MỞ ĐẦU 1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Việc sử dụng các loại thực vật, động vật làm thuốc chữa bệnh đã được con người ứng dụng và phát triển từ rất sớm thông qua các dạng thức ăn, nước uống nhằm cung cấp các chất cần thiết để điều trị bệnh. Dù thông qua các biện pháp quan sát để có những cây thuốc điều trị nhiều loại bệnh khác nhau nhưng từ thời xa xưa, thông qua quá trình phát triển tự nhiên con người đã tích lũy được kiến thức cho sự tồn tại bằng việc sử dụng các loại cây cỏ sẵn có của tự nhiên để làm thức ăn, đồ uống. Đặc biệt, ở thời kỳ y học chưa phát triển, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh.
Trải qua quá trình thử nghiệm và sử dụng hàng ngàn năm các cây thuốc được phát hiện ngày càng nhiều hơn, các kinh nghiệm dùng cây thuốc chữa bệnh cũng đã được tích lũy dần trong dân gian, được lưu truyền dưới nhiều hình thức khác nhau như kinh nghiệm, truyền miệng, sách[1-5].từ đời này sang đời khác cho đến ngày nay. Ngày nay dù khoa học rất phát triển, việc chăm sóc sức khỏe, phòng và điều trị bệnh đã ngày càng có nhiều sản phẩm tổng hợp. Tuy nhiên hiện nay xu hướng việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được các nhà khoa học và người sử dụng quan tâm nhiều hơn. Không chỉ Việt Nam mà trên thế giới, với xu hướng việc sử dụng các thuốc từ dược liệu của người dân ngày càng gia tăng bởi vì ít gây tác dụng phụ và phù hợp với sinh lý của cơ thể.
Enzyme Xanthine oxidase (XO) là một enzyme chính xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và tiếp tục chuyển hóa xanthine thành axit uric[6]. Axit uric được giải phóng trong quá trình phản ứng của enzyme có thể gây ra những tác động bất lợi cho cơ thể[7,8]. Bệnh gout là một tình trạng phổ biến xảy ra do lượng axit uric tăng cao trong máu thông qua cơ chế này các tinh thể acid uric được hình thành đặc biệt là ở các khớp[9,10]. Bên cạnh việc gây ra bệnh gout, tăng acid uric còn là nguyên nhân gây ra các bệnh chuyển hóa khác như béo phì, cao huyết áp, tiểu đường và tim mạch[11].
Việc nghiên cứu và tìm ra các hợp chất mới có khả năng ức chế enzyme Xanthine oxidase có nguồn gốc thiên nhiên thay cho các hoạt chất tổng hợp hóa học 1 dùng làm thuốc điều trị các bệnh liên quan đến việc tăng acid uric trong máu hiện nay thường có tác dụng phụ là cần thiết. Đặc biệt trong giai đoạn các bệnh chuyển hóa có nguyên nhân từ việc tăng acid uric ngày càng tăng như hiện nay[13-14]. Trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới được thực hiện nhằm tìm kiếm các loại thảo dược, các hợp chất có trong tự nhiên có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase[12-15]. Việt Nam là đất nước có truyền thống sử dụng cây cỏ làm thuốc và có nguồn thảo dược phong phú với nhiều loại thảo dược tiềm năng đã được sử dụng trong chữa bệnh[1,5,16].
Nhiều cây thuốc được sử dụng đã cho hiệu quả rõ ràng trong đó có cây ngải cứu. Tuy nhiên các nghiên cứu vẫn còn nhiều điểm mới trong cây ngải cứu cần được đánh giá và nghiên cứu sâu hơn. Theo được điển Việt Nam ngải cứu có tác dụng chữa kinh nguyệt không đều, khí hư, động thai, băng huyết, đau bụng, đau dây thần kinh, thấp khớp, dưỡng da, trị mụn, giảm mỡ, dưỡng da,[17]… Hay trong các nghiên cứu gần đây đã nhấn mạnh một số tác động của cây ngải cứu đến động vật như khả năng chống co thắt, giảm đau, estrogen, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, hạ lipid máu, bảo vệ gan và gây độc tế bào của nó[18-21]. Tuy nhiên việc minh chứng các hoạt tính sinh học từ các thành phần hóa học cũng như những công dụng khác của cây ngải cứu vẫn còn nhiều điểm mới cần được đánh giá.
Từ đó đề tài “Nghiên cứu và bước đầu đánh giá hoạt tính ức chế xanthine oxidase từ cây ngải cứu” được tôi lựa chọn thực hiện cho nghiên cứu của mình dưới sự hướng dẫn của thầy Lê Tiến Dũng và thầy Tống Thanh Danh nhằm tìm hiểu thêm về hoạt chất tiềm năng và khả năng ức chế xanthine oxidase từ cây ngải cứu với các phân đoạn cao khác nhau. chất Bên cạnh việc sử dụng cây ngải cứu cho nhiều ứng dụng trong cuộc sống thì việc minh chứng các hoạt tính sinh học từ các thành phần hóa học cũng như những công dụng khác của cây ngải cứu vẫn còn nhiều điểm mới chưa được khám phá hết. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU a) Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu khảo sát qui trình chiết cao ethanol của ngải cứu, bước đầu đánh giá hoạt tính ức chế xanthine oxidase và xác định thành phần hóa học cao tiềm năng. 2 b) Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đánh gíá các yếu tố tác động đến qui trình chiết cao từ cây ngải cứu.
- Điều chế cao tổng từ cây ngải cứu ở điều kiện thích hợp tốt nhất. - Điều chế cao phân đoạn của ngải cứu từ cao tổng với các dung môi n-hexan, Ethyl acetate và Methanol. - Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn từ cây ngải cứu. Xác định cao tiềm năng nhằm phân lập và xác định chất tiềm năng.
- Tinh sạch và xác định cấu trúc chất hữu cơ trong cao tiềm năng. Phương pháp nghiên cứu: - Lựa chọn phương pháp chiết cao. - Tối ưu hóa quy trình chiết cao thông qua các yếu tố tác động chính gồm: Nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ nguyên liệu với dung môi với hàm mục tiêu là hàm lượng sesquiterpen lactone bằng FTIR. - Phân tách phân đoạn cao với các dung môi khác nhau theo thứ tự n-Hexan, Ethyl acetate và methanol từ cao chiết ethanol.
- Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme XO xác định cao tiềm năng. - Phân lập và xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ từ cao tiềm năng. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của đề tài Đánh giá khả năng ức chế enzyme XO từ cao chiết cây ngãi cứu, xác định phân đoạn chiết cao tiềm năng và phân lập xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ trong cao tiềm năng hướng đến ứng dụng hiệu quả cao chiết cây ngải cứu trong điều trị một số bệnh liên quan đến việc tăng hàm lượng acid uric trong máu và tại các khớp xương. 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.
Tổng quan về cây ngải cứu: Ngải cứu thuộc chi Artemisia, thuộc họ thực vật Compositae (Asteraceae) khoảng gồm 300 loài cây cỏ, bụi, hằng niên, lưỡng niên hay lưu niên, mọc ở một số vùng của khu Bắc Bán Cầu, tại Nam Mỹ chỉ có vài loài, còn ở Nam Phi chỉ có một loài duy nhất. Trung Quốc có hai tên gọi là Quinnhao và Quinggao, trên thế giới có rất nhiều loài cây, gồm từ nhiều loài cây bụi đến những cây cao khoảng 4m[22,24]. Thành phần hóa học của chi này rất đa dạng và phong phú. Ở Việt Nam có 15 loài thuộc chi Artemisia, trong đó có 4 loài rất giống nhau về ngoại hình, cụ thể: [1,2]: Artemisia apiaceae Artemisia campestrist (thanh cao biển) Artemisia capillaris Artemisia annua.
Danh pháp cây ngải cứu[1-5]: Tên khoa học: Artemisia Vulgaris L. Tên thường gọi: Ngải cứu, ngải diệp (miền Nam), nhả ngải (tiếng Tày), quá sú (tiếng H’mông), cỏ linh li (tiếng Thái),… Tên khác: Motherwort, Maidenwort, Mugwort (Anh), Cordon de S. Đặc điểm: Ngải cứu thuộc họ thân thảo, là loại cây sống lâu năm và thường cao từ 0,4 - 1m. Ngọn thân dài không quá 30cm, có khía dọc, màu vàng nâu hay xám, có lông tơ.
