Phân lập và thiết kế cấu trúc t dna biểu hiện gen osnramp2 liên quan tới quá trình tích lũy kim loại ở lúa

Nghiên cứu về gen OsNRAMP2 ở lúa gạo đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng, đặc… 62 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2022.

• Tác giả: Lê Viết Hùng
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Duy Phương
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsNRAMP2 trong quá trình tích lũy kim loại ở lúa
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
• 1.2.1. Mục đích
• 1.2.2. Yêu cầu
• 1.2.3. Ý nghĩa của đề tài
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. DINH DƯỠNG VI CHẤT Ở LÚA GẠO
• 2.1.1. Một số vi chất quan trọng ở lúa gạo và các gen liên quan
• 2.1.2. Ảnh hưởng của hàm lượng vi chất đến chất lượng lúa gạo
• 2.1.3. Nghiên cứu cải thiện hàm lượng vi chất ở lúa gạo
• 2.2. VAI TRÒ CỦA PROTEIN NRAMP ĐỐI VỚI QUÁ TRÌNH TÍCH LŨY KIM LOẠI Ở THỰC VẬT
• 2.2.1. Đặc tính chức năng của các protein vận chuyển kim loại NRAMP
• 2.2.2. Mô hình điều hòa biểu hiện NRAMP ở thực vật
• 2.2.3. Chức năng của NRAMP ở thực vật
• 3. CHUYỂN GEN THỰC VẬT VÀ HỆ THỐNG VECTOR CHUYỂN GEN
• 3.1. Giới thiệu chung về chuyển gen thực vật
• 3.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens
• 3.2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
• 3.2.2. Cơ chế phân tử của quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
• 3.2.3. Hệ thống vector chuyển gen vào tế bào thực vật
• 4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đối tượng nghiên cứu
• 4.2. Mẫu thực vật và chủng vi sinh vật. Các vector và oligonucleotide
• 4.3. Phương pháp nghiên cứu
• 4.3.1. Các phương pháp chung dùng trong sinh học phân tử
• 4.3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ mô thực vật
• 4.3.1.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn
• 4.3.1.3. Xử lí với enzym cắt giới hạn
• 4.3.1.4. Điện di DNA trên gel agarose 1%
• 4.3.1.5. Tinh sạch DNA từ gel agarose
• 4.3.1.6. Ghép nối DNA bằng T4 DNA ligase
• 4.3.1.7. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn
• 4.3.1.8. Giải trình tự DNA
• 4.3.1.9. Phân lập OsNRAMP2-TBR bằng kĩ thuật PCR
• 4.3.1.10. Nhân dòng OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1
• 4.3.1.11. Thiết kế vector chuyển gen trong tế bào thực vật mang cấu trúc biểu hiện OsNRAMP2-TBR
• 5. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 5.1. PHÂN LẬP GEN OsNRAMP2-TBR TỪ DNA TỔNG SỐ
• 5.1.1. Tách chiết DNA tổng số của lúa TBR225
• 5.1.2. Phân lập OsNRAMP2-TBR bằng kĩ thuật PCR
• 5.1.3. Nhân bản các vùng exon mang trình tự mã hóa của OsNRAMP2-TBR
• 5.1.4. Nhân bản khung đọc mở của OsNRAMP2-TBR
• 5.2. NHÂN DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ OsNRAMP2-TBR
• 5.2.1. Nhân dòng OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1
• 5.2.2. Ghép nối OsNRAMP2-TBR vào vector pJET1
• 5.2.3. Sàng lọc thể biến nạp bằng kĩ thuật PCR trực tiếp khuẩn lạc
• 5.2.4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/OsNRAMP2-TBR
• 5.2.5. Giải trình tự OsNRAMP2-TBR
• 5.3. THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNRAMP2-TBR TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT
• 5.3.1. Ghép nối OsNRAMP2-TBR vào vector pCAM-Ubi
• 5.3.2. Kiểm tra vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR
• 5.3.3. Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tái tổ hợp mang vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR
• 6. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu về Gen OsNRAMP2 ở Lúa Gạo

Nghiên cứu về gen OsNRAMP2 ở lúa gạo đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng, đặc biệt là khả năng tích lũy kim loại. Lúa gạo là nguồn lương thực chính của hàng tỷ người trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Việc tăng cường hàm lượng vi chất dinh dưỡng, đặc biệt là sắt (Fe) và kẽm (Zn), trong gạo là một mục tiêu quan trọng để giải quyết tình trạng thiếu dinh dưỡng vi chất. OsNRAMP2 là một ứng cử viên tiềm năng trong việc cải thiện khả năng hấp thụ và vận chuyển kim loại ở lúa, hứa hẹn mang lại những giống lúa giàu dinh dưỡng hơn. Việc nghiên cứu sâu hơn về chức năng và cơ chế hoạt động của OsNRAMP2 là cần thiết để khai thác tối đa tiềm năng của nó trong việc cải thiện chất lượng lúa gạo. Nghiên cứu này tập trung vào phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsNRAMP2 để phục vụ cho nghiên cứu chức năng gen, hướng tới mục tiêu cải tiến chất lượng cho các giống lúa trong sản xuất bằng công nghệ gen.

1.1. Vai Trò Của Vi Chất Dinh Dưỡng Trong Lúa Gạo

Vi chất dinh dưỡng, bao gồm sắt (Fe), kẽm (Zn), và mangan (Mn), đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển của cây lúa và sức khỏe con người. Fe tham gia vào quá trình hô hấp tế bào, sinh tổng hợp diệp lục, và vận chuyển điện tử quang hợp. Thiếu Fe gây ra tình trạng úa vàng lá non và stress oxy hóa. Zn là đồng yếu tố của hơn 300 enzyme, tham gia vào quá trình chuyển hóa carbohydrate, lipid, protein và axit nucleic. Thiếu Zn gây chậm lớn và rối loạn chức năng miễn dịch. Mn là đồng yếu tố của nhiều enzyme và tham gia vào các quá trình trao đổi chất khác nhau. Thiếu Mn khiến cây dễ bị tổn thương bởi nhiệt độ thấp và nhiễm bệnh. Vì vậy, tăng cường hàm lượng các vi chất này trong lúa gạo có ý nghĩa quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng.

1.2. Protein NRAMP và Quá Trình Tích Lũy Kim Loại

Protein thuộc họ NRAMP (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein) đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển kim loại ở thực vật. Các protein NRAMP đã được chứng minh là có chức năng vận chuyển kim loại chuyển tiếp với tính đặc hiệu rộng. Một số gen OsNRAMP tăng cường sự biểu hiện trong điều kiện xử lý với kim loại như sắt, kẽm. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng OsNRAMP1, AtNRAMP1, 3, 4 và 5 có thể bổ sung cho sự hấp thu Fe ở chủng loại trực tiếp kép men. Các NRAMP khác nhau có thể vận chuyển các kim loại khác nhau. Ví dụ: AtNRAMP1, 3 và 4 đều gây ra cùng mức độ mẫn cảm Cd, AtNRAMP3 và 4 bổ sung cho fet3fet4 với hiệu quả cao hơn AtNRAMP1.

