Tổng quan luận án
Tính cấp thiết của đề tài và khoảng trống nghiên cứu
Cây thanh long (Hylocereus undatus) là cây trồng có giá trị kinh tế cao, được canh tác tại nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới như Bahamas, Bermuda, Hoa Kỳ, Australia, Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Đài Loan, Philippines, Malaysia, Indonesia, Cambodia, Israel và Việt Nam. Tại Việt Nam, diện tích trồng thanh long đã tăng nhanh do giá cả thị trường thuận lợi, thị trường tiêu thụ nội địa và xuất khẩu được mở rộng. Cây thanh long phân bố tập trung tại ba tỉnh Tiền Giang, Long An, Bình Thuận và đã lan rộng ra 60/63 tỉnh thành trên cả nước với tổng diện tích ước tính khoảng 54 nghìn ha, sản lượng đạt 1,1 triệu tấn. Năm 2016, kim ngạch xuất khẩu thanh long tươi của Việt Nam đạt khoảng 895,7 triệu USD (tăng 70% so với năm 2015), chiếm 25% tổng giá trị trái cây xuất khẩu các dạng và tương đương 61,4% tổng giá trị trái cây tươi xuất khẩu.
Trong quá trình canh tác, bệnh thán thư do nấm chi Colletotrichum là một trong những dịch hại nghiêm trọng nhất gây tổn thất trên cành, hoa và trái thanh long, làm suy giảm năng suất và chất lượng thương phẩm. Khảo sát nhanh tại các vùng trồng tập trung ở Bình Thuận, Tiền Giang và Long An cho thấy đa số các vườn đều có sự hiện diện của bệnh thán thư với tỷ lệ nhiễm dao động từ 30% đến 60%. Nhằm quản lý bệnh, tập quán canh tác của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học. Tuy nhiên, biện pháp này bộc lộ nhiều hạn chế do đặc tính gây hại của mầm bệnh, nguy cơ phát sinh tính kháng thuốc và khả năng tồn dư hóa chất trên nông sản, cản trở tiêu chuẩn xuất khẩu. Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu một cách hệ thống nhằm xác định chính xác tác nhân gây bệnh, tìm hiểu đặc điểm sinh học, quy luật phát sinh, khả năng lưu tồn trong tự nhiên, đồng thời thử nghiệm các giải pháp phòng trừ thân thiện với môi trường (dịch trích thảo mộc, vi sinh vật đối kháng, nông dược sinh học kết hợp hóa học) là vấn đề cấp thiết cả về mặt khoa học lẫn thực tiễn sản xuất.
Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát của đề tài là xác định tác nhân, khả năng gây hại, điều kiện phát sinh phát triển của bệnh và nghiên cứu một số biện pháp phòng trừ có hiệu quả bệnh thán thư (Colletotrichum spp.) nhằm cải thiện năng suất thanh long tại Tiền Giang, Long An và Bình Thuận.
Các mục tiêu cụ thể được xác định gồm:
- Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư tại các tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận.
- Đánh giá điều kiện phát sinh phát triển của bệnh, khả năng xâm nhiễm và gây hại của nấm (Colletotrichum spp.) trên các giống thanh long đang trồng phổ biến hiện nay.
- Tuyển chọn dòng vi sinh vật, dịch trích thảo mộc, nông dược có hiệu quả và bước đầu xây dựng quy trình quản lý tổng hợp bệnh.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum truncatum gây hại trên cây thanh long (Hylocereus undatus).
- Phạm vi nghiên cứu:
- Về nội dung: Thu thập mẫu bệnh và định danh các loài thuộc chi Colletotrichum bằng hình thái học kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử dựa trên trình tự DNA vùng ITS-rDNA; nghiên cứu điều kiện phát sinh phát triển, nguồn lưu tồn của nấm trong môi trường tự nhiên (nước mưa, nước mương, tàn dư thực vật, đất); đánh giá hiệu lực phòng trừ của các loại nông dược hóa học, hoạt chất sinh học, dịch trích thảo mộc, xạ khuẩn và vi khuẩn đối kháng trong phòng thí nghiệm và điều kiện nhà lưới.
- Về không gian: Các vùng canh tác thanh long tập trung tại ba tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận; các thí nghiệm chuyên sâu được thực hiện tại Viện Cây ăn quả miền Nam và Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.
- Về thời gian: Các nội dung nghiên cứu thực nghiệm được triển khai từ năm 2015 đến năm 2019.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước đây
Luận án đã tổng quan các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến phân loại học thực vật của cây thanh long, đặc điểm phát sinh của chi nấm Colletotrichum và các biện pháp quản lý bệnh thán thư:
- Nguồn gốc và phân loại cây thanh long: Theo Le Bellec và ctv. (2006), Rojas-Sandoval & Praciak (2020), cây thanh long thuộc chi Hylocereus, họ Xương rồng (Cactaceae), có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ La-tinh. Nghiên cứu di truyền học của Tel-Zur và ctv. (2004) chỉ ra rằng Hylocereus megalanthus là loài tứ bội, có thể là con lai tự nhiên giữa chi Hylocereus và Selenicereus.
