Luận văn: Xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp LC-MS/MS

Luận văn thạc sĩ HUS nghiên cứu xác định ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS hiệu quả và chính xác.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hà Bình
• Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Hồng Hảo
• Trường học: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
• Chuyên ngành: Hóa phân tích
• Đề tài: Xác định Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2013
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Toàn cảnh luận văn HUS Ochratoxin và an toàn thực phẩm

Luận văn thạc sĩ của Nguyễn Thị Hà Bình tại Đại học Khoa học Tự nhiên (VNU-HUS) là một đề tài nghiên cứu khoa học chuyên sâu, tập trung vào việc xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Ochratoxin trong thực phẩm. Công trình này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc kiểm soát độc tố nấm mốc (mycotoxin), đặc biệt là Ochratoxin A (OTA), một chất có nguy cơ gây ung thư và tổn thương thận. Bối cảnh nghiên cứu xuất phát từ thực trạng ô nhiễm thực phẩm do mycotoxin ngày càng gia tăng tại Việt Nam, một quốc gia có khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho nấm mốc phát triển trên các loại nông sản như ngũ cốc, cà phê. Luận văn đặt mục tiêu phát triển một quy trình phân tích đáng tin cậy, có độ nhạy và độ chính xác cao bằng kỹ thuật hiện đại sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Phương pháp này được coi là tiêu chuẩn vàng trong kiểm nghiệm thực phẩm, giúp đảm bảo an toàn thực phẩm và đáp ứng các tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cũng như quốc tế. Nghiên cứu không chỉ dừng lại ở việc xây dựng phương pháp mà còn ứng dụng để phân tích các mẫu thực tế trên thị trường, cung cấp dữ liệu khoa học giá trị về mức độ ô nhiễm Ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, và rượu vang.

1.1. Giới thiệu tổng quan về độc tố nấm mốc Ochratoxin

Ochratoxin là một nhóm các mycotoxin được sản sinh thứ cấp bởi các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Trong đó, Ochratoxin A (OTA) là dạng phổ biến và độc tính cao nhất, được Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) xếp vào nhóm IIB (có khả năng gây ung thư cho người). OTA bền với nhiệt, khó bị phân hủy trong quá trình chế biến thực phẩm thông thường. Nó có thể tồn tại trong nhiều loại nông sản như ngũ cốc (lúa mì, ngô), cà phê, ca cao, và các sản phẩm có nguồn gốc động vật do vật nuôi ăn phải thức ăn bị nhiễm độc. Luận văn trích dẫn, theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% lượng ngũ cốc trên thế giới chứa mycotoxin ở một mức độ nào đó. Tác hại của OTA không chỉ dừng lại ở nguy cơ ung thư mà còn gây độc cho thận, gan và ức chế hệ miễn dịch, là mối đe dọa thầm lặng đến sức khỏe cộng đồng.

1.2. Tính cấp thiết của việc kiểm soát Ochratoxin tại Việt Nam

Việt Nam với đặc thù khí hậu nhiệt đới ẩm và nền nông nghiệp truyền thống là điều kiện lý tưởng cho nấm mốc phát triển, dẫn đến nguy cơ ô nhiễm Ochratoxin trong chuỗi cung ứng thực phẩm rất cao. Luận văn của VNU-HUS chỉ ra rằng, các vụ ngộ độc thực phẩm do độc tố nấm mốc không gây ra triệu chứng cấp tính ngay lập tức mà tích lũy dần trong cơ thể, gây ra các bệnh mãn tính nguy hiểm. Việc thiếu các phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm hiệu quả và quy trình kiểm soát chặt chẽ từ khâu thu hoạch, bảo quản đến chế biến làm gia tăng rủi ro. Do đó, việc xây dựng một phương pháp phân tích chuẩn xác như sắc ký lỏng khối phổ lc ms ms để xác định Ochratoxin là vô cùng cấp thiết. Điều này không chỉ bảo vệ người tiêu dùng trong nước mà còn giúp nông sản Việt Nam đáp ứng các rào cản kỹ thuật khắt khe khi xuất khẩu, tuân thủ các quy định về an toàn thực phẩm của EU và các thị trường khác.

II. Thách thức trong việc kiểm nghiệm độc tố nấm mốc OTA

Việc phân tích thực phẩm để xác định hàm lượng Ochratoxin ở nồng độ vết (ppb - phần tỷ) đặt ra nhiều thách thức kỹ thuật. Thứ nhất, Ochratoxin A (OTA) thường tồn tại trong nền mẫu thực phẩm phức tạp, chứa nhiều hợp chất khác có thể gây nhiễu, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả. Các phương pháp truyền thống như ELISA tuy nhanh nhưng có thể cho kết quả dương tính giả. Thứ hai, quá trình xử lý mẫu là giai đoạn quan trọng nhất và cũng dễ gây sai số nhất. Việc chiết tách OTA ra khỏi nền mẫu ngũ cốc hay rượu vang đòi hỏi quy trình phải được tối ưu hóa cẩn thận để đạt hiệu suất thu hồi cao và loại bỏ tối đa tạp chất. Luận văn thạc sĩ này đã chỉ ra những khó khăn trong việc lựa chọn dung môi chiết, kỹ thuật làm sạch mẫu, và điều kiện pH phù hợp. Nếu không có một quy trình chuẩn, kết quả phân tích có thể thấp hơn thực tế, dẫn đến đánh giá sai lầm về mức độ ô nhiễm thực phẩm và rủi ro cho sức khỏe người tiêu dùng. Đây chính là lý do các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm thực phẩm hiện đại ưu tiên sử dụng các phương pháp có độ nhạy và độ chọn lọc cao như LC-MS/MS.

2.1. Vấn đề nền mẫu phức tạp trong phân tích Ochratoxin

Nền mẫu thực phẩm như ngũ cốc, cà phê, và đặc biệt là rượu vang, chứa hàng trăm hợp chất hữu cơ khác nhau (protein, lipid, carbohydrate, polyphenol). Các hợp chất này có thể có tính chất hóa lý tương tự Ochratoxin A, gây khó khăn cho quá trình tách chiết và phân tích. Chúng có thể cùng được chiết ra với chất phân tích, gây ảnh hưởng đến tín hiệu trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và làm giảm độ nhạy của detector khối phổ. Hiện tượng này, gọi là hiệu ứng nền (matrix effect), là một trong những thách thức lớn nhất trong phân tích thực phẩm. Luận văn đã nhấn mạnh sự cần thiết của một quy trình xử lý mẫu hiệu quả, đặc biệt là bước làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE - Solid Phase Extraction), để giảm thiểu hiệu ứng nền và đảm bảo kết quả định lượng chính xác.

2.2. Yêu cầu về giới hạn phát hiện LOD và định lượng LOQ

Các quy định về an toàn thực phẩm của Việt Nam (TCVN) và quốc tế (EU) đặt ra giới hạn dư lượng tối đa cho phép (MRL) của Ochratoxin A ở mức rất thấp, thường chỉ vài µg/kg (ppb). Ví dụ, MRL cho ngũ cốc chưa qua chế biến là 5 µg/kg. Điều này đòi hỏi phương pháp phân tích phải có độ nhạy cực cao, với giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) thấp hơn nhiều so với mức MRL. Việc đạt được các giá trị LOD/LOQ mong muốn là một thách thức, phụ thuộc vào cả hiệu quả của quy trình xử lý mẫu và khả năng của thiết bị phân tích. Luận văn này sử dụng kỹ thuật khối phổ hai lần (tandem mass spectrometry), một công nghệ tiên tiến cho phép phát hiện và định lượng OTA ở nồng độ cực thấp, đáp ứng hoàn toàn các yêu cầu khắt khe nhất về kiểm nghiệm thực phẩm.