II. Thách Thức Cải Thiện OsNRAMP2 ở Lúa bằng Công Nghệ Gen

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong lúa gạo thông qua công nghệ gen, đặc biệt là thông qua OsNRAMP2, đối mặt với nhiều thách thức. Các gen liên quan đến hấp thụ và vận chuyển kim loại có thể tương tác phức tạp với các gen khác trong cây, khiến việc dự đoán và kiểm soát biểu hiện gen trở nên khó khăn. Hơn nữa, các yếu tố môi trường như loại đất, độ pH, và sự hiện diện của các kim loại khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của việc tăng cường biểu hiện OsNRAMP2. Do đó, cần có các nghiên cứu sâu rộng để hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa biểu hiện gen và tương tác gen-môi trường để phát triển các giống lúa chuyển gen có hàm lượng vi chất dinh dưỡng cao và ổn định.

2.1. Các Yếu Tố Môi Trường Ảnh Hưởng Đến Biểu Hiện Gen

Biểu hiện gen trong thực vật chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các yếu tố môi trường, bao gồm ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, và thành phần dinh dưỡng của đất. Các yếu tố này có thể tác động lên quá trình phiên mã, dịch mã, và ổn định protein. Ví dụ, sự thiếu hụt Fe hoặc Zn có thể kích hoạt các con đường tín hiệu dẫn đến tăng cường biểu hiện của các gen vận chuyển kim loại. Tuy nhiên, sự hiện diện của các kim loại độc hại như cadmium (Cd) cũng có thể cạnh tranh với các kim loại thiết yếu và làm giảm hiệu quả hấp thụ. Do đó, cần phải xem xét kỹ lưỡng các yếu tố môi trường khi thiết kế các chiến lược cải thiện dinh dưỡng thông qua công nghệ gen.

2.2. Phức Tạp Trong Điều Hòa Biểu Hiện Gen OsNRAMP2

Việc điều hòa biểu hiện gen OsNRAMP2 là một quá trình phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố phiên mã, vùng promoter, và các yếu tố điều hòa khác. Các yếu tố phiên mã có thể gắn vào vùng promoter của gen và kích hoạt hoặc ức chế quá trình phiên mã. Vùng promoter có thể chứa các yếu tố cis-acting, là các đoạn DNA ngắn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen. Ngoài ra, các yếu tố điều hòa khác, chẳng hạn như microRNA và các protein liên kết RNA, cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen. Việc hiểu rõ hơn về các cơ chế điều hòa này là rất quan trọng để thiết kế các vector chuyển gen hiệu quả và đạt được mức độ biểu hiện OsNRAMP2 mong muốn.

III. Cách Phân Lập và Nhân Dòng Gen OsNRAMP2 Hiệu Quả

Để nghiên cứu chức năng của gen OsNRAMP2, việc phân lập và nhân dòng gen là bước quan trọng đầu tiên. Quá trình này bao gồm tách chiết DNA tổng số từ mô thực vật, khuếch đại vùng gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR, và chèn đoạn gen vào vector plasmid. Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn phù hợp và ligase DNA giúp tạo ra các plasmid tái tổ hợp chứa gen OsNRAMP2. Sau đó, các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn, và các khuẩn lạc chứa plasmid mong muốn được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR trực tiếp khuẩn lạc và giải trình tự DNA. Việc kiểm tra kỹ lưỡng bằng giải trình tự DNA đảm bảo rằng đoạn gen OsNRAMP2 được phân lập và nhân dòng chính xác.

3.1. Kỹ Thuật PCR Trong Phân Lập Gen OsNRAMP2

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp mạnh mẽ để khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA cụ thể từ DNA tổng số. Để phân lập gen OsNRAMP2, các cặp mồi (primer) được thiết kế đặc hiệu cho vùng gen mong muốn. Phản ứng PCR bao gồm các chu kỳ lặp đi lặp lại của biến tính DNA, gắn mồi, và kéo dài mạch bởi enzyme DNA polymerase. Số lượng bản sao của gen OsNRAMP2 tăng lên theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ, cho phép thu được lượng lớn DNA đủ để thực hiện các bước tiếp theo. Việc thiết kế mồi chính xác và tối ưu hóa các điều kiện PCR là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng.

3.2. Biến Nạp và Sàng Lọc Khuẩn Lạc Tái Tổ Hợp

Sau khi tạo ra plasmid tái tổ hợp chứa gen OsNRAMP2, plasmid này được biến nạp vào tế bào vi khuẩn (thường là E. coli). Quá trình biến nạp giúp nhân bản plasmid trong tế bào vi khuẩn. Sau đó, các khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp được sàng lọc. Kỹ thuật PCR trực tiếp khuẩn lạc là một phương pháp nhanh chóng và hiệu quả để xác định các khuẩn lạc chứa plasmid mong muốn. Giải trình tự DNA là bước cuối cùng để xác nhận rằng plasmid chứa đoạn gen OsNRAMP2 chính xác và không có đột biến.

IV. Thiết Kế Cấu Trúc T DNA Biểu Hiện OsNRAMP2 ở Lúa

Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện OsNRAMP2 là bước quan trọng để chuyển gen vào cây lúa. Cấu trúc T-DNA bao gồm promoter, gen OsNRAMP2, và terminator. Promoter điều khiển quá trình phiên mã của gen, trong khi terminator đánh dấu điểm kết thúc của quá trình phiên mã. Việc lựa chọn promoter phù hợp là rất quan trọng để đạt được mức độ biểu hiện gen mong muốn. Promoter Ubiquitin thường được sử dụng vì nó hoạt động mạnh mẽ và liên tục trong nhiều loại mô thực vật. Cấu trúc T-DNA sau đó được chèn vào vector chuyển gen (thường là vector nhị phân dựa trên Agrobacterium tumefaciens) để chuyển gen vào tế bào thực vật.

4.1. Lựa Chọn Promoter Phù Hợp Để Biểu Hiện OsNRAMP2

Việc lựa chọn promoter phù hợp là yếu tố then chốt để đạt được mức độ biểu hiện OsNRAMP2 mong muốn. Các promoter khác nhau có mức độ hoạt động khác nhau trong các loại mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Promoter cấu thành (constitutive promoter) như Ubiquitin hoạt động liên tục trong nhiều loại mô, trong khi promoter đặc hiệu mô (tissue-specific promoter) chỉ hoạt động trong một số mô nhất định. Promoter cảm ứng (inducible promoter) có thể được kích hoạt bởi các yếu tố môi trường như ánh sáng, nhiệt độ, hoặc hóa chất. Việc lựa chọn promoter phụ thuộc vào mục tiêu cụ thể của nghiên cứu và loại mô mà OsNRAMP2 cần được biểu hiện.