- Tác nhân gây bệnh thán thư trên cây trồng: Chi nấm Colletotrichum được xếp vào nhóm mười tác nhân nấm gây bệnh nghiêm trọng nhất trên thế giới (Dean và ctv., 2012; Hyde và ctv., 2010). Các nghiên cứu tại Việt Nam đã ghi nhận sự gây hại của Colletotrichum spp. trên nhiều loại cây trồng: trên ớt có C. gloeosporioides, C. capsici, C. acutatum, C. dematium, C. nigrum (Bá & Cúc, 1999; Oanh, 2001; Mân & Tề, 1998; Anh, 1999); trên xoài và sầu riêng ghi nhận C. gloeosporioides và C. acutatum với tỷ lệ gây hại lên đến 60% (Trị, 2001; Thủy & Kim, 2005, 2008; Ann và ctv., 1994); trên cà phê có C. gloeosporioides và C. kahawae (Diệp, 2009).
- Hệ thống phân loại và hình thái chi Colletotrichum: Sutton (1980) mô tả 11 loài; Baxter và ctv. (1985) giới thiệu 21 loài; Fagbola & Abang (2003) phân loại 39 loài dựa trên hình thái bào tử đính, giác bám, đĩa cành và đặc điểm khuẩn lạc. Nhiều tác giả (Von, 1957; Smith & Black, 1990; Than và ctv., 2007; Masoodi và ctv., 2013; Yoshida, 2002; CABI, 2003) đã chuẩn hóa các chỉ tiêu đo đạc kích thước vi học của bào tử và cấu trúc sinh sản vô tính.
- Sinh học phân tử trong định danh nấm: Sutton (1992) nhận định việc định danh thuần túy dựa vào hình thái có thể thiếu chính xác. Các nghiên cứu phân tử ứng dụng vùng gen ITS-rDNA (ITS1-5.8S-ITS2) và $\beta$-tubulin đã giúp phân biệt rõ ràng các loài trong phức hợp Colletotrichum (White và ctv., 1990; Bruns và ctv., 1991; Nilsson và ctv., 2008; Schoch và ctv., 2012; Mahmodi và ctv., 2014; Zakari và ctv., 2015; Kong và ctv., 2004).
- Nghiên cứu bệnh thán thư trên thanh long: Tại Trung Quốc, Guo và ctv. (2014) xác định Colletotrichum truncatum gây bệnh thán thư thanh long tại Vân Nam. Tại Thái Lan, Athipunyakom & Likhitekaraj (2010), Athipunyakom và ctv. (2014) ghi nhận C. gloeosporioides chiếm ưu thế trên cành và C. truncatum chiếm ưu thế trên trái. Tại Malaysia, Masratul và ctv. (2008), Masyahit và ctv. (2009), Vijaya và ctv. (2015) xác định cả C. truncatum và C. gloeosporioides gây thối rữa cành và quả trong điều kiện nhiệt độ 26,5 - 28,1°C và độ ẩm 77,5 - 86,6%.
- Biện pháp phòng trừ sinh học và canh tác: Các công trình về vi sinh vật đối kháng bao gồm nấm Trichoderma spp., T. viride, T. harzianum (Pandey và ctv., 2011, 2012; Hùng và ctv., 2014); xạ khuẩn Actinomycetes CT10, VL17, HG03, 21RM, 4RM (Sử & Tường, 2016; Yến và ctv., 2016); nấm men Meyerozyma caribbica, Cryptococcus laurentii (Bautista-Rosales và ctv., 2013, 2014); vi khuẩn Bacillus spp., Bacillus subtilis (Trang và ctv., 2020; Myoung và ctv., 2008).
Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết
Mặc dù bệnh thán thư đã được nghiên cứu trên nhiều cây trồng khác nhau, các dẫn liệu khoa học có hệ thống về thành phần loài Colletotrichum trên cây thanh long tại vùng sản xuất trọng điểm phía Nam Việt Nam (Tiền Giang, Long An, Bình Thuận) còn phân tán. Sự kết hợp giữa hình thái học và giải trình tự gen ITS-rDNA để định danh loài, việc xác định các nguồn lưu tồn mầm bệnh trong điều kiện tự nhiên (nước mưa, nước mương, tàn dư, các tầng đất), cũng như đánh giá so sánh hiệu lực của các biện pháp sinh học, dịch trích thảo mộc và thuốc hóa học nhằm hướng tới quy trình phòng trừ tổng hợp an toàn vẫn chưa được thực hiện đầy đủ.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Cơ sở lý thuyết và khung phân tích
- Cơ chế bệnh sinh và vòng đời của nấm: Chi Colletotrichum thuộc nhóm nấm bán ký sinh bắt buộc (hemibiotroph), vòng đời trải qua hai giai đoạn kế tiếp: giai đoạn ký sinh (biotrophic) ban đầu khi sợi nấm xâm nhiễm sống dưới lớp cutin/biểu bì và giai đoạn hoại sinh (necrotrophic) khi nấm tiết các enzyme phân giải vách tế bào (như pectin lyase, cellulase, protease) làm chết mô ký chủ (Mendgen & Hahn, 2002; Prusky & Plumbley, 1992; Agrios, 2005).
- Cơ chế xâm nhiễm: Quá trình xâm nhiễm diễn ra qua 7 bước: tiết chất ngoại bào ECM (Extra Cellular Matrix), phân chia nhân, tạo vách ngăn, nhú mầm, phồng đỉnh ống mầm, tạo vách thứ cấp và hình thành đĩa áp (appressorium) có sắc tố melanin để tạo áp lực cơ học chọc thủng biểu bì (Aist & Israel, 1996; Jeffries và ctv., 1990; Wharton & Diéguez-Uribeondo, 2004).
- Cơ sở phát sinh loài phân tử: Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) trên cistron rDNA gồm ITS1, gen 5.8S và ITS2 có tốc độ biến đổi phù hợp cho việc phân loại ở cấp độ loài và phân tích phả hệ tiến hóa nấm (White và ctv., 1990).
