Đặt vấn đề Sử dụng chất kháng khuẩn hay kháng nấm trong điều trị bệnh, làm chất khử trùng hay bảo quản thực phẩm đƣợc xem là một trong những biện pháp hiệu quả. Các chất này có thể kháng lại vi sinh vật gây bệnh bằng cách tiêu diệt hoặc làm giảm hoạt động trao đổi chất của chúng. Các chất có phân tử nhỏ thƣờng đƣợc sử dụng nhiều trong xử lý lĩnh vực này. Trong số này, kháng sinh trên thực tế đã mang lại những kết quả lớn trong điều trị các bệnh liên quan đến vi khuẩn và nấm.
Tuy nhiên, do tính kháng kháng sinh hiện nay đang ngày càng gia tăng, trở thành một vấn đề cần phải giải quyết trên toàn thế giới nên việc sử dụng chúng là vấn đề cần đƣợc xem xét hết sức cẩn trọng. Vi khuẩn Gram (-) có khả năng kháng kháng sinh cao hơn vi khuẩn Gram (+) vì có cấu trúc màng ngoài khá đặc biệt. Màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) thƣờng bị che bởi một lớp chất nhày gây khó khăn cho việc tiếp xúc của chất kháng khuẩn với tác nhân đích. Vì thế, việc tìm kiếm các chất kháng khuẩn hiệu quả vi khuẩn Gram (-) cũng rất đƣợc quan tâm.
Do đó, các chiến lƣợc trị liệu kháng khuẩn thay thế kháng sinh, kháng vi khuẩn Gram (-) hiệu quả đã và đang đƣợc thực hiện rộng rãi (Ullah & Ali. Vai trò kháng khuẩn của peroxit hydro (H2O2) đã đƣợc khẳng định. Dung dịch 3% của chất này đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ là chất khử trùng và kháng khuẩn. H2O2 là gốc oxi hoạt động nên đƣợc xếp vào nhóm các chất có khả năng gây tổn thƣơng oxi hoá.
H2O2 là chất oxi hoá khá mạnh và có thể tƣơng tác với nhiều thành phần khác nhau của tế bào. Các phản ứng này bao gồm sự peroxy hoá lipit màng và sự hydroxyl hoá các protein và ADN. Các nghiên cứu trƣớc đây của Imlay & cs cho thấy H2O2 ở nồng độ thấp cũng có thể gây tổn thƣơng ADN, tạo ra đột biến và gây chết vi khuẩn E. Một trong những cơ chế kháng khuẩn của H2O2 là việc giải phóng ra O2 sau khi bị các enzyme là catalase phân huỷ.
Vì O2 là độc cho các cơ thể kỵ khí nên sự có mặt của O2 là bất lợi cho chúng. Hiệu quả kháng khuẩn của H2O2 tăng lên khi có mặt của các ion kim loại dù ở nồng độ rất thấp nhƣ là Fe2+ và Cu+. Các chất này thúc đẩy sự phân huỷ H2O2 1 thành gốc hydroxyl (OH) thông qua phản ứng Fenton. Hiệu quả của việc kết hợp giữa H2O2 và Fe2+ là làm tăng sự phân huỷ H2O2 cùng với sự hình thành các gốc tự do (ROS).
Nồng độ sử dụng và thời gian tiếp xúc với chất này là những yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả tác dụng của nó (Imlay. 8-Hydroxyquinolin (8HQ) từ lâu đã đƣợc sử dụng nhƣ là một chất tạo phức càng cua với các ion kim loại và có tác dụng ức chế mạnh hàng loạt các quá trình sinh hoá khác nhau. Các dẫn xuất của hợp chất này đã đƣợc sử dụng để để xử lý vi khuẩn và nấm. Một số tác giả cho rằng khả năng gây độc cao của 8HQ là nhờ khả năng tạo phức càng cua với các ion kim loại dẫn đến sự ức chế hàng loạt các quá trình sinh hoá của vi khuẩn/nấm.