4.2. Sử Dụng Vector Agrobacterium tumefaciens Trong Chuyển Gen

Agrobacterium tumefaciens là một loại vi khuẩn đất có khả năng chuyển gen vào tế bào thực vật một cách tự nhiên. Vi khuẩn này chứa plasmid Ti (Tumor-inducing), trong đó có vùng T-DNA (Transfer DNA) mang các gen cần chuyển. Trong quá trình chuyển gen, T-DNA được cắt ra khỏi plasmid Ti và chuyển vào tế bào thực vật, nơi nó được tích hợp vào bộ gen của cây. Sử dụng vector nhị phân dựa trên Agrobacterium tumefaciens là một phương pháp phổ biến và hiệu quả để chuyển gen OsNRAMP2 vào cây lúa. Vector nhị phân chứa cấu trúc T-DNA mong muốn và các gen cần thiết cho quá trình chuyển gen, giúp vi khuẩn Agrobacterium dễ dàng chuyển gen vào tế bào thực vật.

4.3. Kiểm Tra Vector Tái Tổ Hợp pCAM Ubi OsNRAMP2 TBR

Để đảm bảo tính chính xác của vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR, cần thực hiện các bước kiểm tra chặt chẽ. Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp) được sử dụng để khuếch đại và xác nhận sự hiện diện của gen OsNRAMP2-TBR trong vector. Đồng thời, các enzyme cắt giới hạn được sử dụng để kiểm tra kích thước và vị trí các đoạn DNA trong vector. Cuối cùng, giải trình tự DNA được thực hiện để xác minh trình tự nucleotide của gen OsNRAMP2-TBR và các vùng lân cận. Quá trình này đảm bảo rằng vector tái tổ hợp được tạo ra chính xác và sẵn sàng cho quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu OsNRAMP2 Tạo Giống Lúa Giàu Vi Chất

Nghiên cứu về OsNRAMP2 có tiềm năng lớn trong việc tạo ra các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng. Bằng cách tăng cường biểu hiện OsNRAMP2 trong cây lúa, có thể cải thiện khả năng hấp thụ và vận chuyển sắt và kẽm, từ đó tăng hàm lượng các vi chất này trong hạt gạo. Các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng có thể giúp giải quyết tình trạng thiếu dinh dưỡng vi chất ở các nước đang phát triển, đặc biệt là ở những nơi gạo là nguồn lương thực chính. Việc phát triển các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng là một chiến lược bền vững và hiệu quả để cải thiện sức khỏe cộng đồng.

5.1. Nghiên Cứu Chức Năng Gen OsNRAMP2 Trong Điều Kiện Thực Tế

Sau khi tạo ra các dòng lúa chuyển gen biểu hiện OsNRAMP2, cần thực hiện các nghiên cứu chức năng gen trong điều kiện thực tế. Các nghiên cứu này bao gồm đánh giá khả năng hấp thụ và vận chuyển kim loại của cây, đo hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong hạt gạo, và đánh giá năng suất và chất lượng của cây. Các kết quả từ các nghiên cứu này sẽ giúp xác định hiệu quả của việc tăng cường biểu hiện OsNRAMP2 và cung cấp thông tin quan trọng cho việc phát triển các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng.

5.2. Triển Vọng Ứng Dụng Trong Nông Nghiệp Bền Vững

Việc phát triển các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng có triển vọng ứng dụng lớn trong nông nghiệp bền vững. Các giống lúa này có thể giúp giảm sự phụ thuộc vào phân bón hóa học và cải thiện chất lượng đất. Ngoài ra, việc tăng cường hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong gạo có thể giúp cải thiện sức khỏe của người tiêu dùng và giảm chi phí chăm sóc sức khỏe. Việc kết hợp các kỹ thuật cải thiện dinh dưỡng với các phương pháp canh tác bền vững có thể mang lại lợi ích lớn cho cả nông dân và người tiêu dùng.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu OsNRAMP2

Nghiên cứu về gen OsNRAMP2 hứa hẹn mang lại những giải pháp tiềm năng cho việc cải thiện giá trị dinh dưỡng của lúa gạo. Việc phân lập, nhân dòng, và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện OsNRAMP2 là những bước quan trọng để nghiên cứu chức năng gen và tạo ra các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa biểu hiện gen OsNRAMP2, đánh giá hiệu quả của việc tăng cường biểu hiện gen trong điều kiện thực tế, và phát triển các phương pháp chuyển gen hiệu quả hơn. Việc kết hợp các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại với các phương pháp chọn giống truyền thống có thể giúp đẩy nhanh quá trình tạo ra các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng và đóng góp vào việc cải thiện sức khỏe cộng đồng.

6.1. Đánh Giá Khả Năng Chuyển Gen Thành Công và Biểu Hiện Gen

Sau khi tiến hành biến nạp A. tumefaciens bằng vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR, bước tiếp theo là đánh giá khả năng chuyển gen thành công vào vi khuẩn và mức độ biểu hiện của gen OsNRAMP2-TBR. PCR trực tiếp khuẩn lạc là một phương pháp hiệu quả để xác nhận sự hiện diện của vector trong vi khuẩn. Bên cạnh đó, cần tiến hành phân tích mức độ biểu hiện gen bằng kỹ thuật RT-qPCR để đánh giá hiệu quả của promoter Ubi và đảm bảo rằng gen OsNRAMP2-TBR được biểu hiện ở mức độ mong muốn. Kết quả từ các phân tích này sẽ cung cấp thông tin quan trọng để tối ưu hóa quy trình chuyển gen và đảm bảo rằng hệ thống biểu hiện gen hoạt động hiệu quả.

6.2. Nghiên Cứu Sâu Rộng Về Cơ Chế Điều Hòa Gen OsNRAMP2

Để khai thác tối đa tiềm năng của gen OsNRAMP2 trong việc cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng của lúa gạo, cần có các nghiên cứu sâu rộng về cơ chế điều hòa gen. Các nghiên cứu này có thể bao gồm xác định các yếu tố phiên mã điều hòa biểu hiện gen, phân tích cấu trúc vùng promoter của gen, và đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến biểu hiện gen. Việc hiểu rõ hơn về cơ chế điều hòa gen OsNRAMP2 có thể giúp chúng ta thiết kế các chiến lược hiệu quả hơn để tăng cường biểu hiện gen và tạo ra các giống lúa giàu vi chất dinh dưỡng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực chủ lực nuôi sống khoảng 40% dân số thế giới và là nguồn cung cấp năng lượng chính cho ít nhất 65% dân số toàn cầu. Tại các quốc gia châu Á, lúa gạo chiếm vị trí trọng yếu trong khẩu phần ăn hàng ngày với mức tiêu thụ trung bình từ 180 đến 200 kg/người/năm, cung cấp từ 50% đến 80% tổng lượng calo, protein và khoáng chất. Mặc dù sản lượng lúa toàn cầu đạt khoảng 700 triệu tấn trên diện tích 158 triệu hecta (số liệu năm 2017), tình trạng thiếu hụt vi chất dinh dưỡng—đặc biệt là sắt (Fe) và kẽm (Zn)—vẫn đang là thách thức y tế cộng đồng nghiêm trọng. Hiện tượng này ảnh hưởng đến hơn 2 tỷ người và gây ra hơn 0,8 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn thế giới. Hạt gạo sau xay xát chỉ chứa trung bình khoảng 2 mg Fe/kg và 12 mg Zn/kg, không đáp ứng đủ nhu cầu khuyến nghị hàng ngày từ 10 đến 15 mg Fe/ngày cho cơ thể người.