Phương pháp nghiên cứu thực tế
Luận án áp dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp giữa điều tra ngoài đồng ruộng, phân tích trong phòng thí nghiệm và thử nghiệm điều khiển trong nhà lưới:
1. Phương pháp phân lập, thuần khiết và định danh hình thái
- Tách thuần các chủng nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy đơn bào tử trên môi trường PDA (Burgess và ctv., 2005) và nuôi cấy trên lame kính (Waller và ctv., 1992), ủ ở 27 ± 2°C dưới chu kỳ 12 giờ sáng/12 giờ tối.
- Ghi nhận triệu chứng vết bệnh ngoài đồng; theo dõi màu sắc, dạng tản nấm, cơ quan sinh bào tử, cành bào đài, hình dạng và kích thước bào tử đính (đo 2 đường chéo vuông góc) dưới kính hiển vi quang học Olympus BX51N-33-PH ở độ phóng đại 1000 lần. Khóa phân loại tham chiếu: Sutton (1980), Barnett & Hunter (1998), Swart (1999), CABI (2003).
- Tính tần suất xuất hiện bệnh theo công thức:
$$\text{Tần suất xuất hiện (%)} = \frac{\text{Tổng số mẫu xuất hiện nấm bệnh}}{\text{Tổng số mẫu cấy}} \times 100$$
2. Kỹ thuật sinh học phân tử định danh loài
- Thời gian và địa điểm: Tháng 08/2015 - tháng 12/2017 tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật - Viện Cây ăn quả miền Nam và Viện Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ.
- Tách chiết DNA: Sử dụng DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Đức) kết hợp phương pháp Phenol - Chloroform - Isoamyl (PCI tỷ lệ 25:24:1), kết tủa bằng Isopropanol và rửa bằng Ethanol 70%. Đo nồng độ và độ tinh sạch DNA bằng máy quang phổ (tỷ lệ $OD_{260}/OD_{280}$) và máy Nanodrop; điện di kiểm tra trên gel agarose 2% trong đệm 1x TAE ở hiệu điện thế 100 V trong 30 phút.
- Phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA: Sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4. Thể tích phản ứng 25 $\mu$L chứa đệm PCR 1X, 1,5 mM $\text{MgCl}_2$, 400 pM dNTPs, 200 pM mỗi mồi, DNA khuôn và Taq DNA polymerase. Chu trình nhiệt: biến tính ban đầu 94°C trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm 94°C (1 phút), 55°C (1,5 phút), 72°C (1 phút); kéo dài lần cuối 72°C trong 5 phút.
- Tinh sạch và giải trình tự: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Đức) và giải trình tự tại Macrogen Inc. (Hàn Quốc).
- Phân tích dữ liệu phân tử: So sánh độ tương đồng chuỗi qua công cụ BLAST (GenBank NCBI); căn chỉnh đa chuỗi bằng ClustalW; dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining (NJ) trên phần mềm MEGA 5 (Tamura và ctv., 2011) với phân tích lặp lại bootstrap 1000 lần.
3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo và kiểm tra quy trình Koch
- Lây nhiễm trên cành: Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) 6 nghiệm thức $\times$ 5 lần lặp lại (2 cành/lần) gồm: C. truncatum (+/- tạo vết thương), C. gloeosporioides (+/- tạo vết thương), nước cất (+/- tạo vết thương). Phun huyền phù nồng độ $10^5$ bào tử/mL lên cành bánh tẻ (15 - 20 cm) thanh long ruột đỏ trong nhà lưới (28 - 30°C, ẩm độ 80 - 85%). Đếm mật số bào tử bằng buồng đếm hồng cầu.
- Đánh giá độc lực 44 chủng phân lập: Thí nghiệm theo phương pháp Ratanacherdchai và ctv. (2010), bố trí CRD 45 nghiệm thức $\times$ 5 lần lặp lại, tạo 12 điểm vết thương/mặt cành, phun huyền phù $5 \times 10^6$ bào tử/mL trong hộp nhựa duy trì ẩm độ 82 - 85% ở 27 - 29°C.
- Đánh giá tính kháng của giống: Chủng 2 chủng đại diện TG26-CĐ (C. gloeosporioides) và TG52-CH (C. truncatum) trên 4 giống: thanh long trắng Chợ Gạo, thanh long trắng Bình Thuận, thanh long ruột đỏ Long Định 1 và thanh long tím hồng LĐ5.
- Chỉ tiêu theo dõi và thang phân cấp: Tỷ lệ bệnh (TLB %) và Chỉ số bệnh (CSB %) theo quy chuẩn QCVN 01-38:2010/BNNPTNT:
- Cấp 0: Không có vết bệnh.
- Cấp 1: $> 0%$ đến $\le 10%$ diện tích cành bị bệnh.
- Cấp 2: $> 10%$ đến $\le 20%$ diện tích cành bị bệnh.
- Cấp 3: $> 20%$ đến $\le 60%$ diện tích cành bị bệnh.
- Cấp 4: $> 60%$ đến $\le 80%$ diện tích cành bị bệnh.
- Cấp 5: $> 80%$ diện tích cành bị bệnh.
4. Phương pháp khảo sát nguồn lưu tồn và dịch tễ
- Nguồn lưu tồn: Thu mẫu tại 5 vườn/tỉnh ở 3 thời điểm mùa mưa năm 2018.
