Tổng quan nghiên cứu

Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) là một loại dược liệu truyền thống được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền Việt Nam và nhiều quốc gia châu Á. Theo ước tính, hương nhu tía chứa nhiều thành phần hóa học có hoạt tính sinh học như flavonoid, tinh dầu, triterpenoid, trong đó flavonoid chiếm tỷ lệ đáng kể với các hợp chất nổi bật là Luteolin và Apigenin. Các hợp chất này được biết đến với tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, hỗ trợ điều trị tiểu đường, ung thư và cải thiện trí nhớ. Tuy nhiên, hiện nay, tiêu chuẩn đánh giá chất lượng dược liệu hương nhu tía tại Việt Nam theo Dược điển Việt Nam V vẫn chưa bao gồm chỉ tiêu định lượng các hoạt chất này, đặc biệt là định lượng đồng thời Luteolin và Apigenin.

Mục tiêu nghiên cứu là xây dựng phương pháp định lượng đồng thời hai flavonoid Luteolin và Apigenin trong dược liệu hương nhu tía bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp detector UV (HPLC-UV). Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu hương nhu tía thu hái tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội – Viện Dược liệu trong năm 2019. Việc phát triển phương pháp này không chỉ góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng dược liệu mà còn hỗ trợ kiểm soát chất lượng nguyên liệu trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng từ hương nhu tía.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình phân tích hóa học hiện đại, trong đó sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp chủ đạo. HPLC cho phép tách và định lượng chính xác các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp như dược liệu nhờ vào sự khác biệt về tính chất hóa lý của các thành phần. Detector UV-Vis được sử dụng để phát hiện các flavonoid dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng đặc trưng (Luteolin tại 350 nm, Apigenin tại 340 nm).

Ba khái niệm chính trong nghiên cứu gồm:

  • Flavonoid: nhóm hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt là Luteolin và Apigenin với cấu trúc phân tử đặc trưng và khả năng hấp thụ UV.
  • Phương pháp chiết hồi lưu: kỹ thuật chiết xuất các hợp chất từ mẫu dược liệu bằng dung môi EtOH/nước 70:30 (v/v) ở nhiệt độ cao nhằm tối ưu hiệu suất chiết.
  • Đánh giá phương pháp phân tích: bao gồm độ chọn lọc, độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại và độ thu hồi nhằm đảm bảo tính chính xác và tin cậy của phương pháp.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu hương nhu tía được thu hái từ nhiều vùng khác nhau tại Việt Nam, được trồng và bảo quản tại Viện Dược liệu. Tổng cộng có khoảng 8 mẫu với độ ẩm dao động từ 9,93% đến 11,89%. Mẫu được xử lý bằng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi EtOH/nước 70:30 (v/v) trong 2 lần chiết, lần 1 trong 90 phút và lần 2 trong 60 phút ở nhiệt độ 80℃.

Phân tích được thực hiện trên hệ thống HPLC Shimadzu với cột pha đảo Cosmosil C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), pha động gồm MeOH và dung dịch H3PO4 0,43% theo tỷ lệ 55:45 (v/v), detector UV đặt ở bước sóng 347 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µL, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 25℃. Phương pháp được đánh giá qua các chỉ tiêu: độ chọn lọc, độ tuyến tính (R2 > 0,999), LOD, LOQ, độ lặp lại (%RSDr < 2%), độ thu hồi (90-107%) và độ không đảm bảo đo.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2019 với các bước khảo sát điều kiện sắc ký, tối ưu quy trình chiết mẫu, xây dựng đường chuẩn và phân tích mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại: Luteolin và Apigenin có phổ UV-Vis với đỉnh hấp thụ cực đại gần nhau, lần lượt tại 350 nm và 340 nm. Bước sóng 347 nm được chọn để định lượng đồng thời hai hợp chất, đảm bảo tín hiệu mạnh và ổn định.

