân lập chọn lọc cho từng loại vi khuẩn nên không phù hợp với nhu cầu phát hiện nhanh vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm cho người bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời.