Tổng quan luận án

Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu

Kháng sinh là nhóm dược phẩm thiết yếu được sử dụng để điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn. Theo các số liệu thống kê được tác giả trích dẫn, thuốc kháng sinh chiếm khoảng 10% tổng số thuốc sử dụng trên toàn thế giới và chiếm từ 25% đến 30% tổng số thuốc sử dụng hàng năm tại Việt Nam. Các nhóm kháng sinh quan trọng và phổ biến trong điều trị bao gồm nhóm $\beta$-lactam, aminoglycosid và polypeptid/glycopeptid.

Tuy nhiên, việc đảm bảo chất lượng thuốc và hiệu quả điều trị bằng kháng sinh đang đối mặt với nhiều thách thức:

  • Tình trạng sản xuất, buôn bán thuốc giả, thuốc hết hạn sử dụng bị làm giả nhãn mác để lưu hành trên thị trường làm suy giảm hiệu quả điều trị và ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh.
  • Trong điều trị lâm sàng, đặc biệt tại các khoa hồi sức tích cực, sự dung nạp thuốc và biến động các thông số dược động học ở bệnh nhân nặng khiến nồng độ kháng sinh trong máu thường không đạt mức tối ưu theo liều kê đơn. Điều này dẫn tới nhu cầu thực hiện giám sát nồng độ thuốc trong điều trị (Therapeutic Drug Monitoring - TDM) nhằm kiểm soát hiệu quả diệt khuẩn, giảm độc tính (đặc biệt là độc tính trên thận) và hạn chế sự gia tăng đề kháng kháng sinh.
  • Về mặt phân tích, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector quang phổ UV-Vis là công cụ phổ biến nhất để định lượng kháng sinh nhưng đòi hỏi chi phí thiết bị và vận hành lớn, khó triển khai tại chỗ ở các khoa lâm sàng. Phương pháp vi sinh truyền thống theo Dược điển tốn nhiều thời gian và không phân tích đồng thời được nhiều hoạt chất. Ngoài ra, một số nhóm kháng sinh như aminoglycosid hầu như không có nhóm mang màu hấp thụ bức xạ UV-Vis, gây khó khăn cho việc phân tích trực tiếp bằng HPLC-UV thông thường nếu không qua dẫn xuất hóa phức tạp.

Kỹ thuật điện di mao quản kết hợp detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-$C^4D$) là một hướng phân tích bổ trợ thích hợp. Kỹ thuật này kết hợp khả năng phân tách hiệu năng cao của điện di mao quản với khả năng phát hiện vạn năng các chất mang điện tích của detector $C^4D$. Thiết bị CE-$C^4D$ có cấu tạo gọn nhẹ, chi phí đầu tư và phân tích thấp, dễ vận hành và thích hợp cho việc triển khai tại các phòng thí nghiệm kiểm nghiệm tuyến cơ sở cũng như tại các khoa lâm sàng. Trước khi luận án được thực hiện, các nghiên cứu ứng dụng CE-$C^4D$ để định lượng đồng thời các hoạt chất kháng sinh thuộc nhóm $\beta$-lactam, aminoglycosid, glycopeptid trong mẫu dược phẩm và huyết tương tại Việt Nam còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Mục tiêu tổng quát của luận án là nghiên cứu phát triển và ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$C^4D$) nhằm định lượng một số nhóm kháng sinh được sử dụng phổ biến tại Việt Nam trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương.

Các mục tiêu và nội dung nghiên cứu cụ thể được phân định như sau:

  1. Nghiên cứu khảo sát phương pháp CE-$C^4D$ để tìm điều kiện phân tích thích hợp nhằm xác định đồng thời các kháng sinh:
    • Nhóm Aminoglycosid: Amikacin, Kanamycin A, Kanamycin B và Streptomycin.
    • Nhóm Glycopeptid: Vancomycin và Teicoplanin.
    • Nhóm $\beta$-lactam phối hợp chất ức chế: Amoxicillin, Ampicillin, Cefoperazon phối hợp với Sulbactam.
    • Nhóm Carbapenem ($\beta$-lactam thế hệ mới): Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem.
  2. Nghiên cứu khảo sát và xây dựng quy trình xử lý mẫu thích hợp cho từng đối tượng nền mẫu (mẫu chế phẩm dược phẩm và mẫu huyết tương người).
  3. Thẩm định các quy trình phân tích theo các chỉ số đo lường học: khoảng tuyến tính của đường chuẩn, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chụm (độ lặp lại) và độ đúng (độ thu hồi).
  4. Áp dụng quy trình đã phát triển để phân tích hàm lượng các kháng sinh trong các mẫu dược phẩm lưu hành trên thị trường và các mẫu huyết tương của bệnh nhân điều trị hồi sức tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai.
  5. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp CE-$C^4D$ thông qua so sánh, đối chứng kết quả thực nghiệm với các phương pháp tiêu chuẩn quy định trong Dược điển như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp vi sinh.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng phân tích: Các hoạt chất kháng sinh thuộc 4 nhóm/phân nhóm:
    • Aminoglycosid: Amikacin ($C_{22}H_{43}N_5O_{13}$), Streptomycin ($C_{21}H_{39}N_7O_{12}$), Kanamycin A ($C_{18}H_{36}N_4O_{11}$), Kanamycin B ($C_{18}H_{37}N_5O_{10}$).
    • Glycopeptid: Vancomycin ($C_{66}H_{75}Cl_2N_9O_{24}$) và Teicoplanin ($C_{58}H_{65}Cl_2N_9O_{24}$ lõi).
    • $\beta$-lactam cổ điển phối hợp: Amoxicillin ($C_{16}H_{19}N_3O_5S$), Ampicillin ($C_{16}H_{19}N_3O_4S$), Cefoperazon ($C_{25}H_{26}N_9NaO_8S_2$) và Sulbactam ($C_8H_{11}NO_5S$).
    • Carbapenem: Doripenem ($C_{15}H_{24}N_4O_6S_2$), Meropenem ($C_{17}H_{25}N_3O_5S$), Imipenem ($C_{12}H_{17}N_3O_4S$), Ertapenem ($C_{22}H_{25}N_3O_7S$).
  • Đối tượng nền mẫu: Mẫu dược phẩm thành phẩm thu thập trên thị trường và 21 mẫu huyết tương thu thập từ 7 bệnh nhân điều trị hồi sức tích cực.
  • Phạm vi không gian và tổ chức: Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội; phối hợp cùng Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai và Công ty 3Sanalysis, với sự tài trợ kinh phí từ đề tài mã số 104.305 của Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED).
  • Phạm vi thời gian công bố: Luận án hoàn thành và bảo vệ năm 2022.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lược sử và các công trình nghiên cứu liên quan

Luận án hệ thống hóa các mốc lịch sử trong nghiên cứu kháng sinh: Alexander Fleming phát hiện penicillin năm 1928; Waksman phát hiện streptomycin năm 1942; Baron (1950) bổ sung định nghĩa về kháng sinh; E.C. Kornfeld phân lập vancomycin năm 1953; teicoplanin được phát hiện năm 1978.

Về tình hình kháng kháng sinh và thực trạng sử dụng thuốc:

  • Trên thế giới: Dữ liệu giám sát ANSORP (2000–2001) tại 11 quốc gia Đông Nam Á cho thấy tỷ lệ S. pneumoniae kháng penicillin tại Việt Nam là 71,4% (cao nhất khu vực), kháng erythromycin là 92,1%. Tình trạng kháng thuốc gia tăng ở các chủng S. aureus kháng Methicillin (64% tại Hàn Quốc giai đoạn 2005–2007), E. faecium kháng vancomycin và P. aeruginosa kháng imipenem.
  • Tại Việt Nam: Khảo sát tại 2.953 hiệu thuốc phía Bắc cho thấy 88% (thành thị) và 91% (nông thôn) giao dịch kháng sinh không có đơn; nhóm kháng sinh bán nhiều nhất là ampicillin/amoxicillin (chiếm 29%). Nghiên cứu MIDAS ghi nhận 47,3% chủng Acinetobacter baumannii kháng meropenem và 51,1% kháng imipenem. Số liệu sử dụng Carbapenem tại Bệnh viện Bạch Mai (2012–2016) tăng gấp đôi, tập trung nhiều nhất tại Khoa Hồi sức tích cực (>50 liều/100 ngày nằm viện).

Tác giả tổng quan 4 nhóm phương pháp định lượng kháng sinh đã được công bố:

Nhóm phương pháp Kỹ thuật / Thiết bị Đối tượng phân tích tiêu biểu Nền mẫu Giới hạn phát hiện (LOD)
Sắc ký GLC-ECD Gentamycin, Tobramycin, Amikacin, Netilmicin Huyết thanh $< 0,63\ \mu\text{g/mL}$
HPLC-MS/MS Neomycin, Kanamycin Vắc xin $0,1\ \text{ng/mL}$ (Neomycin); $1,0\ \text{ng/mL}$ (Kanamycin)
UPLC-ESI-MS/MS Streptomycin Mật ong $0,15\ \mu\text{g/kg}$
HPLC-UV / HPLC-PED Amikacin Nước, Dịch não tủy $0,2\ \text{ng}$; $0,06\ \mu\text{g/mL}$
HPLC-UV Vancomycin, Meropenem Môi trường vi sinh $2,0\ \mu\text{g/mL}$ (Vancomycin); $0,5\ \mu\text{g/mL}$ (Meropenem)
2D-LC-UV Vancomycin Huyết tương $0,195\ \mu\text{g/mL}$
LC-MS/MS Teicoplanin Huyết thanh $0,01\ \mu\text{g/mL}$
HPLC-PDA Cefepime, Cefixime, Cefoperazon Huyết tương $10 - 25\ \text{ng/mL}$
LC-MS Ertapenem Huyết tương $0,1\ \mu\text{g/mL}$
Quang phổ Hấp thụ phân tử + thuốc thử (2,4,6-trinitrophenol, Ninhydrin, Safranin) Aminoglycosid (Amikacin, Tobramycin, Gentamycin, Streptomycin, Kanamycin) Dược phẩm, Huyết tương $< 0,164 - 3,73\ \mu\text{g/mL}$
Quang phổ tạo phức $Cu^{2+}$, $Pb^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Fe(\text{II-phen})$ Ampicillin, Amoxicillin, Meropenem, Imipenem Dược phẩm, Huyết thanh $0,04 - 0,76\ \mu\text{g/mL}$
Điện hóa Cảm biến điện cực Hg, Carbon thủy tinh, Graphene, màng TFME, hạt nano Au Amikacin, Streptomycin, Kanamycin, Vancomycin, Teicoplanin, Meropenem, Doripenem Dược phẩm, Sữa, Huyết tương, Nước tiểu $5\times 10^{-3}\ \mu\text{g/L}$ đến $10^{-8} - 10^{-5}\ \text{M}$
Điện di mao quản MEKC-LIF Kanamycin B, Amikacin, Neomycin Sữa bò $< 6,0\ \mu\text{g/L}$
CZE-UV / MEKC-UV Kanamycin, Vancomycin Dược phẩm, Huyết thanh $0,14\ \text{mg/g}$; $0,4 - 1,0\ \mu\text{g/mL}$
CE-$C^4D$ Amikacin Dược phẩm $0,5\ \text{mg/L}$

Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết

Mặc dù các phương pháp HPLC, quang phổ và cảm biến điện hóa có độ nhạy nhất định, chúng bộc lộ các nhược điểm: HPLC đòi hỏi dung môi hữu cơ độc hại và thiết bị phức tạp; phương pháp quang phổ và điện hóa dễ bị ảnh hưởng bởi nền mẫu và khó tách đồng thời các chất có cấu trúc tương đồng; các nghiên cứu CE trước đây chủ yếu dùng detector UV nên đối với nhóm aminoglycosid phải tạo dẫn xuất quang học. Luận án lựa chọn giải quyết khoảng trống: phát triển các quy trình CE-$C^4D$ phân tích trực tiếp, đồng thời các kháng sinh trong cùng nhóm mà không cần dẫn xuất hóa, đồng thời kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) để xử lý và định lượng kháng sinh Carbapenem trong mẫu huyết tương người phục vụ công tác TDM.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết và khái niệm

  1. Đặc tính hóa lý và hành vi ion hóa của kháng sinh:

    • Nhóm Aminoglycosid: Phân tử gồm phần genin (vòng aminocyclitol) và các đường amin, có nhiều nhóm chức amin ($-NH_2$). Các giá trị $pK_a$ trải từ 6,7 đến 13,8 (ví dụ Amikacin có $pK_{a1}=6,7$, $pK_{a2}=8,4$, $pK_{a3}=9,7$; Streptomycin có $pK_{a1}=11,2$, $pK_{a4}=13,8$). Trong môi trường acid yếu, các phân tử bị proton hóa tạo thành cation đa điện tích, di chuyển về phía catot dưới tác dụng của điện trường.
    • Nhóm Glycopeptid: Cấu trúc peptide mạch vòng phức tạp chứa các nhóm phân ly lưỡng tính (nhóm carboxylic và amin), $pK_a$ phân bố từ 2,5 đến 11,7.
    • Nhóm $\beta$-lactam và Carbapenem: Chứa nhóm $-COOH$ với $pK_a \approx 2,5 - 3,6$ và các nhóm amin. Trong môi trường pH trung tính hoặc kiềm yếu, các phân tử tồn tại chủ yếu ở dạng anion mang điện tích âm.

  2. Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản (CE):

    • Tách dựa trên sự khác biệt về độ linh động điện di của các ion chất phân tích dưới tác dụng của điện trường một chiều điện thế cao ($15 - 40\ \text{kV}$) trong ống mao quản thạch anh nung (fused silica).
    • Dòng điện di thẩm thấu (Electroosmotic flow - EOF) đóng vai trò là dòng đẩy chất lỏng mang toàn bộ các ion (cation, chất trung hòa, anion) di chuyển qua cửa sổ phát hiện. Vận tốc di chuyển tổng cộng của phần tử ion bằng tổng vectơ vận tốc điện di và vận tốc dòng EOF: $$\vec{v}{\text{app}} = \vec{v}{\text{ep}} + \vec{v}{\text{eof}} = (\mu{\text{ep}} + \mu_{\text{eof}}) \vec{E}$$

  3. Nguyên lý của detector độ dẫn không tiếp xúc ($C^4D$):

    • Cấu tạo gồm hai điện cực hình trụ bằng kim loại đặt bọc ngoài vỏ mao quản thạch anh, cách ly hoàn toàn với dung dịch chất điện ly bên trong. Hai điện cực này kết nối dạng tụ điện thông qua thành mao quản.
    • Nguồn kích thích xoay chiều tần số cao được áp vào điện cực phát. Khi vùng chất phân tích có độ dẫn điện khác với dung dịch điện ly nền (BGE) đi qua khe đo giữa hai điện cực, tổng trở của hệ thay đổi, làm biến thiên biên độ tín hiệu dòng xoay chiều thu được ở điện cực thu. Sau đó, tín hiệu được mạch giải điều chế và khuếch đại chuyển đổi thành tín hiệu điện thế một chiều tỷ lệ với nồng độ chất phân tích.

Phương pháp và kỹ thuật thực nghiệm

  • Thiết bị: Hệ thiết bị điện di mao quản kết hợp detector $C^4D$ thương mại do Công ty 3Sanalysis cung cấp và chuyển giao tại Việt Nam.
  • Hóa chất và chất chuẩn: Sử dụng chất chuẩn tinh khiết của các kháng sinh (Amikacin, Streptomycin, Kanamycin A, Kanamycin B, Vancomycin, Teicoplanin, Amoxicillin, Ampicillin, Cefoperazon, Sulbactam, Doripenem, Meropenem, Imipenem, Ertapenem); các hóa chất làm chất điện ly nền BGE (Tris, MES, Arginin, Histidin, Acid Acetic, L-Carnitine, Natri hydroxyd...).
  • Khảo sát điều kiện điện di:
    • Khảo sát loại BGE, nồng độ BGE và pH đệm.
    • Khảo sát thế tách (điện thế $10 - 25\ \text{kV}$).
    • Khảo sát thông số bơm mẫu thủy tĩnh: áp suất/chiều cao bơm mẫu ($h = 10 - 25\ \text{cm}$) và thời gian bơm mẫu ($t = 10 - 45\ \text{s}$).
    • Khảo sát chiều dài hiệu dụng của mao quản ($L_{\text{eff}} = 35 - 50\ \text{cm}$, đường kính trong $ID = 50\ \mu\text{m}$).
  • Quy trình xử lý mẫu:
    • Mẫu dược phẩm: Hòa tan trong nước deion hoặc dung dịch đệm thích hợp, siêu âm, pha loãng đến nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính và lọc qua màng lọc $0,45\ \mu\text{m}$ hoặc $0,22\ \mu\text{m}$.
    • Mẫu huyết tương: Thử nghiệm tủa protein huyết tương bằng acid trichloroacetic (TCA) hoặc dung môi hữu cơ; nghiên cứu xây dựng quy trình chiết pha rắn (SPE) với cột chiết thích hợp, tối ưu hóa thành phần dung môi rửa tạp và dung môi rửa giải để thu hồi và làm giàu Meropenem, Imipenem.
  • Thẩm định phương pháp:
    • Đánh giá khoảng tuyến tính và hệ số tương quan ($R^2$) của đường chuẩn diện tích pic ($S_{\text{pic}}$) theo nồng độ.
    • Xác định giới hạn phát hiện (LOD) theo tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đường nền ($S/N = 3$) và giới hạn định lượng (LOQ, $S/N = 10$).
    • Đánh giá độ lặp lại thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) của thời gian di chuyển ($t_{\text{dc}}$) và diện tích pic ($S_{\text{pic}}$).
    • Đánh giá độ đúng thông qua hiệu suất thu hồi (Recovery %) trên mẫu thêm chuẩn.
    • So sánh đối chứng kết quả phân tích mẫu thực tế bằng phương pháp CE-$C^4D$ với phương pháp HPLC-UV, HPLC-PDA và LC-MS.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương này trình bày cơ sở lý thuyết về phân loại, cấu trúc hóa học, dược lý học và cơ chế tác dụng của 4 nhóm kháng sinh mục tiêu:

  • Nhóm Aminoglycosid: Cấu trúc vòng aminocyclitol gắn liên kết glycosid với đường amin. Cơ chế tác dụng là gắn vào tiểu đơn vị 30S của riboxom vi khuẩn, gây ức chế tổng hợp protein và làm sai lệch mã di truyền. Nhóm này có hoạt tính mạnh trên trực khuẩn Gram (-) hiếu khí (E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas, Acinetobacter...) và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis).
  • Nhóm Glycopeptid: Gồm Vancomycin và Teicoplanin, có cấu trúc heptapeptid mạch vòng gắn đường. Cơ chế là gắn vào chuỗi tận cùng D-alanyl-D-alanin của peptidoglycan, ức chế enzyme transglycosylase, ngăn chặn sự kéo dài vách tế bào vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) và Enterococcus.
  • Nhóm $\beta$-lactam kết hợp Sulbactam: Gồm các penicillin (Amoxicillin, Ampicillin) và cephalosporin (Cefoperazon). Cơ chế tác dụng là ức chế enzyme transpeptidase tổng hợp vách tế bào. Sulbactam đóng vai trò là chất ức chế không thuận nghịch enzyme $\beta$-lactamase, giúp bảo vệ khung $\beta$-lactam khỏi bị thủy phân.
  • Nhóm Carbapenem: Gồm Doripenem, Meropenem, Imipenem, Ertapenem. Có cấu trúc biến đổi tại vòng thiazolidin (nguyên tử carbon thay thế lưu huỳnh và có liên kết đôi $C_2=C_3$). Nhóm thuốc này có phổ kháng khuẩn rất rộng trên cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), ái lực cao với các protein gắn penicillin (PBP), bền vững với nhiều men $\beta$-lactamase và thường được chỉ định trong điều trị hồi sức cấp cứu.

Chương I cũng phân tích tình trạng kháng thuốc tại Việt Nam, nêu bật tính cấp thiết của việc kiểm soát chất lượng thuốc và giám sát nồng độ thuốc TDM, đồng thời tổng hợp các công trình phân tích kháng sinh bằng sắc ký, quang phổ, điện hóa và điện di mao quản.

Chương II: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất, quy chuẩn pha chế các dung dịch đệm điện ly và chuẩn bị mẫu. Tác giả thiết lập quy trình thực nghiệm để tối ưu hóa từng thông số vận hành của hệ CE-$C^4D$:

  • Khảo sát các dải thế tách từ thấp đến cao (Bảng 2.1).
  • Khảo sát các mức thời gian bơm mẫu thủy tĩnh (Bảng 2.2) và chiều cao cột chất lỏng bơm mẫu (Bảng 2.3).
  • Chi tiết hóa quy trình xử lý mẫu dược phẩm viên nén, viên nang, thuốc bột pha tiêm và quy trình xử lý mẫu huyết tương người bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) với các bước ổn định cột, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải hoạt chất.
  • Thiết lập các công thức toán học tính toán LOD, LOQ, độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) và độ thu hồi ($R%$).

Chương III: Kết quả và thảo luận

Nội dung chương III được chia thành 4 tiểu mục kết quả nghiên cứu độc lập tương ứng với 4 nhóm đối tượng kháng sinh:

1. Định lượng đồng thời Amikacin, Streptomycin, Kanamycin A và Kanamycin B bằng CE-$C^4D$

  • Tối ưu hóa điều kiện: Khảo sát các loại dung dịch điện ly cho thấy môi trường acid acetic loãng giúp 4 kháng sinh aminoglycosid proton hóa hoàn toàn thành cation đa điện tích, cho pic sắc nét và tách rời hoàn toàn. Đã tối ưu nồng độ acid acetic, thế tách điện di, thời gian và chiều cao bơm mẫu thủy tĩnh. Tác giả đánh giá ảnh hưởng của các ion nền thường gặp ($Na^+$, $K^+$) và chứng minh chúng không gây nhiễu pic phân tích ở điều kiện đã chọn.
  • Thẩm định phương pháp: Đường chuẩn diện tích pic của 4 chất đạt độ tuyến tính cao ($R^2 > 0,999$). Giới hạn phát hiện (LOD) đạt mức ppm/dưới ppm phù hợp định lượng hàm lượng. Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic có RSD% thấp; độ thu hồi đạt từ 95% đến 105%.
  • Ứng dụng và đối chứng: Phân tích thành công hàm lượng Amikacin, Streptomycin và Kanamycin A trong các mẫu dược phẩm thương mại. Kết quả phân tích bằng CE-$C^4D$ tương thích chặt chẽ với phương pháp đối chứng (phương pháp Dược điển/HPLC).