- Nước mưa: Thu qua bình nhựa gắn phễu dưới tán thanh long; pha loãng $10^{-2}$, trải đĩa PDA bổ sung chloramphenicol 50 mg/L, ủ 28°C; ghi nhận mật số CFU/mL sau 72 giờ (theo Amponsah và ctv.).
- Nước mương: Lấy nước tầng mặt (0 - 5 cm), thực hiện tương tự nước mưa.
- Tàn dư thực vật: Thu 50 g mô chết/cành cắt tỉa ngâm trong 450 mL nước cất, lắc 20 - 30 phút, pha loãng dung dịch, tính mật số CFU/g theo công thức:
$$\text{Mật số (CFU/g)} = \frac{A \times D}{V} \times 10$$
(A: số khuẩn lạc; D: hệ số pha loãng; V: thể tích huyền phù 0,1 mL; 10: hệ số quy đổi).
- Mẫu đất: Thu ở 5 độ sâu (2, 4, 6, 8, 10 cm), hong khô, pha loãng $10^{-2}$, tính mật số CFU/g đất theo Bills và ctv.
- Kiểm chứng khả năng gây bệnh của các nguồn lưu tồn: Chủng 8 chủng nấm đại diện (TL-C1, TL-D91, TL-M1, TL-D92, TL-C2, TL-X1, TL-M2, TL-T1) ở nồng độ $5 \times 10^8$ bào tử/mL lên cành tạo 12 điểm tổn thương.
- Diễn biến bệnh trong năm: Điều tra định kỳ 1 tháng/lần từ tháng 01 đến tháng 12/2018 tại 5 vườn ở Tiền Giang (xã Phú Kiết, xã Quơn Long) và 5 vườn ở Long An (xã Long Trì), theo dõi 4 trụ cố định/điểm trên 5 điểm chéo góc (200 trụ/vườn). Thu thập dữ liệu vũ lượng mưa (mm) và ẩm độ không khí (%) từ Trung tâm Khí tượng Thủy văn.
5. Phương pháp đánh giá hiệu lực nông dược, thảo mộc và vi sinh vật
- Thử nghiệm in vitro thuốc hóa học và sinh học: Phương pháp cấy khoanh nấm (đường kính 5 mm) lên môi trường PDA pha thuốc. Đánh giá hiệu lực ức chế tản nấm theo công thức Abbott (1925):
$$I (%) = \frac{C - T}{C} \times 100$$
(I: hiệu lực ức chế; C: đường kính tản nấm đối chứng; T: đường kính tản nấm nghiệm thức xử lý).
- Chiết xuất và thử nghiệm dịch trích thảo mộc: Sử dụng củ đậu (Pachyrhizus erosus), cây móng tay (Impatiens balsamina), xương rồng ông (Euphorbia antiquorum). Sấy khô 37°C, chiết bằng bộ chiết Soxhlet với dung môi methanol (250 mL/200 g mẫu) trong 10 - 11 giờ, cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không Buchi RV10 Basic V - IKA. Thử nghiệm in vitro theo phương pháp Poison Food Technique (Nene & Thapliyal, 1982) ở các nồng độ 2%, 3%, 4%.
- Thử nghiệm đối kháng in vitro của vi sinh vật: Đánh giá 15 dòng xạ khuẩn và 26 dòng vi khuẩn Bacillus spp. đối kháng với chủng TG26-CĐ và TG52-CH bằng phương pháp đặt khoanh giấy thấm chứa huyền phù vi sinh vật ($10^8$ CFU/mL) đối xứng qua khoanh nấm trên đĩa PDA. Đo bán kính vành khăn vòng vô khuẩn (BKVVK) ở 5, 7, 9 ngày theo thang Prapagdee và ctv. (2008): kháng mạnh ($\ge 20$ mm), kháng cao (10 - 19 mm), kháng trung bình (5 - 9 mm), không kháng ($< 5$ mm) và tính hiệu suất đối kháng theo Punngram và ctv.
- Thử nghiệm nhà lưới: Bố trí CRD 8 nghiệm thức $\times$ 5 lần lặp lại trên cây thanh long ruột đỏ lây bệnh nhân tạo. Đo đường kính vết bệnh trung bình qua 3 mặt cành theo công thức $D = \frac{d_1 + d_2 + d_3}{3}$ và tính chỉ số bệnh (CSB %).
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Giới thiệu
Chương này thiết lập bối cảnh kinh tế - kỹ thuật của ngành hàng thanh long Việt Nam, phân tích tình hình thiệt hại do bệnh thán thư tại ba vùng chuyên canh lớn (Tiền Giang, Long An, Bình Thuận), xác định mục tiêu tổng quát, các mục tiêu cụ thể, ý nghĩa khoa học, giá trị thực tiễn, đóng góp mới và phạm vi giới hạn của đề tài.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng kết toàn diện các kiến thức học thuật từ 88 trích dẫn khoa học trong và ngoài nước:
- Phân loại học cây thanh long: Chi Hylocereus, họ Cactaceae, phân bố thương mại tại nhiều nước nhiệt đới/cận nhiệt đới.
- Triệu chứng và thiệt hại của bệnh thán thư: Phân tích triệu chứng trên nhiều đối tượng cây trồng (ớt, xoài, sầu riêng, thanh long); mô tả vết bệnh hoại tử lõm hình elip màu vàng chuyển sang nâu, viền vàng, bề mặt có các vòng đồng tâm chứa hạch nấm và khối bào tử nhầy màu hồng da cam.
- Phân loại học và đặc điểm sinh học chi Colletotrichum: Hệ thống hóa đặc điểm hình thái học của 21 loài Colletotrichum phổ biến trên thế giới dựa trên mô tả của Sutton (1980) và các tác giả khác:
| STT |
Tên loài nấm |
Đặc điểm tản nấm |
Dạng và kích thước bào tử đính ($\mu$m) |
Dạng và kích thước giác bám ($\mu$m) |
| 1 |
C. acutatum |
Dày đặc, sợi khí sinh trắng chuyển hồng xám, khối bào tử hồng cam |
Hình thoi, thắt eo ở giữa, kích thước 8,5 - 16,5 $\times$ 2,5 - 4 |
Nâu nhạt đến sậm, dạng chùy không đều, kích thước 8,5 - 10 $\times$ 4,5 - 6 |
| 2 |
C. coccodes |
Chủ yếu là hạch nấm đen, ít sợi trắng, khối bào tử màu mật |
Hình thoi thẳng, kích thước 16 - 22 $\times$ 3 - 4 |
Hình chùy dài, khía tai bèo, kích thước 11 - 16,5 $\times$ 6 - 9,5 |
| 3 |
C. higginsianum |
Chưa khảo sát hạch nấm và đài |
Hình thoi thẳng, hơi cong, chứa giọt lớn, kích thước 16,5 - 19 $\times$ 4 |
Chưa xác định |
| 4 |
C. fuscum |
Đen, mọc dày đặc, sợi nâu sậm không đều |
Dạng thẳng hoặc hơi cong, cùn ở đầu |
Chưa xác định |
| 5 |
C. lindemuthianum |
Phát triển chậm, nâu sậm đến đen, khối bào tử màu mật/vàng nhạt |
Hình trụ thẳng, cùn ở đầu, kích thước 9,5 - 11,5 $\times$ 3,5 - 4,5 |
Nâu nhạt đến sậm, hình chùy tròn đều, kích thước 6 $\times$ 6 |
| 6 |
C. crassipes |
Sợi nấm màu sô-cô-la sậm, khối bào tử màu mật |
Thẳng, hình trụ, cùn ở đầu, kích thước 1,5 - 4,5 |
Đa dạng, nâu nhạt đến sậm, khía tai bèo, kích thước 10 - 14 $\times$ 7 - 9,5 |
| 7 |
C. musae |
Dày đặc, trắng chuyển xám, khối bào tử đỏ gạch đến nâu vàng |
Thẳng, hình trụ, cùn ở đầu, kích thước 12 - 17 $\times$ 4,5 - 5,5 |
Nâu nhạt đến sậm, thùy rộng/sâu, kích thước 9 - 13 $\times$ 9 - 11,5 |
| 8 |
C. orbiculare |
Sợi nấm dày trắng xám, mặt dưới nâu sậm, khối bào tử hồng |
Thẳng, hình trụ, cùn ở đầu, kích thước 14 - 15 $\times$ 4,5 - 6 |
Nâu nhạt, hình chùy dài không đều, kích thước 9 - 11,5 |
| 9 |
C. gloeosporioides |
Đa dạng màu trắng xám đến xám đen |
Bào tử thẳng cùn ở đầu, kích thước 9 - 24 $\times$ 3 - 4,5 |
Hình chùy không đều, phức tạp, kích thước 6 - 20 $\times$ 4 - 12 |
| 10 |
C. caudatum |
Dày đặc, nâu nhạt, mặt dưới xanh nhạt |
Hình lưỡi liềm, hình thoi đỉnh kéo dài, kích thước 18,5 - 24 $\times$ 2,5 - 3,5 |
Hình chùy hoặc tròn, kích thước 10 - 14 $\times$ 9 - 10 |
| 11 |
C. falcatum |
Trắng xám, sợi rải rác, khối bào tử hồng |
Hình lưỡi liềm hoặc thoi đầu nhọn, kích thước 15,5 - 26,5 $\times$ 4 - 5 |
Hình chùy hoặc tròn, kích thước 12,5 - 14,5 $\times$ 9,5 - 12 |
| 12 |
C. sublineolum |
Dày, đỉnh nhọn xám, khối bào tử xanh xám |
Hình liềm/thoi, đầu nhọn, kích thước 18,5 - 27,5 $\times$ 3 - 4,5 |
Đa dạng, màu nâu, cạnh không đều, kích thước 11,5 - 15 $\times$ 8,5 - 9 |
| 13 |
C. graminicola |
Mép không đều, sợi xám mịn, mặt dưới tím đỏ rượu vang |
Hình liềm/thoi, đầu nhọn, kích thước 23,4 - 29 $\times$ 3,5 - 5 |
Màu nâu, mép không đều, kích thước 17,5 - 20 $\times$ 12,5 - 16,5 |
| 14 |
C. lini |
Nâu đến đen, sợi hợp thành hình cây chìm, khối bào tử không rõ |
Hình liềm có giọt nhỏ, kích thước 16 - 19 $\times$ 3 - 4,5 |
Nâu, chùy dài không đều, kích thước 10 - 13,5 $\times$ 6,5 - 13,5 |
| 15 |
C. corchori |
Trắng xám mảnh, khối bào tử vàng mật |
Hình liềm/thoi cong ở đầu, kích thước 15,5 - 20,5 $\times$ 3,5 - 4 |
Hình chùy hoặc tròn, kích thước 6,5 - 13 $\times$ 5,5 - 8,5 |
| 16 |
C. trichellum |
Rất thưa, khối bào tử nâu da bò đến rượu vang |
Hình liềm, hơi cong, giọt nước lớn, kích thước 14 - 24 $\times$ 4 - 6 |
Nâu chocolate khía chùy, kích thước 12 - 18 $\times$ 8,5 - 12 |
| 17 |
C. phyllachoroides |
Chưa rõ |
Hình liềm/thoi cùn đầu, kích thước 14,5 - 18,5 $\times$ 5 - 5,5 |
Chưa xác định |
| 18 |
C. dematium |
Trắng xám chuột đến nâu đỏ rượu vang, khối bào tử ô liu/hồng đỏ |
Hình liềm, hình thuyền nhọn đầu, kích thước 19,5 - 24 $\times$ 2 - 2,5 |
Nâu, hình chùy hoặc tròn, kích thước 8 - 11,5 $\times$ 6,5 - 8 |
| 19 |
C. circinans |
Nâu sậm, hạch nấm cầu/gối, khối bào tử son/nâu đen |
Hình liềm nhọn đỉnh, kích thước 19 - 30 $\times$ 3 - 4 |
Hình chùy hoặc tròn, kích thước 10 - 14,5 $\times$ 6 - 6,5 |
| 20 |
C. truncatum |
Nâu sậm đến đen, có búi xám không đều, khối bào tử màu mật |
Hình liềm cùn ở đầu, kích thước 15,5 - 24 $\times$ 3,5 - 4 |
Hình chùy/tròn không đều, kích thước 11 - 16 $\times$ 8 - 9,5 |
| 21 |
C. capsici |
Dày đặc, trắng đến xám sậm, khối bào tử da bò đến hồng nhạt |
Hình liềm/thoi cùn đầu, kích thước 18 - 23 $\times$ 3,5 - 4 |
Hình chùy đến tròn, kích thước 9 - 14 $\times$ 6,5 - 11,5 |
- Đặc điểm sinh thái và sinh học: Nấm tạo bào tử mạnh nhất trên môi trường Richard's agar ($47,60 \times 10^4$ bào tử/mL), kế đến là Czapek - Dox agar ($43,00 \times 10^4$ bào tử/mL) và PDA ($40,20 \times 10^4$ bào tử/mL). Bào tử bắt đầu nảy mầm sau 2 giờ và đạt tỷ lệ cao sau 6 - 24 giờ. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng là 25 - 30°C, ẩm độ bão hòa $> 90%$, pH môi trường tối ưu từ 6 - 7 hoặc 7 - 8.
- Cơ chế xâm nhiễm và lưu tồn: Trình bày chi tiết hình thức xâm nhiễm bán ký sinh (hemibiotrophic) và hoại sinh (necrotrophic), cơ chế phát tán qua nước mưa, lưu tồn qua hạt giống, đất, tàn dư và cây ký chủ phụ.
- Ứng dụng sinh học phân tử: Cơ sở lý thuyết về giải trình tự vùng ITS, kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi ITS1/ITS4, ITS6/ITS7 để chẩn đoán chính xác loài.
- Biện pháp quản lý tổng hợp: Tổng kết các biện pháp canh tác (vệ sinh vườn, tỉa cành, quản lý nước tưới), sử dụng vi sinh vật có ích (Trichoderma, Bacillus, xạ khuẩn, nấm men), hóa chất bảo vệ thực vật và dịch trích thảo mộc.
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương này mô tả chi tiết toàn bộ các quy trình kỹ thuật, thiết kế thí nghiệm, thiết bị và hóa chất đã được sử dụng:
- Bố trí thí nghiệm in vitro đánh giá 7 loại thuốc trừ nấm hóa học ở hai nồng độ 50 ppm và 100 ppm:
| STT |
Tên thương phẩm |
Hoạt chất |
Nồng độ khảo sát (ppm) |
| 1 |
Amistar top 325 SC |
Azoxystrobin + Difenoconazole |
50 và 100 |
| 2 |
Antracol 70 WG |
Propineb |
50 và 100 |
| 3 |
Dithane M45 80WP |
Mancozeb |
50 và 100 |
| 4 |
Norshield 86.2 WG |
Cuprous oxide |
50 và 100 |
| 5 |
Score 250 EC |
Difenoconazole |
50 và 100 |
| 6 |
Tilt Super 300 EC |
Propiconazole + Difenoconazole |
50 và 100 |
| 7 |
Ridomyl Gold 68 WG |
Metalaxyl + Mancozeb |
50 và 100 |
- Khảo sát 5 chế phẩm sinh học in vitro đối với mầm bệnh:
| STT |
Tên thương phẩm |
Hoạt chất sinh học |
Liều lượng xử lý / 100 mL |
| 1 |
Stop 5SL |
Chitosan |
0,32 mL |
| 2 |
Polyoxin AL 10WP |
Polyoxin complex |
0,16 g |
| 3 |
Ditacin 8SL |
Ningnamycin |
0,12 mL |
| 4 |
Sat 4SL |
Cytosinpeptidemycin |
0,12 mL |
| 5 |
Amtech 100EW |
Anacardic Acid |
0,38 mL |
- Thử nghiệm 3 loại thảo mộc ở các nồng độ 2%, 3%, 4% bằng phương pháp Poison Food:
| STT |
Tên thông thường |
Tên khoa học |
Bộ phận sử dụng |
Thời điểm thu hái |
| 1 |
Củ đậu (Củ sắn) |
Pachyrhizus erosus |
Thân, lá |
Cây trưởng thành |
| 2 |
Cây móng tay |
Impatiens balsamina |
Thân, lá, hoa |
Bắt đầu cho hoa |
| 3 |
Xương rồng ông |
Euphorbia antiquorum |
Thân |
Cây trưởng thành |
- Thử nghiệm in vitro 15 dòng xạ khuẩn và 26 dòng vi khuẩn Bacillus spp.