III. Hướng dẫn tối ưu phương pháp LC MS MS xác định Ochratoxin

Nội dung trọng tâm của luận văn thạc sĩ HUS là quá trình xây dựng và tối ưu hóa phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Đây là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, kết hợp khả năng tách ưu việt của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với khả năng nhận dạng và định lượng chính xác của khối phổ hai lần (tandem mass spectrometry). Để đạt được hiệu quả phân tích cao nhất, nghiên cứu đã tiến hành tối ưu hóa một cách hệ thống các thông số của cả hai cấu phần. Đối với hệ thống HPLC, các yếu tố như loại cột sắc ký (C18), thành phần pha động, tốc độ dòng và chương trình rửa giải gradient đã được khảo sát chi tiết. Mục tiêu là tách hoàn toàn Ochratoxin A và Ochratoxin B ra khỏi các thành phần gây nhiễu trong mẫu, đồng thời đảm bảo hình dạng pic sắc ký đẹp và thời gian phân tích ngắn. Song song đó, các điều kiện của máy khối phổ cũng được tinh chỉnh để tối đa hóa tín hiệu của chất phân tích. Quy trình này đảm bảo phương pháp đạt độ nhạy, độ chọn lọc và độ lặp lại cao, tạo nền tảng vững chắc cho việc thẩm định phương pháp và ứng dụng vào phân tích thực phẩm thực tế.

3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho máy khối phổ MS MS

Để tối ưu hóa detector khối phổ, nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn vào máy (FIA) để xác định các thông số quan trọng. Quá trình này được thực hiện ở chế độ ion hóa phun điện tử (ESI) âm, phù hợp với cấu trúc phân tử của Ochratoxin. Các thông số chính được khảo sát bao gồm: lựa chọn ion mẹ và ion con đặc trưng cho Ochratoxin A (m/z 402 → 358) và Ochratoxin B (m/z 368 → 324), thế phân mảnh (DP), năng lượng va chạm (CE) và thế ra khỏi buồng va chạm (CXP). Theo kết quả trong Bảng 3.2 và 3.3 của luận văn, việc tinh chỉnh các giá trị này giúp tối đa hóa cường độ tín hiệu của ion con dùng để định lượng, đồng thời xác nhận sự có mặt của chất phân tích thông qua ion con thứ hai, qua đó tăng cường độ đặc hiệu và độ tin cậy của phương pháp phân tích thực phẩm.

3.2. Tối ưu chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao

Quá trình tách sắc ký được thực hiện trên cột pha đảo C18. Luận văn đã tiến hành khảo sát kỹ lưỡng thành phần pha động, yếu tố quyết định khả năng tách và hình dạng pic. Kết quả cho thấy hệ dung môi gồm kênh A (dung dịch Amoniacetat 10mM) và kênh B (Methanol) cho tín hiệu tốt nhất. Chương trình rửa giải gradient, tức thay đổi tỷ lệ pha động theo thời gian, được lựa chọn để rút ngắn thời gian phân tích mà vẫn đảm bảo tách tốt các chất. Tác giả đã so sánh nhiều chương trình gradient khác nhau (Bảng 3.6) và chọn ra chương trình tối ưu (Bảng 3.7) giúp các pic sắc ký của Ochratoxin nhọn, đối xứng và tách biệt hoàn toàn. Tốc độ dòng cũng được tối ưu ở mức 1.0 ml/phút để cân bằng giữa hiệu quả tách và áp suất hệ thống, bảo vệ tuổi thọ cột sắc ký.

IV. Bí quyết xây dựng quy trình xử lý mẫu thực phẩm tối ưu

Một phương pháp phân tích dù hiện đại đến đâu cũng sẽ thất bại nếu không có một quy trình xử lý mẫu hiệu quả. Đây là giai đoạn tiền phân tích nhằm mục đích chiết rút Ochratoxin ra khỏi nền mẫu phức tạp và làm sạch dịch chiết trước khi đưa vào hệ thống LC-MS/MS. Luận văn thạc sĩ HUS đã dành một phần quan trọng để khảo sát và tối ưu hóa quy trình này. Tác giả đã so sánh ba quy trình xử lý mẫu khác nhau, sử dụng các dung môi chiết như Chloroform, NaHCO3, và Ethyl acetate. Dựa trên hiệu suất thu hồi, quy trình sử dụng Chloroform kết hợp với NaHCO3 đã được lựa chọn. Sau đó, các bước trong quy trình này được tinh chỉnh chi tiết, từ thể tích dung môi chiết, loại cột chiết pha rắn (SPE), tốc độ dòng qua cột, thể tích dung môi rửa giải cho đến ảnh hưởng của pH. Việc tối ưu hóa từng bước nhỏ đã tạo nên một quy trình chuẩn, đảm bảo hiệu suất thu hồi Ochratoxin cao và ổn định, loại bỏ hiệu quả các chất gây nhiễu, góp phần quyết định vào sự thành công của toàn bộ phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm.