2. Định lượng đồng thời Vancomycin và Teicoplanin trong dược phẩm bằng CE-$C^4D$

  • Tối ưu hóa điều kiện: Khảo sát thành phần và nồng độ chất điện ly đệm, pH dung dịch, thế tách, chiều dài hiệu dụng mao quản ($L_{\text{eff}}$), thời gian và áp suất bơm mẫu. Hai kháng sinh glycopeptid tách biệt hoàn toàn trên điện di đồ với đường nền ổn định.
  • Thẩm định phương pháp: Xây dựng phương trình đường chuẩn tuyến tính cho Vancomycin và Teicoplanin, xác định giá trị LOD, LOQ, độ lặp lại và độ thu hồi.
  • Ứng dụng thực tế: Định lượng hàm lượng Vancomycin và Teicoplanin trong 9 mẫu thuốc phẩm thương mại. So sánh kết quả phân tích giữa CE-$C^4D$ và HPLC ($n=3$) cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa thống kê.

3. Định lượng đồng thời Amoxicillin, Ampicillin, Cefoperazon và Sulbactam bằng CE-$C^4D$

  • Tối ưu hóa điều kiện: Do các chất này đều chứa nhóm carboxyl và phân ly thành anion ở pH trung tính đến kiềm, tác giả khảo sát ảnh hưởng của pH và các hệ đệm điện di khác nhau, nồng độ đệm, chiều dài hiệu dụng mao quản, thời gian và chiều cao bơm mẫu để đạt độ phân giải pic tối ưu giữa 3 kháng sinh và chất ức chế Sulbactam.
  • Thẩm định và ứng dụng: Thiết lập đường chuẩn, xác định LOD, LOQ, độ lặp lại và độ thu hồi của cả 4 hoạt chất. Phương pháp được áp dụng để kiểm tra hàm lượng các mẫu dược phẩm kết hợp (như viên nén/bột tiêm Amoxicillin/Sulbactam, Ampicillin/Sulbactam, Cefoperazon/Sulbactam) trên thị trường; kết quả đối chứng tương đồng với phương pháp LC/HPLC.

4. Định lượng Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem trong dược phẩm và huyết tương

  • Phân tích trong mẫu dược phẩm: Khảo sát hệ đệm điện di ở pH = 6, nồng độ đệm, thế tách và chế độ bơm mẫu, cho phép phân tách đồng thời cả 4 kháng sinh nhóm Carbapenem trong một lần chạy. Đánh giá đường chuẩn, LOD, độ lặp lại, độ thu hồi và đối chứng kết quả phân tích mẫu dược phẩm với HPLC-PDA.
  • Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương bằng SPE: Khảo sát các tác nhân tủa protein huyết tương; tối ưu hóa các dung môi rửa tạp và hệ dung môi rửa giải trên cột SPE nhằm tách triệt để các cấu tử nền sinh học và nâng cao hiệu suất thu hồi Meropenem và Imipenem.
  • Thẩm định trên nền huyết tương: Xây dựng đường chuẩn của Meropenem và Imipenem trên nền mẫu huyết tương sau xử lý SPE, xác định LOD, LOQ, độ lặp lại và độ thu hồi qua các mức nồng độ.
  • Ứng dụng lâm sàng: Định lượng nồng độ Meropenem và Imipenem trong 21 mẫu huyết tương của 7 bệnh nhân điều trị hồi sức tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả phân tích phản ánh động thái biến đổi nồng độ thuốc trong máu theo thời gian kể từ thời điểm tiêm truyền và chỉ ra sự khác biệt về mức độ dung nạp/thải trừ thuốc giữa các cá thể bệnh nhân. Kết quả phân tích trên mẫu bệnh nhân được kiểm chứng tương quan tốt với phương pháp HPLC.

Kết quả và những đóng góp mới

Đóng góp mới về mặt khoa học

  1. Lần đầu tiên phát triển hoàn chỉnh phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$C^4D$) để xác định các nhóm kháng sinh phổ biến trong mẫu dược phẩm theo 04 quy trình phân tích độc lập:
    • Quy trình phân tích đồng thời 4 kháng sinh nhóm Aminoglycosid (Amikacin, Streptomycin, Kanamycin A, Kanamycin B).
    • Quy trình phân tích đồng thời 2 kháng sinh nhóm Glycopeptid (Vancomycin và Teicoplanin).
    • Quy trình phân tích đồng thời 3 kháng sinh nhóm $\beta$-lactam (Amoxicillin, Ampicillin, Cefoperazon) phối hợp với Sulbactam.
    • Quy trình phân tích đồng thời 4 kháng sinh nhóm Carbapenem (Doripenem, Meropenem, Imipenem và Ertapenem).
  2. Lần đầu tiên nghiên cứu và phát triển thành công quy trình kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) với hệ thiết bị CE-$C^4D$ để xử lý và định lượng kháng sinh nhóm Carbapenem (Meropenem và Imipenem) trong nền mẫu huyết tương người phục vụ công tác theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị lâm sàng.