- Thử nghiệm nhà lưới gồm 8 nghiệm thức nhằm hoàn thiện hợp phần kỹ thuật quản lý bệnh:
| Nghiệm thức |
Hoạt chất / Tác nhân sinh học |
Tên thương phẩm / Dòng |
Liều lượng áp dụng |
| NT1 |
Difenoconazole |
Score 250EC |
10 mL / 8 L |
| NT2 |
Azoxystrobin + Difenoconazole |
Amistar top 325SC |
8 mL / 8 L |
| NT3 |
Propiconazole + Difenoconazole |
Tilt Super 300EC |
5 mL / 8 L |
| NT4 |
Polyoxin complex |
Polyoxin AL 10WP |
12,5 g / 8 L |
| NT5 |
Xạ khuẩn đối kháng |
Xạ khuẩn TG17 |
$10^8$ CFU/mL |
| NT6 |
Vi khuẩn đối kháng |
Bacillus sp. VL-N-BS2 |
$10^8$ CFU/mL |
| NT7 |
Dịch trích thảo mộc |
Impatiens balsamina L. |
2% |
| NT8 |
Đối chứng |
Nước cất |
Phun nước cất vô trùng |
Kết quả và những đóng góp mới
Những đóng góp mới về mặt khoa học
- Xác định thành phần loài tác nhân gây bệnh: Đã xác định được hai loài nấm chính gây bệnh thán thư trên cây thanh long tại ba tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận là Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum truncatum thông qua việc kết hợp đặc điểm hình thái học với kỹ thuật giải trình tự DNA vùng ITS-rDNA.
- Làm rõ nguồn lưu tồn và dịch tễ học của mầm bệnh: Chứng minh nấm Colletotrichum có khả năng lưu tồn trong nước mưa hứng dưới tán cây, trong nước mương vườn, trên các mô chết/tàn dư thực vật (rơm rạ, cỏ khô, cành cắt tỉa) và trong đất ở các tầng độ sâu khác nhau (2 - 10 cm). Các chủng phân lập từ các nguồn lưu tồn này đều giữ nguyên khả năng lây bệnh khi kiểm chứng theo quy trình Koch. Đồng thời xác định ẩm độ không khí cao và vũ lượng mưa trong năm là các yếu tố chính thúc đẩy sự phát sinh và gia tăng tỷ lệ bệnh ngoài đồng ruộng.
Những đóng góp mới về mặt thực tiễn
- Tuyển chọn các tác nhân sinh học và thảo mộc: Đã sàng lọc và lựa chọn được các dòng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng cao như dòng xạ khuẩn TG17, dòng vi khuẩn Bacillus sp. VL-N-BS2, chế phẩm sinh học Polyoxin AL 10WP (hoạt chất Polyoxin complex) và dịch trích từ cây móng tay (Impatiens balsamina L. 2%).
- Xây dựng hợp phần kỹ thuật quản lý bệnh tổng hợp: Kết quả thử nghiệm nhà lưới và mô hình diện hẹp cung cấp cơ sở kỹ thuật xây dựng quy trình phòng trừ tổng hợp bệnh thán thư theo hướng an toàn; giúp giảm áp lực bệnh hại trên đồng ruộng, giảm số lần phun thuốc hóa học, hạn chế tồn dư thuốc bảo vệ thực vật trên quả thanh long và nâng cao hiệu quả kinh tế so với tập quán canh tác truyền thống của nông dân.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Các thí nghiệm phòng trừ mầm bệnh ngoài đồng ruộng trong khuôn khổ đề tài mới chỉ dừng lại ở các thí nghiệm đơn yếu tố.
- Việc đánh giá hiệu lực của các biện pháp kỹ thuật ngoài đồng ruộng chủ yếu dựa trên các chỉ tiêu dịch tễ và sinh học chính như tỷ lệ bệnh (TLB %), chỉ số bệnh (CSB %), đường kính vết bệnh (D) và năng suất quả trên trụ thanh long, chưa mở rộng phân tích các chỉ tiêu sinh hóa chuyên sâu trong cây ký chủ.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Dựa trên phạm vi nghiên cứu của luận án, các nghiên cứu tiếp theo có thể triển khai thử nghiệm đa yếu tố trên quy mô diện rộng tại nhiều vùng sinh thái khác nhau.
- Tiếp tục theo dõi tính ổn định và hoàn thiện quy trình phối hợp giữa biện pháp sinh học (vi khuẩn Bacillus, xạ khuẩn, thảo mộc) với nông dược hóa học trong suốt các chu kỳ mùa vụ nhằm xây dựng quy trình IPM toàn diện cho vùng chuyên canh thanh long xuất khẩu.
Giá trị tham khảo
Đối tượng thụ hưởng
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên thuộc các chuyên ngành Bảo vệ thực vật, Bệnh học cây trồng, Nông học, Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học.
- Giảng viên và nhà khoa học tại các viện nghiên cứu, trường đại học nông lâm làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy và định hướng nghiên cứu chuyên sâu về chi nấm Colletotrichum.
- Cán bộ kỹ thuật nông nghiệp, cán bộ khuyến nông tại các địa phương trồng thanh long (Tiền Giang, Long An, Bình Thuận và các tỉnh lân cận) dùng làm tài liệu tập huấn kỹ thuật chuyển giao tiến bộ cho nông dân.