4.1. Lựa chọn dung môi và kỹ thuật chiết pha rắn SPE

Nghiên cứu đã so sánh hiệu quả của ba quy trình xử lý mẫu và kết luận quy trình 1 (chiết bằng Chloroform sau đó chuyển sang môi trường NaHCO3 1%) cho hiệu suất thu hồi tốt nhất, đạt 84% đối với Ochratoxin A (Bảng 3.8). Giai đoạn làm sạch mẫu là cực kỳ quan trọng, và kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) đã được áp dụng. Tác giả đã khảo sát giữa hai loại cột SPE là C18 và Oasis HLB. Kết quả cho thấy cột C18, với bản chất không phân cực, lưu giữ Ochratoxin tốt hơn, cho hiệu suất thu hồi cao hơn (86% so với 67% của cột HLB, Bảng 3.10). Đây là lựa chọn hợp lý vì Ochratoxin là chất ít phân cực. Thể tích dung môi rửa giải cũng được tối ưu là 2 ml dung dịch MeOH-acid acetic (99,5:0,5) để đảm bảo thu hồi tối đa chất phân tích ra khỏi cột SPE.

4.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất chiết mẫu

Độ pH của dung dịch trong quá trình chiết có ảnh hưởng lớn đến trạng thái tồn tại và độ tan của Ochratoxin. Luận văn đã tiến hành một thí nghiệm quan trọng để khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng từ 1 đến 10 đến hiệu suất chiết. Kết quả (Hình 3.8) cho thấy hiệu suất chiết Ochratoxin vào dung môi hữu cơ Chloroform đạt cao nhất trong môi trường axit mạnh (pH 1-2). Điều này được giải thích là do ở pH thấp, nhóm carboxyl của Ochratoxin A ở dạng không phân ly, làm giảm tính phân cực của phân tử, giúp nó dễ dàng hòa tan vào dung môi không phân cực. Việc axit hóa mẫu không chỉ tăng hiệu suất chiết mà còn giúp làm ẩm cơ chất, hỗ trợ quá trình tách chiết diễn ra triệt để hơn. Đây là một phát hiện then chốt giúp hoàn thiện quy trình phân tích.

V. Kết quả thẩm định phương pháp xác định Ochratoxin A

Sau khi tối ưu hóa các điều kiện máy móc và quy trình xử lý mẫu, bước tiếp theo và bắt buộc trong một đề tài nghiên cứu khoa học là thẩm định phương pháp. Quá trình này nhằm mục đích chứng minh rằng phương pháp phân tích đã xây dựng là đáng tin cậy, chính xác và phù hợp với mục đích sử dụng, cụ thể là kiểm nghiệm thực phẩm. Luận văn của VNU-HUS đã thực hiện thẩm định một cách bài bản theo các tiêu chí quốc tế. Các thông số quan trọng như độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng và độ chụm đã được đánh giá. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp LC-MS/MS có độ chọn lọc cao, có khả năng phân biệt rõ ràng Ochratoxin với các chất khác trong nền mẫu. Các giá trị LOD và LOQ thu được rất thấp, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN). Độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp cũng được chứng minh là rất tốt, khẳng định đây là một công cụ mạnh mẽ và đáng tin cậy cho việc kiểm soát an toàn thực phẩm.