Đóng góp mới về mặt thực tiễn

  1. Cung cấp một phương pháp phân tích thay thế và bổ trợ cho phương pháp HPLC và phương pháp vi sinh. Thiết bị CE-$C^4D$ có ưu điểm nhỏ gọn, chi phí đầu tư ban đầu và chi phí phân tích thấp, lượng dung môi tiêu thụ rất nhỏ, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất và kinh tế tại các cơ sở kiểm nghiệm dược phẩm, trung tâm kiểm nghiệm địa phương và phòng xét nghiệm tại Việt Nam.
  2. Ứng dụng thành công quy trình phân tích để định lượng Meropenem và Imipenem trong 21 mẫu huyết tương thực tế của 7 bệnh nhân hồi sức tích cực tại Trung tâm Chống độc – Bệnh viện Bạch Mai. Kết quả cung cấp số liệu thực nghiệm về sự thay đổi nồng độ thuốc theo thời gian sau tiêm truyền và sự khác biệt dược động học giữa các cá thể người bệnh, tạo cơ sở thực nghiệm hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng tối ưu hóa chế độ liều lượng cho bệnh nhân nặng.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Phạm vi ứng dụng trên mẫu sinh học lâm sàng (mẫu huyết tương người) trong luận án mới tập trung vào 2 hoạt chất thuộc nhóm Carbapenem (Meropenem và Imipenem) với quy mô 21 mẫu của 7 bệnh nhân tại một trung tâm điều trị.
  • Các quy trình phân tích nhóm Aminoglycosid và Glycopeptid trong khuôn khổ luận án chủ yếu mới hoàn thiện và thẩm định trên nền mẫu dược phẩm, chưa mở rộng thẩm định đầy đủ trên nền mẫu dịch sinh học phức tạp.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng nghiên cứu quy trình làm sạch, làm giàu mẫu bằng SPE hoặc các kỹ thuật xử lý mẫu vi lượng để ứng dụng CE-$C^4D$ định lượng nhóm Aminoglycosid (Amikacin, Streptomycin, Kanamycin) và Glycopeptid (Vancomycin, Teicoplanin) trong huyết tương và dịch sinh học của bệnh nhân.
  • Tăng quy mô số lượng mẫu bệnh nhân lâm sàng tại các khoa điều trị hồi sức tích cực nhằm hoàn thiện quy trình giám sát nồng độ thuốc trong điều trị (TDM) thường quy tại bệnh viện bằng hệ thiết bị CE-$C^4D$.

Giá trị tham khảo

Đối tượng thụ hưởng

  • Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên: Chuyên ngành Hóa phân tích, Hóa dược, Kiểm nghiệm thuốc và Dược học lâm sàng có thể sử dụng luận án làm tài liệu tham khảo về lý thuyết điện di mao quản, nguyên lý hoạt động của detector $C^4D$ và phương pháp luận thẩm định quy trình phân tích.
  • Cán bộ phân tích và kiểm nghiệm viên: Tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm - Mỹ phẩm tỉnh/thành phố và phòng Kiểm tra chất lượng (QC/QA) của các nhà máy sản xuất dược phẩm; có thể áp dụng trực tiếp 04 quy trình CE-$C^4D$ để kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm kháng sinh.
  • Bác sĩ và dược sĩ lâm sàng: Tại các khoa Hồi sức tích cực, Trung tâm Chống độc và các đơn vị TDM tại bệnh viện; có thêm cơ sở dữ liệu về phương pháp định lượng nồng độ kháng sinh nhanh, chi phí thấp nhằm cá thể hóa liều điều trị cho người bệnh.

Nội dung giá trị cần tham khảo

  • Bộ số liệu tối ưu hóa các thông số điện di mao quản (thành phần đệm, pH, thế tách, kích thước mao quản, chế độ bơm mẫu) cho từng nhóm cấu trúc kháng sinh.
  • Quy trình chiết pha rắn (SPE) xử lý loại protein và làm giàu mẫu huyết tương cho kháng sinh nhóm Carbapenem.
  • Phương pháp luận đánh giá độ tin cậy và đối chứng thống kê giữa phương pháp CE-$C^4D$ với HPLC-UV, HPLC-PDA và LC-MS.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao kỹ thuật CE-$C^4D$ đặc biệt thích hợp để phân tích kháng sinh nhóm Aminoglycosid?