Nhằm nâng cao chất lượng dinh dưỡng ở lúa gạo, các phương pháp truyền thống như canh tác và lai chọn giống đã được triển khai, song công nghệ di truyền và công nghệ chỉnh sửa hệ gen mở ra hướng tiếp cận trực tiếp vào các con đường chuyển hóa và vận chuyển khoáng chất. Trong hệ thống sinh học thực vật, họ protein NRAMP (Natural Resistance-Associated Macrophage Protein) đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các ion kim loại chuyển tiếp qua màng tế bào và màng không bào. Nhiều nghiên cứu quốc tế đã chứng minh gen OsNRAMP2 ở lúa liên quan mật thiết đến quá trình hấp thu và phân bố sắt. Việc phân lập và xây dựng cấu trúc biểu hiện gen này trên các giống lúa thuần chất lượng cao của Việt Nam là cơ sở nền tảng cho công tác chọn tạo giống lúa giàu vi chất.

Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện tăng cường gen OsNRAMP2 từ giống lúa chủ lực TBR225 nhằm phục vụ nghiên cứu chức năng của gen OsNRAMP2 trong quá trình tích lũy vi chất.

Nhiệm vụ nghiên cứu (theo văn bản):

1. Phân lập gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam.
2. Nhân dòng và giải trình tự gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam.
3. Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Gen OsNRAMP2 mã hóa protein vận chuyển kim loại của giống lúa TBR225.
• Vật liệu thực nghiệm: Mẫu lá lúa TBR225 3 tuần tuổi (do Công ty Cổ phần Tập đoàn Giống cây trồng Thái Bình cung cấp), chủng vi khuẩn Escherichia coli DH5α, chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404, vector tạo dòng pJET1.2/blunt và vector chuyển gen thực vật pCAM-Ubi.
• Địa điểm và thời gian: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Bệnh học Phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, hoàn thành vào tháng 3 năm 2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và mô hình sinh học

• Dinh dưỡng vi chất và vai trò của NRAMP: Các nguyên tố Fe, Zn và Mn là co-factor thiết yếu cho hơn 300 enzyme chuyển hóa, quang hợp và hô hấp. Protein họ NRAMP là nhóm chất vận chuyển kim loại có tính đặc hiệu rộng. Ở lúa, OsNRAMP2 biểu hiện ưu tiên ở chồi và tham gia điều hòa cân bằng nội môi kim loại.
• Hệ thống chuyển gen gián tiếp qua Agrobacterium tumefaciens: Vi khuẩn A. tumefaciens mang Ti-plasmid (kích thước khoảng 200 kb) có khả năng chuyển vùng T-DNA vào hệ gen thực vật. Quá trình chuyển nạp được điều khiển bởi vùng độc lực (Vir region, dài khoảng 40 kb) mã hóa các protein Vir (VirA, VirB, VirC, VirD1-2, VirE1-2, VirG, VirH, VirF, VirJ). Đoạn T-DNA được định giới bởi hai trình tự lặp lại 25 bp (Right Border - RB và Left Border - LB).
• Hệ thống vector biểu hiện thực vật: Nghiên cứu sử dụng vector nhị phân pCAM-Ubi (phát triển từ khung vector pCAMBIA1301). Cấu trúc biểu hiện đặt dưới sự kiểm soát của promoter hoạt động liên tục Ubiquitin và tín hiệu kết thúc phiên mã Nos terminator, đảm bảo gen mục tiêu được phiên mã mạnh trong tế bào thực vật.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng đồng bộ các kỹ thuật sinh học phân tử chuẩn mực:

1. Tách chiết DNA tổng số: Thực hiện từ mô lá lúa TBR225 theo phương pháp Doyle và cộng sự (1990) bằng dung dịch CTAB 2%, tinh sạch qua Chloroform : Isoamylalcohol (24:1) và kết tủa bằng Isopropanol, xử lý RNase A để loại bỏ RNA.
2. Kỹ thuật Nested-PCR (PCR lồng): Sử dụng để khuếch đại các đoạn exon trực tiếp từ DNA tổng số và lắp ghép khung đọc mở (ORF) hoàn chỉnh của OsNRAMP2-TBR.
3. Cắt và nối DNA tái tổ hợp: Sử dụng các enzyme cắt giới hạn Type II (BsaI, BglII, BamHI, HindIII, EcoRI) và enzyme T4 DNA ligase.
4. Biến nạp vi khuẩn:
   • Biến nạp vào E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt (42°C trong 50 giây).
   • Biến nạp vào A. tumefaciens LBA4404 bằng phương pháp sốc lạnh trong nitơ lỏng (5 phút) và sốc nhiệt (37°C trong 5 phút).
5. Điện di và tinh sạch: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (nhuộm Ethidium Bromide 50 µg/µl trong đệm TAE 1X, điện thế 15 V/cm). Tinh sạch sản phẩm PCR và plasmid bằng bộ kit GeneJET Gel Extraction và GeneJET Plasmid Miniprep (Thermo Fisher Scientific).
6. Giải trình tự nucleotide: Thực hiện theo phương pháp Sanger trên hệ thống máy ABI3100 (Smith et al., 1986); dữ liệu được phân tích bằng phần mềm BioEdit 4.0 và Genetyx.

Tên mồi	Trình tự mồi (5’ – 3’)	Mục đích sử dụng
BglII E1-F	AGATCTCCCATCCATTTCTTCCCACT	Nhân bản Exon 1 vòng 1 và vòng 2; PCR nối khung đọc mở
E1-R	AAGGAAAGCCTCGTTCGTTC	Nhân bản Exon 1 vòng 1
BsaI E1-R	AACTCGGGTCTCCGCAATCGAACGCGGTGATGACG	Nhân bản Exon 1 vòng 2 (bổ sung vị trí cắt BsaI)
E2-F	TTTCCTGTCTGTTTCTGCTGT	Nhân bản Exon 2-3 vòng 1
E3-R	TGACCTAAAACAGCAAATGGAGT	Nhân bản Exon 2-3 vòng 1
BsaI E2-F	AACTCGGGTCTCCTTGCTTCATCTTTTTATTCCTGGAGA	Nhân bản Exon 2 vòng 2
BsaI E2-R	AACTCGGGTCTCCACCAATCAGAAGGTCCTTGC	Nhân bản Exon 2 vòng 2
BsaI E3-F	AACTCGGGTCTCCTGGTTTGGTGGTTCCAAAGTT	Nhân bản Exon 3 vòng 2
BsaI E3-R	AACTCGGGTCTCCACTTTTGTGATAGGACCAACCA	Nhân bản Exon 3 vòng 2
E4-F	GCAAGGGTAGGCTGTTAACTTT	Nhân bản Exon 4 vòng 1
E4-R	CCGATAAGGGAATTGTCCTG	Nhân bản Exon 4 vòng 1
BsaI E4-F	AACTCGGGTCTCCAAGTGATTAGCTGGATTGTTACAG	Nhân bản Exon 4 vòng 2
BglII E4-R	AGATCTTCATGTGCTCTTTGTCATTGC	Nhân bản Exon 4 vòng 2; PCR nối khung đọc mở
pJET-F	CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC	Kiểm tra plasmid pJET1.2 tái tổ hợp
pJET-R	AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG	Kiểm tra plasmid pJET1.2 tái tổ hợp
Ubi-F	CCCTGCCTTCATACGCTATT	Kiểm tra cấu trúc pCAM-Ubi tái tổ hợp
Nos-R	AGACCGGCAACAGGATTCAA	Kiểm tra cấu trúc pCAM-Ubi tái tổ hợp