- Người sản xuất và doanh nghiệp kinh doanh thanh long tham khảo các giải pháp sử dụng hoạt chất sinh học, vi sinh vật đối kháng và thảo mộc để quản lý dịch bệnh đáp ứng các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm phục vụ xuất khẩu.
Phần nội dung đáng tham khảo
- Hệ thống phân loại hình thái học và sinh học phân tử: Phần tổng quan và phương pháp định danh nấm bằng cặp mồi ITS1/ITS4, phân tích BLAST và xây dựng cây phát sinh loài bằng MEGA 5.
- Quy trình lây nhiễm nhân tạo và phương pháp điều tra nguồn lưu tồn: Phương pháp thu thập và định lượng nấm trong nước mưa, nước mương, tàn dư thực vật và mẫu đất ở các tầng sâu.
- Phương pháp chiết xuất thảo mộc và thử nghiệm đối kháng vi sinh vật: Quy trình chiết Soxhlet bằng methanol và phương pháp đánh giá vòng vô khuẩn theo chuẩn Prapagdee.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã xác định những loài nấm nào thuộc chi Colletotrichum là tác nhân chính gây bệnh thán thư trên thanh long?
Dựa trên các đặc điểm hình thái học kết hợp với phân tích trình tự DNA vùng ITS-rDNA (khuếch đại bằng cặp mồi ITS1/ITS4 và đối chiếu GenBank NCBI), luận án đã khẳng định hai loài nấm gây bệnh thán thư trên thanh long tại ba tỉnh Tiền Giang, Long An và Bình Thuận là Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum truncatum.
2. Nấm gây bệnh thán thư thanh long có khả năng lưu tồn ở những môi trường tự nhiên nào trong vườn?
Kết quả nghiên cứu thực nghiệm xác định mầm bệnh nấm Colletotrichum spp. có khả năng lưu tồn trong nước mưa hứng dưới tán cây, nước mương vườn (tầng mặt 0 - 5 cm), trên các mô chết và tàn dư thực vật (cành cắt tỉa, cỏ khô, rơm rạ phủ gốc), cũng như trong đất trồng thanh long ở các tầng độ sâu từ 2 cm đến 10 cm. Các chủng nấm thu thập từ các nguồn này đều có khả năng lây bệnh trở lại trên cành thanh long khỏe mạnh qua quy trình Koch.
3. Kỹ thuật sinh học phân tử nào được tác giả sử dụng để định danh loài nấm?
Tác giả đã tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) kết hợp Phenol - Chloroform - Isoamyl (25:24:1), thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA với cặp mồi xuôi ITS1 và mồi ngược ITS4, tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ kít NucleoSpin® và giải trình tự tại Macrogen Inc. (Hàn Quốc). Dữ liệu chuỗi nucleotide được phân tích bằng công cụ BLAST trên NCBI, căn chỉnh bằng ClustalW và dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Neighbor-Joining (NJ) với 1000 lần lặp lại bootstrap trên phần mềm MEGA 5.
4. Những tác nhân sinh học, thảo mộc và thuốc hóa học nào đã được tuyển chọn để đưa vào thử nghiệm nhà lưới?
Trong thí nghiệm nhà lưới, tác giả đã sử dụng các nghiệm thức gồm:
- Thuốc hóa học: Score 250EC (Difenoconazole 10 mL/8 L), Amistar top 325SC (Azoxystrobin + Difenoconazole 8 mL/8 L), Tilt Super 300EC (Propiconazole + Difenoconazole 5 mL/8 L).
- Hoạt chất sinh học: Polyoxin AL 10WP (Polyoxin complex 12,5 g/8 L).
- Tác nhân vi sinh vật: Dòng xạ khuẩn TG17 ($10^8$ CFU/mL) và dòng vi khuẩn Bacillus sp. VL-N-BS2 ($10^8$ CFU/mL).
- Dịch trích thảo mộc: Dịch trích từ cây móng tay (Impatiens balsamina L.) nồng độ 2%.
5. Phương pháp đánh giá mức độ bệnh trên cành thanh long trong các thí nghiệm được quy định như thế nào?
Mức độ bệnh trên cành thanh long được đánh giá thông qua chỉ tiêu Tỷ lệ bệnh (TLB %), Chỉ số bệnh (CSB %) và Đường kính vết bệnh trung bình ($D = \frac{d_1 + d_2 + d_3}{3}$). Thang phân cấp bệnh trên cành áp dụng theo Quy chuẩn Kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-38:2010/BNNPTNT gồm 6 cấp từ cấp 0 (không có vết bệnh) đến cấp 5 (diện tích cành bị bệnh $> 80%$).
Kết luận
Luận án tiến sĩ đã cung cấp dữ liệu khoa học có hệ thống về bệnh thán thư hại thanh long tại ba vùng trồng trọng điểm Tiền Giang, Long An và Bình Thuận; xác định chính xác hai tác nhân gây bệnh là Colletotrichum gloeosporioides và Colletotrichum truncatum bằng hình thái học và giải trình tự gen ITS-rDNA. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ khả năng lưu tồn đa dạng của mầm bệnh trong nước mưa, nước mương, tàn dư thực vật, đất và quy luật phát sinh bệnh theo lượng mưa và ẩm độ trong năm. Đồng thời, đề tài đã tuyển chọn thành công các dòng xạ khuẩn TG17, vi khuẩn Bacillus sp. VL-N-BS2, dịch trích cây móng tay và các hoạt chất sinh học, hóa học phù hợp, đặt nền tảng kỹ thuật cho việc xây dựng quy trình quản lý tổng hợp bệnh thán thư an toàn và hiệu quả.