  2. Tối ưu điều kiện sắc ký: Hệ pha động MeOH-H3PO4 0,43% (55:45, v/v) cho kết quả tách tốt nhất với độ phân giải Rs ≥ 1,5 và hệ số đối xứng As trong khoảng 0,8-1,5. Thể tích tiêm mẫu 20 µL được chọn để tránh hiện tượng doãng chân pic, đảm bảo độ chính xác.

  3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: Đường chuẩn của Luteolin và Apigenin có hệ số tương quan R2 = 0,9998, cho thấy mối quan hệ tuyến tính rất cao trong khoảng nồng độ 5-250 µg/mL. Giá trị Pvalue > 0,05 chứng tỏ không có sai số hệ thống.

  4. Tối ưu quy trình chiết mẫu: Hỗn hợp dung môi EtOH/nước 70:30 (v/v) được lựa chọn do hiệu suất chiết cao tương đương MeOH 100% nhưng thân thiện môi trường hơn. Phương pháp chiết hồi lưu 2 lần (90 phút + 60 phút) ở 80℃ cho hàm lượng Luteolin và Apigenin cao nhất, vượt trội so với chiết siêu âm.

  5. Đánh giá phương pháp:

    • Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) đạt mức thấp, phù hợp với yêu cầu phân tích dược liệu.
    • Độ lặp lại trong ngày và khác ngày có %RSDr và %RSDR đều dưới 2%, đảm bảo tính ổn định.
    • Độ thu hồi nằm trong khoảng 90-107%, phù hợp tiêu chuẩn AOAC.
    • Độ không đảm bảo đo được ước lượng dựa trên độ chụm và độ đúng, đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp HPLC-UV với điều kiện sắc ký và quy trình chiết mẫu được tối ưu có khả năng định lượng đồng thời Luteolin và Apigenin trong hương nhu tía với độ chính xác và độ nhạy cao. Việc lựa chọn hỗn hợp EtOH/nước 70:30 làm dung môi chiết vừa đảm bảo hiệu suất chiết tối ưu vừa giảm thiểu độc hại và thân thiện với môi trường, phù hợp với xu hướng phát triển bền vững trong phân tích dược liệu.

So sánh với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, chi phí thấp hơn so với các kỹ thuật sắc ký hiện đại như HPLC-MS/MS hay HPLC-DAD, đồng thời vẫn đảm bảo độ tin cậy và khả năng ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm và sản xuất. Kết quả phân tích mẫu thực tế từ nhiều vùng trồng khác nhau cũng cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho việc kiểm soát chất lượng dược liệu hương nhu tía tại Việt Nam.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ sắc ký HPLC thể hiện sự tách biệt rõ ràng giữa các pic Luteolin và Apigenin, bảng thống kê các chỉ tiêu đánh giá phương pháp và biểu đồ so sánh hàm lượng hoạt chất giữa các mẫu.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Áp dụng phương pháp HPLC-UV đã xây dựng để kiểm soát chất lượng dược liệu hương nhu tía tại các cơ sở sản xuất và kiểm nghiệm trong vòng 6 tháng tới nhằm chuẩn hóa quy trình đánh giá hoạt chất.

  2. Mở rộng nghiên cứu định lượng các flavonoid khác trong hương nhu tía như cirsilineol, orientin để hoàn thiện hồ sơ chất lượng dược liệu trong 1-2 năm tiếp theo, góp phần nâng cao giá trị dược liệu.

  3. Đào tạo kỹ thuật viên và cán bộ kiểm nghiệm về kỹ thuật HPLC-UV và quy trình xử lý mẫu chuẩn xác, đảm bảo tính đồng nhất và chính xác trong phân tích, thực hiện trong 3 tháng đầu năm.

  4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng mới cho dược liệu hương nhu tía bổ sung chỉ tiêu định lượng Luteolin và Apigenin dựa trên kết quả nghiên cứu, trình cơ quan quản lý dược trong vòng 1 năm để áp dụng rộng rãi.