---

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả trình bày tổng quan về tầm quan trọng của cây lúa trong an ninh lương thực toàn cầu, thực trạng "nạn đói tiềm ẩn" do thiếu sắt và kẽm ở các nước đang phát triển. Giới thiệu tiềm năng của gen OsNRAMP2 trong việc nâng cao hàm lượng kim loại ở lúa và xác định mục tiêu phân lập, thiết kế cấu trúc biểu hiện gen này trên giống lúa TBR225 nhằm phục vụ công tác cải tạo di truyền.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp cơ sở lý luận học thuật chia thành ba nhóm nội dung:

1. Dinh dưỡng vi chất ở lúa gạo: Phân tích nhu cầu sinh lý của Fe, Zn, Mn đối với cây trồng và con người; các bệnh lý do thiếu hụt vi chất; đánh giá các hướng tiếp cận nâng cao vi chất từ canh tác, lai giống đến chuyển gen và chỉnh sửa hệ gen tại Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI).
2. Vai trò của protein NRAMP đối với quá trình tích lũy kim loại ở thực vật: Mô tả cấu trúc và đặc tính chức năng của họ protein NRAMP từ các nghiên cứu bổ khuyết đột biến trên nấm men (Saccharomyces cerevisiae đột biến fet3fet4, smf1, zrt1zrt2) và cây mô hình Arabidopsis thaliana; phân tích mô hình điều hòa biểu hiện theo mô (rễ, chồi) và cơ chế đồng vận chuyển kim loại với proton.
3. Chuyển gen thực vật và hệ thống vector chuyển gen: Cơ chế lây nhiễm tự nhiên của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, vai trò của plasmid Ti, các cụm gen vir, cơ chế hình thành và vận chuyển phức hệ T-DNA-protein (VirD2, VirE2, VirD4, VirB) vào nhân tế bào thực vật; nguyên lý cấu tạo của hệ vector nhị phân (binary vector).

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết nguồn gốc vật liệu sinh học, hóa chất, thiết bị và các quy trình thao tác kỹ thuật:

• Phương pháp tách chiết DNA tổng số cây lúa và tách chiết plasmid vi khuẩn.
• Thiết kế hệ thống mồi đặc hiệu và quy trình 3 vòng PCR (vòng 1 nhân cụm exon, vòng 2 nhân exon đơn lẻ gắn vị trí enzyme BsaI/BglII, vòng 3 nhân khung đọc mở 1,7 kb).
• Quy trình tạo dòng trên vector pJET1.2/blunt, chọn lọc trên môi trường ampicillin dựa vào cơ chế bất hoạt gen gây độc eco47IR.
• Quy trình thiết kế vector biểu hiện thực vật pCAM-Ubi bằng kỹ thuật cắt ghép tương thích giữa vị trí BglII của gen và vị trí BamHI trên vector, biến nạp vào A. tumefaciens LBA4404 và sàng lọc bằng colony PCR trên môi trường kháng sinh (Kanamycin 50 µg/ml, Streptomycin 50 µg/ml, Rifampicin 20 µg/ml).

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương kết quả thể hiện toàn bộ dữ liệu thực nghiệm qua 4 giai đoạn logic:

1. Phân lập gen OsNRAMP2-TBR225 từ DNA tổng số

• Tách chiết thành công DNA tổng số từ lá lúa TBR225, kết quả điện di cho thấy phân tử DNA nguyên vẹn, không đứt gãy, không nhiễm RNA.
• PCR vòng 1 khuếch đại thành công 3 phân đoạn DNA mang kích thước lý thuyết: 0,8 kb (chứa exon 1 - 790 bp), 0,3 kb (chứa exon 2 và 3 - 310 bp), và 0,7 kb (chứa exon 4 - 667 bp).
• PCR vòng 2 nhân bản chính xác 4 vùng exon riêng biệt: E1 (137 bp / ~0,2 kb), E2 (653 bp / ~0,6 kb), E3 (310 bp / ~0,3 kb), và E4 (667 bp / ~0,6 kb).
• Xử lý 4 mảnh exon bằng enzyme BsaI tạo các đầu dính bổ sung, nối bằng T4 DNA ligase và thực hiện PCR vòng 3 với cặp mồi BglII E1-F / BglII E4-R, thu được một băng DNA duy nhất kích thước khoảng 1,7 kb (tương ứng kích thước lý thuyết 1767 bp).

2. Nhân dòng và giải trình tự OsNRAMP2-TBR

• Sản phẩm PCR 1,7 kb được ghép nối vào vector pJET1.2/blunt và biến nạp vào E. coli DH5α.
• Sàng lọc khuẩn lạc bằng colony PCR với mồi BglII E1-F / BglII E4-R cho thấy 100% khuẩn lạc được kiểm tra đều xuất hiện phân đoạn DNA 1,7 kb.
• Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pJET/OsNRAMP2-TBR bằng PCR với 3 cặp mồi thu được các băng DNA đặc hiệu: mồi pJET-F/pJET-R (1,9 kb), BglII E1-F/BglII E4-R (1,7 kb), BsaI E2-F/BsaI E3-R (0,9 kb). Cắt kiểm tra bằng enzyme BglII giải phóng 2 băng DNA: 3,0 kb (khung vector pJET1.2) và 1,7 kb (đoạn chèn OsNRAMP2-TBR).
• Kết quả giải trình tự nucleotide và căn gióng bằng phần mềm BioEdit cho thấy trình tự OsNRAMP2-TBR có chiều dài chính xác 1767 bp, đạt độ tương đồng 97,3% so với trình tự chuẩn của giống lúa Nipponbare trên GenBank (mã số truy cập XM_015777087).

3. Thiết kế vector biểu hiện OsNRAMP2-TBR trong tế bào thực vật

• Cắt vector pJET/OsNRAMP2-TBR bằng BglII (thu đoạn chèn 1,7 kb) và cắt mở vòng vector pCAM-Ubi bằng BamHI (thu khung vector 11 kb). Do BglII và BamHI tạo đầu dính tương thích (GATC), hai phân đoạn được ghép nối bằng T4 DNA ligase tạo vector tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR.
• Kiểm tra cấu trúc plasmid tinh sạch bằng colony PCR và cắt giới hạn bằng hệ enzyme HindIII / EcoRI xác nhận đoạn gen đã chèn thành công theo đúng định hướng dưới promoter Ubiquitin.