5.1. Xác định giới hạn phát hiện LOD và định lượng LOQ

Đây là hai chỉ số quan trọng thể hiện độ nhạy của phương pháp. Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà phương pháp có thể phát hiện được, trong khi giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất có thể định lượng được với độ chính xác chấp nhận được. Dựa trên kết quả trong Bảng 3.14 của luận văn, phương pháp đã xây dựng có giá trị LOD đối với Ochratoxin A là 0.25 µg/kg và LOQ là 0.8 µg/kg. Các giá trị này đều thấp hơn đáng kể so với giới hạn cho phép trong ngũ cốc (5 µg/kg) và rượu vang (2 µg/kg), chứng tỏ phương pháp hoàn toàn đủ nhạy để kiểm soát Ochratoxin theo các quy định hiện hành về an toàn thực phẩm.

5.2. Đánh giá độ chính xác và độ đúng của quy trình phân tích

Độ chính xác của phương pháp được đánh giá thông qua độ đúng (accuracy) và độ chụm (precision). Độ đúng, được thể hiện qua hiệu suất thu hồi (recovery), cho biết mức độ gần gũi giữa kết quả đo được và giá trị thực. Luận văn đã tiến hành thí nghiệm trên mẫu thêm chuẩn ở nhiều nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy hiệu suất thu hồi của Ochratoxin A dao động trong khoảng 84-94%, một con số rất tốt cho phân tích thực phẩm. Độ chụm, thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD), cho biết mức độ lặp lại của các phép đo. Giá trị RSD thu được đều nhỏ hơn 15% (Bảng 3.16), chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại cao và ổn định. Những kết quả này khẳng định độ tin cậy của quy trình phân tích đã được xây dựng.

5.3. Ứng dụng phân tích Ochratoxin trên các mẫu thực tế

Để chứng minh tính thực tiễn, phương pháp đã được áp dụng để phân tích một số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập trên thị trường như ngô, lạc, và rượu vang. Kết quả cho thấy sự hiện diện của Ochratoxin A và B trong một số mẫu ngô và lạc (Hình 3.21, 3.22), trong khi các mẫu rượu không phát hiện thấy. Việc áp dụng thành công trên mẫu thực tế không chỉ xác nhận hiệu quả của phương pháp mà còn cung cấp những dữ liệu ban đầu quan trọng về tình hình ô nhiễm thực phẩm do mycotoxin tại một số địa phương, nhấn mạnh sự cần thiết của việc giám sát thường xuyên để đảm bảo an toàn thực phẩm.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng. Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có các vụ ngộ độc mycotoxin đặc biệt nghiêm trọng …đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm về các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây trên cả nước: - Năm 2009: Toàn quốc xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, có 5026 người mắc; 3958 người nhập viện; 33 người tử vong. - Năm 2010: Tình hình NĐTP trong năm 2010 phức tạp.

Toàn quốc đã xảy ra 175 vụ ngộ độc trong đó có 34 vụ ngộ độc trên 30 người làm 5664 người mắc 42 trường hợp tử vong, so sánh với số liệu trung bình trên năm của giai đoạn 2006- 2009, số vụ ngộ độc giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% và số tử vong giảm 19,2%. - Năm 2011: 148 vụ, 4700 người mắc, 27 người tử vong. - Năm 2012: 168 vụ, 5541 người mắc, 34 người tử vong. Theo TS Trần Quang Trung, Cục trưởng Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong 9 tháng của năm 2013, cả nước đã có 108 vụ ngộ độc thực phẩm làm hơn 2.800 người mắc, trong đó có 18 ca tử vong.

Trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm được thống kê trong quý III này thì nguyên nhân do vi sinh vật là 23 vụ, do độc tố tự nhiên 4 vụ, do hóa chất 2 vụ và 11 vụ chưa xác định được nguyên nhân. Các vụ ngộ độc xảy ra khắp nơi, từ gia đình riêng đến tập thể. Ochratoxin là một loại độc tố được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng.

Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin nó không gây ngộ 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc gia cầm và con người. Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là Mycotoxin. Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nấm mốc , được hình thành khi nấm chuyển hóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu. Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào đó.

Tùy vào địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới , nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao. Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiê ̣p ở Viê ̣t Nam tình tra ̣ng nhiễm đô ̣c tố nấ m mố c là khá phổ biến. Sự hình thành nấm mốc và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi.