Kháng sinh nhóm Aminoglycosid (như Amikacin, Streptomycin, Kanamycin) không có các nhóm mang màu liên hợp mạnh trong cấu trúc nên hầu như không hấp thụ bức xạ UV-Vis. Để phân tích bằng HPLC-UV truyền thống, bắt buộc phải thực hiện phản ứng tạo dẫn xuất hóa phức tạp và tốn thời gian. Detector độ dẫn không tiếp xúc ($C^4D$) phát hiện dựa trên sự biến thiên độ dẫn của dung dịch khi các ion chất phân tích đi qua, do đó có thể định lượng trực tiếp các ion Aminoglycosid trong môi trường acid mà không cần bất kỳ bước tạo dẫn xuất nào.

2. Các thông số vận hành chính nào của hệ CE-$C^4D$ đã được tối ưu hóa trong luận án?

Các thông số vận hành chính được khảo sát và tối ưu hóa cho từng nhóm chất bao gồm:

  • Loại chất điện ly nền (BGE) và nồng độ đệm (acid acetic, MES, Tris, His, Arg...).
  • Giá trị pH của dung dịch đệm điện di.
  • Điện thế tách ($10 - 25\ \text{kV}$).
  • Chế độ bơm mẫu thủy tĩnh (thời gian bơm từ $10 - 45\ \text{s}$ và chiều cao cột bơm mẫu $10 - 25\ \text{cm}$).
  • Chiều dài hiệu dụng của mao quản thạch anh ($35 - 50\ \text{cm}$).

3. Quy trình xử lý mẫu huyết tương để xác định Meropenem và Imipenem được thực hiện như thế nào?

Quy trình xử lý mẫu huyết tương bao gồm các bước:

  1. Tủa protein huyết tương bằng tác nhân thích hợp để loại bỏ phần lớn protein gây tắc mao quản.
  2. Đưa dịch qua cột chiết pha rắn (SPE) đã được hoạt hóa.
  3. Rửa loại tạp chất bằng hệ dung môi rửa tạp tối ưu.
  4. Rửa giải hoạt chất Meropenem và Imipenem bằng dung môi rửa giải thích hợp nhằm làm sạch và làm giàu chất phân tích trước khi tiêm vào hệ CE-$C^4D$.

4. Kết quả phân tích mẫu huyết tương bệnh nhân tại Bệnh viện Bạch Mai cho thấy điều gì?

Kết quả định lượng Meropenem và Imipenem trong 21 mẫu huyết tương của 7 bệnh nhân điều trị hồi sức tích cực cho thấy nồng độ kháng sinh trong máu suy giảm theo thời gian sau khi tiêm truyền theo quy luật dược động học. Đồng thời, kết quả ghi nhận sự khác biệt rõ rệt về mức độ hấp thu và nồng độ thuốc trong máu giữa các bệnh nhân khác nhau dù được điều trị cùng một mức liều, chứng minh tính cấp thiết của việc giám sát nồng độ thuốc (TDM) để điều chỉnh liều cho từng cá thể.

5. Phương pháp CE-$C^4D$ trong luận án được đối chứng độ tin cậy với những phương pháp nào?

Kết quả phân tích mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương bằng CE-$C^4D$ được so sánh, đối chứng trực tiếp với các phương pháp tiêu chuẩn gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV (HPLC-UV), detector mảng diod quang (HPLC-PDA), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) và phương pháp thử hoạt tính vi sinh theo quy định của Dược điển.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Lê Thái Bình đã phát triển và thẩm định thành công phương pháp điện di mao quản kết hợp detector độ dẫn không tiếp xúc (CE-$C^4D$) để định lượng 4 nhóm kháng sinh quan trọng (Aminoglycosid, Glycopeptid, $\beta$-lactam phối hợp Sulbactam, Carbapenem) trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương. Nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình chiết pha rắn (SPE) kết hợp CE-$C^4D$ để xác định nồng độ Meropenem và Imipenem trong 21 mẫu huyết tương của bệnh nhân hồi sức tích cực tại Bệnh viện Bạch Mai với độ tin cậy tương đương phương pháp HPLC. Công trình mang lại giải pháp phân tích nhanh, chi phí thấp, thiết bị gọn nhẹ, có giá trị ứng dụng thực tiễn cao trong công tác kiểm nghiệm chất lượng thuốc và hỗ trợ theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị lâm sàng tại Việt Nam.