4. Tạo chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 tái tổ hợp

• Biến nạp vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR vào tế bào khả biến A. tumefaciens LBA4404.
• Sàng lọc khuẩn lạc trên môi trường LB bổ sung kháng sinh chọn lọc bằng PCR trực tiếp khuẩn lạc với cặp mồi Ubi-F / Nos-R, khẳng định vi khuẩn mang cấu trúc chuyển gen ổn định, bảo quản thành công chủng giống ở -80°C trong glycerol 50%.

---

Kết quả và đóng góp của nghiên cứu

Kết quả định lượng chính thu được

• Phân lập thành công khung đọc mở hoàn chỉnh của gen OsNRAMP2 từ DNA tổng số của giống lúa thuần TBR225 bằng chiến lược PCR lồng 3 vòng ghép nối 4 exon riêng biệt (Exon 1: 137 bp; Exon 2: 653 bp; Exon 3: 310 bp; Exon 4: 667 bp).
• Xác định cấu trúc phân tử của đoạn gen phân lập có chiều dài 1767 bp, tương đồng 97,3% với trình tự OsNRAMP2 của giống lúa chuẩn Nipponbare (GenBank: XM_015777087).
• Xây dựng thành công vector tạo dòng trung gian pJET/OsNRAMP2-TBR (kích thước tổng cộng ~4,7 kb) và vector biểu hiện thực vật pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR (kích thước ~12,7 kb) chứa promoter Ubiquitin và Nos terminator.
• Biến nạp thành công vector biểu hiện vào chủng vi khuẩn chuyển gen Agrobacterium tumefaciens LBA4404 và xác nhận dương tính bằng kỹ thuật PCR trực tiếp khuẩn lạc.

Thông số / Cấu trúc	Kết quả thực nghiệm trong nghiên cứu
Kích thước khung đọc mở gen OsNRAMP2-TBR	1767 bp (~1,7 kb)
Độ tương đồng nucleotide với mã số XM_015777087	97,3%
Kích thước các exon thành phần	E1: 137 bp; E2: 653 bp; E3: 310 bp; E4: 667 bp
Vector tạo dòng trung gian	pJET1.2/blunt (2974 bp) mang đoạn chèn 1,7 kb
Khung vector biểu hiện thực vật	pCAM-Ubi (~11 kb), vị trí chèn BamHI
Promoter điều khiển phiên mã	Ubiquitin promoter (hoạt động liên tục)
Chủng vi khuẩn biểu hiện tạo thành	A. tumefaciens LBA4404 mang pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR

Đóng góp của đề tài

• Đóng góp học thuật và phương pháp: Đề xuất và thực nghiệm thành công phương pháp phân lập gen có cấu trúc gián đoạn (chứa nhiều intron) trực tiếp từ DNA tổng số bằng kỹ thuật PCR lồng kết hợp xử lý enzyme cắt giới hạn Type II (BsaI) tạo đầu dính định hướng. Phương pháp này khắc phục khó khăn khi không thể thu nhận mẫu RNA chất lượng cao hoặc gen có mức độ biểu hiện tự nhiên thấp để tổng hợp cDNA.
• Đóng góp thực tiễn: Tạo ra nguồn vật liệu di truyền chuẩn xác và chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tái tổ hợp mang cấu trúc T-DNA hoàn chỉnh, sẵn sàng phục vụ cho các nghiên cứu chuyển gen vào mô sẹo lúa TBR225 nhằm tạo dòng lúa tăng cường hấp thu và tích lũy vi chất sắt/kẽm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp theo

• Hạn chế của nghiên cứu: Nghiên cứu mới dừng lại ở giai đoạn tạo dòng, giải trình tự và thiết kế vector biểu hiện thực vật trong vi khuẩn A. tumefaciens. Đề tài chưa tiến hành các bước nuôi cấy mô sẹo lúa TBR225, chưa chuyển gen vào tế bào thực vật, chưa tái sinh cây chuyển gen in vitro và chưa phân tích kiểu hình sinh lý hay định lượng hàm lượng kim loại tích lũy trong hạt lúa thực tế.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo:
  1. Sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mang vector pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR đã tạo ra để biến nạp vào mô sẹo (callus) của giống lúa TBR225.
  2. Chọn lọc mô chuyển gen trên môi trường bổ sung hygromycin, tái sinh chồi và rễ để tạo cây lúa chuyển gen hoàn chỉnh thế hệ T0.
  3. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen OsNRAMP2 ở các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật RT-qPCR hoặc Northern blot; phân tích định lượng hàm lượng sắt và kẽm trong thân, lá và hạt gạo bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) hoặc ICP-MS.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị cao cho:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Di truyền học Thực vật và Khoa học Cây trồng.
• Các nhóm nghiên cứu về công nghệ gen thực vật: Cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về kỹ thuật lắp ghép exon nối tiếp bằng enzyme BsaI từ DNA hệ gen, kỹ thuật thiết kế vector chuyển gen nhị phân dựa trên hệ pCAMBIA mang promoter Ubiquitin, và phương pháp biến nạp, sàng lọc cấu trúc tái tổ hợp trên chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại phân lập gen OsNRAMP2 từ DNA tổng số bằng cách nhân bản từng đoạn exon thay vì khuếch đại từ cDNA tổng hợp từ mRNA? Trong trường hợp gen biểu hiện ở mức độ thấp, biểu hiện đặc thù theo mô/giai đoạn phát triển hoặc khó khăn trong việc thu nhận RNA nguyên vẹn từ mẫu lá, việc phân lập từng exon từ DNA tổng số (vốn có cấu trúc bền vững hơn RNA) bằng Nested-PCR rồi xử lý cắt nối bằng enzyme cắt giới hạn BsaI là giải pháp thay thế hiệu quả để thu nhận khung đọc mở chính xác mà không phụ thuộc vào trạng thái phiên mã của mô.

2. Vai trò của enzyme cắt giới hạn BsaI trong quá trình nối các đoạn exon của gen OsNRAMP2-TBR là gì? BsaI là enzyme cắt giới hạn thuộc nhóm Type IIS có vị trí cắt nằm ngoài trình tự nhận biết. Khi thiết kế vị trí nhận biết BsaI ở đầu mồi PCR vòng 2, sau khi xử lý cắt bằng BsaI, các mảnh DNA exon (E1, E2, E3, E4) sẽ bị loại bỏ hoàn toàn trình tự nhận biết của enzyme và giải phóng các đầu dính nhô đơn sợi đặc hiệu bổ sung chính xác với nhau, cho phép nối các exon lại đúng trật tự tự nhiên bằng T4 DNA ligase.