  5. Khuyến khích các đơn vị trồng và chế biến dược liệu áp dụng quy trình thu hái, bảo quản và xử lý mẫu theo tiêu chuẩn nhằm duy trì hàm lượng hoạt chất ổn định, nâng cao chất lượng sản phẩm cuối cùng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Các nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Hóa phân tích, Dược liệu: Luận văn cung cấp phương pháp phân tích hiện đại, chi tiết về quy trình xử lý mẫu và đánh giá phương pháp, hỗ trợ nghiên cứu chuyên sâu về flavonoid trong dược liệu.

  2. Cơ sở kiểm nghiệm dược liệu và thực phẩm chức năng: Áp dụng phương pháp HPLC-UV để kiểm soát chất lượng nguyên liệu, đảm bảo hàm lượng hoạt chất theo tiêu chuẩn, nâng cao uy tín sản phẩm.

  3. Doanh nghiệp sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng từ dược liệu: Sử dụng kết quả nghiên cứu để xây dựng quy trình kiểm soát chất lượng nguyên liệu đầu vào, đảm bảo hiệu quả và an toàn sản phẩm.

  4. Cơ quan quản lý nhà nước về dược liệu và thực phẩm chức năng: Tham khảo để hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng dược liệu hương nhu tía, phục vụ công tác quản lý và cấp phép sản phẩm.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp HPLC-UV có ưu điểm gì so với các kỹ thuật sắc ký khác?
    HPLC-UV có chi phí thấp, dễ vận hành, phổ biến trong các phòng thí nghiệm, đồng thời cho độ nhạy và độ chính xác cao trong phân tích flavonoid như Luteolin và Apigenin.

  2. Tại sao chọn hỗn hợp EtOH/nước 70:30 làm dung môi chiết?
    Hỗn hợp này cho hiệu suất chiết cao tương đương MeOH 100% nhưng ít độc hại, thân thiện với môi trường và an toàn cho người thao tác.

  3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp là bao nhiêu?
    Phương pháp đạt LOD và LOQ thấp, đủ để phát hiện và định lượng chính xác Luteolin và Apigenin trong mẫu dược liệu với nồng độ ppm, phù hợp yêu cầu kiểm nghiệm.

  4. Phương pháp có thể áp dụng cho các flavonoid khác không?
    Có thể, với điều kiện tối ưu hóa sắc ký phù hợp, phương pháp HPLC-UV có thể mở rộng để phân tích các flavonoid khác trong dược liệu.

  5. Làm thế nào để đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp?
    Thông qua đánh giá độ lặp lại trong ngày và khác ngày, độ thu hồi, và ước lượng độ không đảm bảo đo, phương pháp được chứng minh có độ chính xác cao với %RSDr dưới 2%.

Kết luận

  • Đã xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời Luteolin và Apigenin trong dược liệu hương nhu tía bằng HPLC-UV với độ chính xác và độ nhạy cao.
  • Phương pháp sử dụng cột Cosmosil C18, pha động MeOH-H3PO4 0,43% (55:45), bước sóng 347 nm, thể tích tiêm 20 µL, tốc độ dòng 0,8 ml/phút.
  • Quy trình chiết hồi lưu 2 lần với dung môi EtOH/nước 70:30 (v/v) ở 80℃ tối ưu hiệu suất chiết.
  • Phương pháp được đánh giá đầy đủ về độ chọn lọc, tuyến tính, LOD, LOQ, độ lặp lại và độ thu hồi, đáp ứng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu.
  • Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học để nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng dược liệu hương nhu tía và hỗ trợ kiểm soát chất lượng trong sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng.

Hành động tiếp theo: Áp dụng phương pháp vào kiểm nghiệm thực tế, mở rộng nghiên cứu các flavonoid khác và đề xuất tiêu chuẩn mới cho dược liệu hương nhu tía. Các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp được khuyến khích tiếp cận và ứng dụng kết quả này để nâng cao chất lượng sản phẩm.