Như vậy, không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người. Để kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ ochratoxin ở lượng vết hay siêu vết. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích, chúng tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”.

Mục tiêu của thực hiện đề tài nghiên cứu là: 1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: - Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình - Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu. - Thẩm định phương pháp đã xây dựng. Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.

10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.Giới thiệu chung [14-15] 1.Định nghĩa Độc tố ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm mốc. Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê. trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước. Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi.

Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa bị nhiễm A. Ở Đức tìm thấy Ochratoxin thường xuyên trong thịt. Ở Anh, chúng được tìm thấy trong đậu nành, bắp bột, ca cao.Nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% ở hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg ở 47 mẫu café được nhập vào Nhật Bản từ các nước Nam Phi , và một số nước ASIAN.

Tại Việt Nam, nghiên cứu tiến hành trên 123 mẫu ngô của 2 xã Cán Tỷ và Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Kết quả cho thấy: trong 123 mẫu ngô được phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát hiện có ochratoxin A, trong số đó có 2 mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định của Bộ Y tế. Cho tới nay đã phát hiện được 3 loại ochratoxin khác nhau. Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến ochratoxin A và B Ochratoxin A Ochratoxin B Hình 1.1: Cấu trúc các Ochratoxins 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình 1.Tính chất hóa lý của Ochratoxins Ochratoxins là đốc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như chloroform, methanol, …, ít tan trong nước và tan trong đệm carbonat loãng).

Ochratoxins rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Độc tố được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-250C. Sự sản sinh ochratoxins phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. Ochratoxins dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa.

Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm. Ochratoxin A có điểm nóng chảy ở 1690C. Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các píc có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 và pKa2 = 7,0- 7,3. Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC) chiếu tia UV ở 366nm.

Ochratoxin B có trọng lượng phân tử 369,37. Ochratoxin B có thể phát huỳnh quang màu xanh khi chiếu tia UV bước sóng 318 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2210C. Cơ chế tác động của ochratoxins: ochratoxins gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tARN) và các axitamin.

Ochratoxins còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine - tARN ở gan. Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể. Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ức chế tế bào lympho. Ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tARN tương ứng ochratoxin A gây ức chế hydroxylase phenylalanine, một nửa phenylalanine của ochratoxin A là một phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể.

Ochratoxin ức chế sự tổng hợp ARN làm ảnh hưởng đến các protein trong vòng tuần hoàn. Tác động đến các tế bào màng ti thể và gây ra các hiệu ứng khác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành ADN trong thận, gan và lá lách. Các ADN này là các sợi đơn bị phá vỡ.

Các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố này như cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê. Dư lượng ochratoxin cũng được tìm thấy trong thịt heo và thịt gia 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add [e-mail] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình cầm. Độc tố này gây hại đến gan và thận động vật. Với nồng độ lớn hơn 1 ppm có thể làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ, nồng độ lớn hơn 5 ppm có thể gây nên những tổn thương ở gan và ruột.

Tương tự như Aflatoxin, độc tố này cũng gây nên sự giảm sức đề kháng và là tác nhân gây ung thư ở người. - Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác định sự ngộ độc Ochratoxin đều có bệnh tích giống nhau ở chỗ gan bị hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà tình trạng bệnh trên gan khác nhau. Biểu hiện chung là ban đầu gan động vật (điển hình là gà) biến thành màu vàng tươi, mật sưng sau đó gan sưng phồng và bắt đầu nổi các mụn nhỏ trên bề mặt làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng, sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở và dễ vỡ - Thận sưng to làm cho việc đào thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên hết sức khó khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể, có thể gây tử vong cho động vật.

Khi nhiễm độc ochratoxin cơ thể rất mẫn cảm với các loại bệnh thông thường - Bào mòn niêm mạc của ống tiêu hóa do lớp tế bào niêm mạc bị chết bong ra và bị khô lại hình thành nên một lớp màng bọc làm cản trở sự chuyển thức ăn đi trong ống tiêu hóa - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường gây rối loạn sinh sản. Ở thú mang thai có thể gây chết thai.