3. Làm thế nào để nối đoạn gen OsNRAMP2-TBR cắt bởi BglII vào vector pCAM-Ubi chỉ có vị trí nhận biết BamHI? Hai enzyme cắt giới hạn BglII (nhận biết trình tự A^GATCT) và BamHI (nhận biết trình tự G^GATCC) khi cắt đều tạo ra các đầu dính nhô 5’ có trình tự tương thích hoàn toàn là 5’-GATC-3’. Do đó, đoạn gen OsNRAMP2-TBR được giải phóng bằng BglII có thể ghép nối trực tiếp vào vị trí BamHI đã mở vòng trên vector pCAM-Ubi dưới tác dụng của enzyme T4 DNA ligase.

4. Mức độ tương đồng giữa gen OsNRAMP2 phân lập từ giống lúa TBR225 và trình tự công bố trên GenBank là bao nhiêu? Trình tự nucleotide của đoạn gen OsNRAMP2-TBR dài 1767 bp phân lập từ giống lúa TBR225 đạt độ tương đồng 97,3% khi so sánh với trình tự tham chiếu của gen OsNRAMP2 thuộc giống lúa Nipponbare đã công bố trên Ngân hàng Gen Thế giới (GenBank, mã số truy cập XM_015777087).

5. Cơ chế chọn lọc plasmid tái tổ hợp trên vector pJET1.2/blunt hoạt động như thế nào? Vector thương mại pJET1.2/blunt chứa gen chỉ thị eco47IR mã hóa enzyme giới hạn gây độc chết tế bào chủ E. coli. Khi phản ứng ghép nối thành công, đoạn gen ngoại lai chèn vào vùng đa điểm cắt sẽ làm bất hoạt gen eco47IR. Do đó, chỉ các tế bào vi khuẩn nhận được plasmid tái tổ hợp mang đoạn chèn mới có khả năng sống sót và hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy chứa ampicillin.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Lê Viết Hùng đã hoàn thành trọn vẹn các mục tiêu nghiên cứu đặt ra trong việc phân lập thành công khung đọc mở hoàn chỉnh của gen OsNRAMP2 (1767 bp) từ giống lúa thuần TBR225 với độ tương đồng 97,3% so với trình tự chuẩn quốc tế. Tác giả đã thiết kế thành công vector tạo dòng trung gian pJET/OsNRAMP2-TBR và vector biểu hiện thực vật tái tổ hợp pCAM-Ubi/OsNRAMP2-TBR đặt dưới sự điều hòa của promoter Ubiquitin. Toàn bộ cấu trúc tái tổ hợp đã được xác nhận chuẩn xác bằng các kỹ thuật PCR, cắt enzyme giới hạn, giải trình tự Sanger và được chuyển nạp ổn định vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Kết quả này tạo tiền đề khoa học và cung cấp nguồn vật liệu kỹ thuật di truyền trực tiếp phục vụ các giai đoạn chuyển gen vào giống lúa TBR225 nhằm cải thiện hàm lượng vi chất dinh dưỡng trong nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lƣơng thực chính của nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới, nó có vai trò rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Khoảng 40% dân số trên thế giới sống bằng lúa gạo, sử dụng lúa gạo làm nguồn lƣơng thực chính, 25% sử dụng lúa gạo trên 1/2 khẩu phần thức ăn hằng ngày. Lúa gạo có ảnh hƣởng tới ít nhất 65% dân số thế giới, sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nƣớc châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180-200 kg/ngƣời, còn châu Mỹ, châu Âu khoảng 100 kg/ngƣời. Hiện nay, hiện tƣợng thiếu vi chất dinh dƣỡng trong khẩu phần ăn đang là một vấn đề đƣợc quan tâm, đặc biệt ở các nƣớc sử dụng gạo làm lƣơng thực chính.

Việc nâng cao dinh dƣỡng cho gạo cũng nhƣ các lƣơng thực khác là một vấn đề cấp thiết để đảm bảo an ninh lƣơng thực có chất lƣợng. Các nghiên cứu nâng cao giá trị dinh dƣỡng của gạo đã đƣợc thực hiện từ cách đây gần 20 năm, bƣớc đầu bằng các biện pháp canh tác cho đến phƣơng pháp chọn giống, lai truyền thống và đến nay là áp dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen. Một số định hƣớng nghiên cứu đang bắt đầu đƣợc triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm: tạo các dòng lúa chứa đồng thời nhiều sắt, kẽm và beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lƣợng kẽm cao, lúa không chuyển gen có hàm lƣợng sắt cao,… (http:///www. Gần đây, nhóm nhà khoa học tại Trung Quốc đã có những kết quả trong việc nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cƣờng tích lũy vi chất dinh dƣỡng ở thực vật đƣợc công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới.

Các gen đã đƣợc nhóm nghiên cứu chứng minh chức năng liên quan đến hấp thu và vận chuyển lần lƣợt sắt và kẽm. Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc chọn bao gồm gen tiềm năng OsNramp2. OsNramp2 bƣớc đầu đã đƣợc nhóm nghiên cứu chứng minh có chức năng liên quan đến hấp thu và vận chuyển sắt. Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng 1 nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lƣợng cao vi chất dinh dƣỡng.

Trên thế giới, việc nghiên cứu cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học đã đƣợc phát triển mạnh mẽ nhờ vào các kỹ thuật tiên tiến trên cơ sở phát huy và ứng dụng các nghiên cứu cơ bản. Từ các thực tế trên, chúng tôi sẽ tiến hành đề tài “Phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsRMAMP2 liên quan tới quá trình tích lũy kim loại ở lúa” để phục vụ cho nghiên cứu chức năng của gen OsRMAMP2, từ đó hƣớng tới mục tiêu cải tiến chất lƣợng cho các giống lúa trong sản xuất bằng công nghệ gen trong tƣơng lai. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Mục đích Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện tăng cƣờng OsNRAMP2 của giống lúa TBR225 để phục vụ nghiên cứu chức năng của OsNRAMP2.2 Yêu cầu Đề tài gồm các yêu cầu chính nhƣ sau: - Phân lập gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam - Nhân dòng và giải trình tự gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam - Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam 2.3 Ý nghĩa của đề tài - Xác định đƣợc đặc điểm trình tự OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại của giống lúa chủ lực TBR225. 2 - Thiết kế đƣợc vector biểu hiện cấu trúc biểu hiện gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại để phục vụ nghiên cứu chức năng gen và công tác chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. DINH DƢỠNG VI CHẤT Ở LÚA GẠO 1.1 Một số vi chất quan trọng ở lúa gạo và các gen liên quan Gạo chiếm một phần quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển ở Châu Á, cung cấp 50–80% lƣợng calo hàng ngày, protein, khoáng chất và vitamin, v. Sản lƣợng gạo toàn cầu hàng năm là 700 triệu tấn đƣợc sản xuất trên diện tích 158 triệu ha vào năm 2017. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa phải tăng thêm 8-10 triệu tấn mỗi năm và có động lực mạnh mẽ để nâng cao giá trị dinh dƣỡng với nhiều vitamin và khoáng chất cần thiết đáp ứng nhu cầu lƣơng thực và dinh dƣỡng của dân số.

