MỞ ĐẦU Vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm ngày càng được quan tâm bởi nó liên quan trực tiếp tới sức khỏe của tất cả người tiêu dùng. Thời gian vừa qua trong nước liên tiếp phát hiện các vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có các vụ ngộ độc mycotoxin đặc biệt nghiêm trọng …đã gây ra tâm lý lo ngại cho người tiêu dùng khi lựa chọn thực phẩm cũng như sử dụng thực phẩm thế nào là đúng cách. Theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm về các vụ ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây trên cả nước: - Năm 2009: Toàn quốc xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, có 5026 người mắc; 3958 người nhập viện; 33 người tử vong. - Năm 2010: Tình hình NĐTP trong năm 2010 phức tạp.
Toàn quốc đã xảy ra 175 vụ ngộ độc trong đó có 34 vụ ngộ độc trên 30 người làm 5664 người mắc 42 trường hợp tử vong, so sánh với số liệu trung bình trên năm của giai đoạn 2006- 2009, số vụ ngộ độc giảm 9,1%; số mắc giảm 17,6% và số tử vong giảm 19,2%. - Năm 2011: 148 vụ, 4700 người mắc, 27 người tử vong. - Năm 2012: 168 vụ, 5541 người mắc, 34 người tử vong. Theo TS Trần Quang Trung, Cục trưởng Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, trong 9 tháng của năm 2013, cả nước đã có 108 vụ ngộ độc thực phẩm làm hơn 2.800 người mắc, trong đó có 18 ca tử vong.
Trong 40 vụ ngộ độc thực phẩm được thống kê trong quý III này thì nguyên nhân do vi sinh vật là 23 vụ, do độc tố tự nhiên 4 vụ, do hóa chất 2 vụ và 11 vụ chưa xác định được nguyên nhân. Các vụ ngộ độc xảy ra khắp nơi, từ gia đình riêng đến tập thể. Ochratoxin là một loại độc tố được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng.
Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm ochratoxin nó không gây ngộ 8 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người.000 loại nấm mốc khác nhau được biết đến thì có khoảng 50 loại là có hại đối với gia súc gia cầm và con người. Các loại nấm này sản sinh ra các độc tố được gọi chung là Mycotoxin. Mycotoxin là chất độc sinh ra từ nấm mốc , được hình thành khi nấm chuyển hóa các chất dinh dưỡng có trong thức ăn và nguyên liệu. Theo tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), khoảng 25% số ngũ cốc thế giới có chứa một hàm lượng mycotoxin ở một mức độ nào đó.
Tùy vào địa lý, khả năng nhiễm mycotoxin lại khác nhau. Ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới , nguy cơ nhiễm mycotoxin càng cao. Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiê ̣p ở Viê ̣t Nam tình tra ̣ng nhiễm đô ̣c tố nấ m mố c là khá phổ biến. Sự hình thành nấm mốc và độc tố của chúng có thể bắt đầu từ khi cây còn ở trên đồng, lúc thu hoạch, trong khi bảo quản hoặc ngay cả trong quá trình chế biến thức ăn cho vật nuôi.
Như vậy, không nơi nào trên thế giới có thể thoát khỏi nấm mốc và độc tố từ chúng, và tác hại của chúng là vô cùng to lớn đối với năng suất vật nuôi và sức khỏe con người. Để kiểm soát mức độ nhiễm ochratoxin trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ ochratoxin ở lượng vết hay siêu vết. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích, chúng tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định hàm lượng Ochratoxin trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (LC-MS/MS)”.
Mục tiêu của thực hiện đề tài nghiên cứu là: 1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng của Ochratoxin trong thực phẩm bao gồm: - Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ 9 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình - Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu. - Thẩm định phương pháp đã xây dựng. Áp dụng phương pháp xác định ochratoxin trong ngũ cốc, sản phẩm từ ngũ cốc, rượu lên men trên thị trường trong nước.
10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.Giới thiệu chung [14-15] 1.Định nghĩa Độc tố ochratoxin, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm mốc. Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê. trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước. Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi.
Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa bị nhiễm A. Ở Đức tìm thấy Ochratoxin thường xuyên trong thịt. Ở Anh, chúng được tìm thấy trong đậu nành, bắp bột, ca cao.Nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% ở hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg ở 47 mẫu café được nhập vào Nhật Bản từ các nước Nam Phi , và một số nước ASIAN.
Tại Việt Nam, nghiên cứu tiến hành trên 123 mẫu ngô của 2 xã Cán Tỷ và Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang. Kết quả cho thấy: trong 123 mẫu ngô được phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát hiện có ochratoxin A, trong số đó có 2 mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định của Bộ Y tế. Cho tới nay đã phát hiện được 3 loại ochratoxin khác nhau. Trong khuôn khổ luận văn chúng tôi quan tâm nghiên cứu đến ochratoxin A và B Ochratoxin A Ochratoxin B Hình 1.1: Cấu trúc các Ochratoxins 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình 1.Tính chất hóa lý của Ochratoxins Ochratoxins là đốc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như chloroform, methanol, …, ít tan trong nước và tan trong đệm carbonat loãng).
Ochratoxins rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Độc tố được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-250C. Sự sản sinh ochratoxins phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. Ochratoxins dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa.
Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm. Ochratoxin A có điểm nóng chảy ở 1690C. Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các píc có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 và pKa2 = 7,0- 7,3. Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng (TLC) chiếu tia UV ở 366nm.
Ochratoxin B có trọng lượng phân tử 369,37. Ochratoxin B có thể phát huỳnh quang màu xanh khi chiếu tia UV bước sóng 318 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2210C. Cơ chế tác động của ochratoxins: ochratoxins gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tARN) và các axitamin.
Ochratoxins còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine - tARN ở gan. Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể. Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ức chế tế bào lympho. Ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tARN tương ứng ochratoxin A gây ức chế hydroxylase phenylalanine, một nửa phenylalanine của ochratoxin A là một phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể.
Ochratoxin ức chế sự tổng hợp ARN làm ảnh hưởng đến các protein trong vòng tuần hoàn. Tác động đến các tế bào màng ti thể và gây ra các hiệu ứng khác nhau trên ti thể. Kích thích sự hình thành ADN trong thận, gan và lá lách. Các ADN này là các sợi đơn bị phá vỡ.
Các nguyên liệu dễ nhiễm độc tố này như cám gạo, lúa mì, bột mì, bắp, đậu nành, cà phê. Dư lượng ochratoxin cũng được tìm thấy trong thịt heo và thịt gia 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hà Bình cầm. Độc tố này gây hại đến gan và thận động vật. Với nồng độ lớn hơn 1 ppm có thể làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ, nồng độ lớn hơn 5 ppm có thể gây nên những tổn thương ở gan và ruột.
Tương tự như Aflatoxin, độc tố này cũng gây nên sự giảm sức đề kháng và là tác nhân gây ung thư ở người. - Gây tổn thương tế bào gan: tất cả các trường hợp xác định sự ngộ độc Ochratoxin đều có bệnh tích giống nhau ở chỗ gan bị hư hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà tình trạng bệnh trên gan khác nhau. Biểu hiện chung là ban đầu gan động vật (điển hình là gà) biến thành màu vàng tươi, mật sưng sau đó gan sưng phồng và bắt đầu nổi các mụn nhỏ trên bề mặt làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng, sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở và dễ vỡ - Thận sưng to làm cho việc đào thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên hết sức khó khăn, từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể, có thể gây tử vong cho động vật.
Khi nhiễm độc ochratoxin cơ thể rất mẫn cảm với các loại bệnh thông thường - Bào mòn niêm mạc của ống tiêu hóa do lớp tế bào niêm mạc bị chết bong ra và bị khô lại hình thành nên một lớp màng bọc làm cản trở sự chuyển thức ăn đi trong ống tiêu hóa - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thường gây rối loạn sinh sản. Ở thú mang thai có thể gây chết thai.