Lá mọc so le, có cuốn hoặc không, thường nhăn nheo, cuộn vào nhau. Chúng có nhiều 4 hình dạng như hình mác, lá phía dưới xẻ một hoặc hai lần có hình lông chim. Mặt trên lá màu xám đến màu xanh đen, nhẵn và có rất ít lông tơ. Vi phẩu các bộ phận cây ngaỉ cứu được mô tả cụ thể [17]: Thân cây ngải cứu thường thẳng đứng và có một phần đỏ tím, thân cành mọc sum suê, có rãnh và lông nhỏ.
Các lá dài 5-20 cm, màu xanh lá cây thẫm, hình mũi giáo, xẻ thùy lông chim, với các sợi lông trắng dày đặc hai mặt trên, dưới[1-5,16,17]. Hoa mọc thành chùm kép gồm nhiều cụm hoa đầu; mang hoa cái hoặc hoa lưỡng tính, thường là hoa cái; hoa cái tràng hình ống, cụt hoặc có răng cưa ở đầu, hoa lưỡng tính trên cùng một cụm hoặc ở nhiều cụm khác nhau, thường thì hoa cái chiếm nhiều hơn, tràng hoa cái có cái ống mảnh, cụt hoặc có răng ở hai đầu, tràng hoa lưỡng tính có dạng hình hình phễu, có 5 thùy uốn cong ra phía ngoài. Những bông hoa nhỏ (dài ~ 5 mm) đối xứng với nhiều cánh hoa màu vàng hoặc màu hồng. Cụm hoa hẹp và rất nhiều, sinh thành chùm.
Hoa trổ từ tháng 7-tháng 10. Ngải cứu là cây ưa ẩm, dễ trồng bằng cách giâm cành những đoạn gốc thân già[1-5,16,17]. Quả bé thuôn nhỏ. Mùa hoa quả vào tháng 10-12[16,17].
Lá ngải thường có mùi thơm nồng và có vị hơi đắng hoặc rất đắng tùy theo mùa. Tuy nhiên thông thường chúng được thu hoạch giai đoạn từ thâng 5 đến tháng 6 tại Việt Nam. Hình cây ngải cứu khi chưa hình thành hoa[22. Cây ngãi cứu[22], (A) Hình cây ngải cứu, (B) Hình hoa cây ngải cứ, (C) hình lá cây ngải cứu, (D) chi tiết hình hoa ngải cứu[24].
Đặc tính phân bố và thu hái chế biến: Ngải cứu phân bố rộng khắp thế giới, phát triển nhất ở vùng nhiệt đới Nam Á, các nước Đông Nam Á, Ấn Độ, Pakistan, Srilanca, Banglades và Trung Quốc[23,24]. Ở nước ta, ngải cứu được trồng từ lâu đời trên khắp các vùng miền từ Nam tới Bắc và mọc hoang nhiều nơi chẳng hạn như vườn cây, lề đường. Ngải cứu có ưu điểm thích hợp với các vùng đất nghèo dinh dưỡng như các khu vực đồng cỏ và hoang hóa[1]. Hiện nay phần lớn cây ngải cứu được trồng theo xung quanh nhà và vườn của người dân với quy mô nhỏ, chưa thấy trồng với quy mô lớn, tập trung phục vụ cho sản xuất công nghiệp.
Thu hái lá vào hai mùa xuân, hạ (thường hái vào dịp Tết Đoan ngọ, mồng 5 tháng 5 âm lịch. Khi hoa chưa nở, lá đang tươi tốt, cắt lấy lá đem phơi khô trong râm thì được ngải diệp [1-5]. Loại lá ngải cứu khô, mặt dưới màu vàng trắng tro, lá có nhiều lông nhung, mùi thơm đậm, không lấy cành già và loại bỏ tạp phẩm, ngải cứu hong khô vừa phải đảm bảo không nát vụn không bị ẩm mốc. Lá ngải cứu phải là 6 toàn lá hoặc chỉ lẫn ít cành non, nhỏ, đường kính dưới 2mm[1,5,17] .