Các vi chất dinh dƣỡng không chỉ cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng mà còn không thể thiếu đối với sức khỏe con ngƣời và động vật. Các chất vi lƣợng nhƣ Fe và Zn rất cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của cả thực vật và động vật. Thiếu Fe dẫn đến thiếu máu và cũng đƣợc báo cáo là có hậu quả bệnh l. Thiếu Zn gây chậm lớn, thiểu năng sinh dục, rối loạn chức năng miễn dịch và suy giảm nhận thức.

Thiếu Fe và Zn là một trong những tình trạng thiếu vi chất dinh dƣỡng phổ biến nhất ở ngƣời, ảnh hƣởng đến hai tỷ ngƣời và gây ra hơn 0,8 triệu ca tử vong hàng năm (Bashir et al. Lƣợng Fe và Zn đƣợc khuyến nghị cho con ngƣời là 15 mg mỗi ngày. Tuy nhiên, điều này hiếm khi đƣợc đáp ứng bởi chế độ ăn dựa trên gạo đƣợc tiêu thụ ở ngƣời dân Châu Á. Gạo đánh bóng chứa trung bình chỉ có 2 mg Fe/kg gạo và 12 mg Zn/kg gạo, trong khi lƣợng Fe đƣợc khuyến nghị trong chế độ ăn uống cho ngƣời là 10–15 mg; trẻ sơ sinh, trẻ em và thanh thiếu niên cần nhiều Fe hơn vì chúng đang phát triển nhanh chóng; phụ nữ mang thai cần đủ Fe cho bản thân và thai nhi đang lớn, và đây là đặc biệt đúng vào cuối thai kỳ khi em bé đang phát triển nhanh chóng nhất; và những phụ nữ hành kinh cần nhiều Fe hơn do mất máu.

Zn đóng vai trò là đồng yếu tố của hơn 300 enzym tham gia vào quá trình chuyển 4 hóa carbohydrate, lipid, protein và axit nucleic, do đó tầm quan trọng của nó đối với sự tăng trƣởng và phát triển bình thƣờng của động thực vật.2 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vi chất đến chất lƣợng lúa gạo Fe, Zn và Mn là những vi chất rất cần thiết cho cây trồng. Fe tham gia vào các sự kiện tế bào khác nhau nhƣ hô hấp, sinh tổng hợp diệp lục và vận chuyển điện tử quang hợp. Hàm lƣợng diệp lục thấp (úa) của lá non là triệu chứng dễ thấy nhất của thiếu Fe (Marschner, 1995). Thiếu Fe dƣờng nhƣ cũng gây ra stress oxy hóa (Tewari et al., 2005; Bashir et al.

Fe cần thiết cho chức năng của lục lạp và ti thể. Fe đƣợc vận chuyển đến ti thể thông qua chất vận chuyển Fe trong ti thể (Bashir et al. Fe bổ sung có thể đƣợc chuyển hƣớng sang không bào (Kim et al., 2006; Zhang et al. Ở lúa, chất vận chuyển Fe trong không bào 1 (OsVIT1) và OsVIT2 đƣợc cho là đóng một vai trò quan trọng trong chất vận chuyển Fe dƣới tế bào (Zhang et al.

Zn đóng các vai trò đa dạng trong các quá trình tế bào khác nhau (Ishimaru et al. Sự chuyển hóa protein, axit nucleic, carbohydrate và lipid phụ thuộc rất nhiều vào Zn (Rhodes and Klug, 1993; Vallee and Falchuk, 1993). Sự hấp thụ Zn phải chặt chẽ đƣợc điều chỉnh để đảm bảo rằng lƣợng Zn chính xác luôn có mặt tại mọi thời điểm (Ishimaru et al. Ở thực vật, sự thiếu hụt Zn dẫn đến sự tích tụ tinh bột và các RNase không hoạt động, cho thấy rằng sự phân hủy RNA có thể đƣợc điều chỉnh bởi sự sẵn có của Zn trong tế bào (Suzuki et al.

Mn đóng vai trò là đồng yếu tố hoặc chất hoạt hóa của các enzym với các nhóm chức năng khác nhau và hoạt động đa dạng. Cây trồng thiếu Mn dễ bị stress nhiệt độ thấp và nhiễm mầm bệnh, dẫn đến năng suất cây trồng giảm đáng kể (Marschner, 1995; Hebbern và cộng sự, 2005). Sự vận chuyển Mn đƣợc cho là có chung một con đƣờng xâm nhập với Fe và cadimi (Cd). Sự vận chuyển Fe, Zn và Mn chồng chéo lên nhau trong hệ thống sinh học của thực vật, sự thiếu hụt Fe, Zn và Mn đặc biệt nghiêm trọng khi cây trồng trong đất kiềm.

Vì đất kiềm chiếm khoảng 30% 5 đất canh tác trên thế giới, sự phát triển của các loài thực vật có thể sinh trƣởng trong những loại đất này có thể mang lại lợi ích to lớn cho nông nghiệp. Hơn nữa, thực vật tích lũy nhiều vi chất dinh dƣỡng hơn (ví dụ, Fe, Zn và Mn) sẽ góp phần đáng kể vào việc chống lại sự thiếu hụt vi chất dinh dƣỡng ở ngƣời.3 Nghiên cứu cải thiện hàm lƣợng vi chất ở lúa gạo Chất lƣợng lúa gạo không phải lúc nào cũng dễ xác định vì nó phụ thuộc vào ngƣời tiêu dùng và mục đích sử dụng của lúa gạo. Gần đây, nhu cầu của ngƣời tiêu dùng về gạo chất lƣợng tốt hơn đã tăng lên, các nƣớc xuất khẩu đang cố gắng trở thành nhà xuất khẩu gạo lớn và do đó có nhiều áp lực đối với các nhà sản xuất và chế biến để sản xuất ra gạo chất lƣợng tốt hơn. Hàm lƣợng vi chất dinh dƣỡng trong gạo cũng đã đƣợc quan tâm nhiều hơn (Rice knowledge Bank, 2021).

Từ khoảng 20 năm trƣớc, để cải thiện giá trị dinh dƣỡng ở lúa gạo, các nhà nghiên cứu đã sử dụng tới các biện pháp canh tác, phƣơng pháp chọn giống lai truyền thống. Hiện nay phƣơng pháp chủ yếu là sử dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen. Một số định hƣớng nghiên cứu đang bắt đầu đƣợc triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm: tạo dòng lúa chứa Fe, Zn, beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lƣợng cao, lúa không chuyển gen có hàm lƣợng Fe cao. Tăng cƣờng sinh học cho cây trồng thông qua chăn nuôi cũng là một chiến lƣợc bền vững và hiệu quả để giải quyết tình trạng suy dinh dƣỡng vi chất dinh dƣỡng cho ngƣời dân sống ở các nƣớc đang phát triển không đủ khả năng mua thực phẩm tăng cƣờng Fe và Zn, bằng cách bổ sung vi chất Fe và Zn vào khẩu phần ăn chủ yếu của họ (Kumari et al.