Các kết quả nghiên cứu trƣớc đây đã chứng minh chất này có khả năng sinh gốc O2- và đã phát hiện thấy 8HQ có tác dụng gây chết mạnh đối với vi khuẩn Streptoccocus mutans trên mảng bám răng (Nguyễn Thị Mai Phƣơng & cs. Cho đến nay, việc đánh giá tác dụng của các chất này ở dạng kết hợp với ion kim loại chuyển đổi nhƣ Fe2+ hay Cu2+ trên các đối tƣợng vi khuẩn và nấm khác nhau nhằm mục đích ứng dụng còn rất hạn chế. Vì thế, khóa luận này đã chọn vấn đề “Đánh giá tác dụng tăng tính kháng khuẩn/kháng nấm của các chất gây tổn thương oxi hóa ở dạng kết hợp với ion kim loại” với mục đích tìm hiểu khả năng tăng cƣờng tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn của các chất này khi kết hợp với các ion kim loại để định hƣớng ứng dụng trong thực tế làm chất diệt khuẩn hay kháng nấm. Mục đích và yêu cầu 1.
Mục đích Đánh giá đƣợc tác dụng tăng tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất H2O2 và 8HQ ở dạng kết hợp với ion kim loại có khả năng chuyển đổi. Yêu cầu - Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mô hình Streptoccocus mutans của H2O2 dạng đơn lẻ và của H2O2 phối hợp với các ion kim loại - Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mô hình Streptoccocus mutans của 8HQ dạng đơn lẻ và của 8HQ phối hợp với các ion kim loại 2 - Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại trên một số chủng vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) - Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của H2O2 và 8HQ khi kết hợp với ion kim loại trên nấm gây bệnh ngoài da ở ngƣời Trichophyton rubrum 3 PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Chất kháng khuẩn Nhiễm trùng là nguyên nhân quan trọng nhất dẫn đến bệnh tật và gây chết ở ngƣời. Kể từ khi đƣợc phát hiện, các chất kháng khuẩn (CKK) đóng vai trò sống còn trong việc xử lý và chống lại bệnh tật liên quan đến nhiễm trùng.
Các CKK đƣợc xem là một phân nhóm của chất kháng sinh. CKK là một tác nhân gây cản trở sự sinh sản và phát triển của vi khuẩn. Nó thƣờng đƣợc sử dụng để khử trùng bề mặt và loại bỏ vi khuẩn có khả năng gây hại, và có thể tìm thấy chúng trong các sản phẩm nhƣ xà phòng, chất tẩy rửa, các sản phẩm chăm sóc da và sức khỏe và chất tẩy rửa gia dụng. Hiện nay chúng đƣợc sắp xếp thành 5 loại chủ yếu, có vai trò quan trọng khác nhau theo các tiêu chí: i) Theo cơ chế họat động; ii) Theo nguồn thu nhận; iii) Theo phổ hoạt động; iv) Theo cấu trúc hóa học; v) Theo chức năng (nhƣ ức chế sinh tổng hợp thành tế bào; ức chế chức năng màng, ức chế sinh tổng hợp axit nucleic và ức chế sinh tổng hợp protein).
Trong số này, các nhóm CKK phân loại dựa trên cấu trúc hóa học và chức năng đƣợc xem là quan trọng nhất.1 đƣa ra một số ví dụ về chất kháng khuẩn Hình 2.1: Một số ví dụ về các chất kháng khuẩn (Ullah & Ali. Chất kháng nấm Chất kháng nấm là chất có khả năng gây chết hoặc ức chế sựu phát triển của nấm.2 thể hiện cấu trúc của một số chất kháng nấm phổ biến hiện nay. Các chất này đƣợc xếp vào 3 nhóm chính dựa trên cơ chế hoạt động là : i) Azoles là các chất có khả năng ức chế sự sinh tổng hợp ergosterol (một chất sterol chính do nấm sinh tổng hợp); Azoles là một nhóm các hợp chất dị vòng chứa vòng 5 carbon có chứa một nguyên tử nitơ và ít nhất một nguyên tử phi cacbon khác nhƣ một phần của vòng. Azoles ức chế chuyển đổi lanosterol thành ergosterol bằng cách ức chế lanosterol 14α-demethylase.
ii) Polyenes là các chất có khả năng tƣơng tác hóa học với sterol trên màng nấm. Chúng là các phân tử có nhiều liên kết đôi liên hợp. Thuốc kháng nấm polyene là polyene vòng lớn có vùng hydroxyl hóa trên vòng đối diện với hệ thống liên hợp. Điều này làm cho polyene kháng nấm amphiphilic.
Polyene liên kết với sterol trong màng tế bào nấm, chủ yếu là ergosterol. Điều này làm thay đổi nhiệt độ chuyển tiếp (Tg) của màng tế bào, do đó đặt màng ở trạng thái ít lỏng hơn, nhiều tinh thể hơn. Trong những trƣờng hợp bình thƣờng, sterol trong màng làm tăng độ chặt của lớp kép phospholipid làm cho màng sinh chất dày đặc hơn. Kết quả là, sinh chất bên trong của tế bào bao gồm các ion đơn hóa trị (K +, Na +, H + và Cl−) và các phân tử hữu cơ nhỏ bị rò rỉ, dẫn đến tế bào chết.
Tế bào động vật chứa cholesterol thay vì ergosterol nên chúng ít nhạy cảm hơn nhiều. Tuy nhiên, ở liều điều trị, một số amphotericin B có thể liên kết với cholesterol ở màng động vật, làm tăng nguy cơ gây độc cho ngƣời. Amphotericin B gây độc cho thận khi tiêm tĩnh mạch. Khi chuỗi kỵ nƣớc của polyene đƣợc rút ngắn, hoạt tính liên kết sterol của nó đƣợc tăng lên.
Do đó, việc giảm hơn nữa chuỗi kỵ nƣớc có thể dẫn đến việc nó liên kết với cholesterol, làm cho nó trở nên độc đối với động vật. iii) 5-fluorocytosine là các chất có khả năng ức chế sự sinh tổng hợp của các loại đại phân tử [29]. Nó đƣợc sử dụng đặc biệt để kêt hợp cùng với amphotericin B cho các trƣờng hợp nhiễm nấm Candida nghiêm trọng và bệnh cryptococcosis. Nó có thể đƣợc sử dụng một mình hoặc kết hợp với các thuốc chống nấm khác cho bệnh nhiễm sắc tố.2: Cấu trúc của một số chất kháng nấm phổ biến hiện nay (Thomas Albrecht & cs.
Các chất gây tổn thƣơng oxi hóa Trong số các CKK, các chất có khả năng gây tổn thƣơng oxi hóa gần đây đƣợc quan tâm nhiều vì có hoạt tính kháng khuẩn cao. Các chất này có thể tƣơng tác để sinh ra các gốc oxi hoạt động (ROS) và đây là nguyên nhân gây ra những tổn thƣơng oxi hoá trong tế bào (Thomas & Pera. Các ROS có thể gây tổn thƣơng tế bào thông qua các tác động bao gồm các tác động lên AND, protein và lipid tế bào. Các dạng oxi phản ứng (Storz & Imlay.
1999) Dạng ROS Cấu tạo Ký hiệu hoá học Oxi triplet (trạng thái cơ bản) O O O2 Oxi đơn trị O O: O2 Superoxide O O: O2- Perhydroxyl O O: H HO2 Peroxit hydro H2 O2 H : O O : H Hydroxyl HO H : O Nƣớc H2 O H :O : H 2. Tác động của ROS lên ADN Các nghiên cứu cho thấy cả H2O2 và O2 đều không thể gây ra sự đứt gãy các ADN sợi đơn trong điều kiện sinh lý của tế bào. Tác dụng gây tổn thƣơng của chúng với ADN trong cơ thể sống chủ yếu là do kết quả của phản ứng Fenton với sự xúc tác của ion kim loại để hình thành gốc •OH. Gốc này có thể tấn công và gây ra những biến đổi ở bất kỳ gốc bazơ nào.
Gốc hydroxyl cũng tấn công vào các phân tử đƣờng pentose của acid nucleic. Vị trí cacbon 4’ là điểm yếu nhất mà ở đó gốc •OH có thể tách ra một nguyên tử H, dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian nguyên tử ở vị trí cacbon 3’và hệ quả là liên kết phosphodiester với nucleotit liền kề bị đứt gãy.