ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lƣơng thực chính của nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới, nó có vai trò rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Khoảng 40% dân số trên thế giới sống bằng lúa gạo, sử dụng lúa gạo làm nguồn lƣơng thực chính, 25% sử dụng lúa gạo trên 1/2 khẩu phần thức ăn hằng ngày. Lúa gạo có ảnh hƣởng tới ít nhất 65% dân số thế giới, sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nƣớc châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180-200 kg/ngƣời, còn châu Mỹ, châu Âu khoảng 100 kg/ngƣời. Hiện nay, hiện tƣợng thiếu vi chất dinh dƣỡng trong khẩu phần ăn đang là một vấn đề đƣợc quan tâm, đặc biệt ở các nƣớc sử dụng gạo làm lƣơng thực chính.
Việc nâng cao dinh dƣỡng cho gạo cũng nhƣ các lƣơng thực khác là một vấn đề cấp thiết để đảm bảo an ninh lƣơng thực có chất lƣợng. Các nghiên cứu nâng cao giá trị dinh dƣỡng của gạo đã đƣợc thực hiện từ cách đây gần 20 năm, bƣớc đầu bằng các biện pháp canh tác cho đến phƣơng pháp chọn giống, lai truyền thống và đến nay là áp dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen. Một số định hƣớng nghiên cứu đang bắt đầu đƣợc triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm: tạo các dòng lúa chứa đồng thời nhiều sắt, kẽm và beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lƣợng kẽm cao, lúa không chuyển gen có hàm lƣợng sắt cao,… (http:///www. Gần đây, nhóm nhà khoa học tại Trung Quốc đã có những kết quả trong việc nghiên cứu các gen liên quan đến tăng cƣờng tích lũy vi chất dinh dƣỡng ở thực vật đƣợc công bố trên các tạp chí uy tín trên thế giới.
Các gen đã đƣợc nhóm nghiên cứu chứng minh chức năng liên quan đến hấp thu và vận chuyển lần lƣợt sắt và kẽm. Đối tƣợng nghiên cứu đƣợc chọn bao gồm gen tiềm năng OsNramp2. OsNramp2 bƣớc đầu đã đƣợc nhóm nghiên cứu chứng minh có chức năng liên quan đến hấp thu và vận chuyển sắt. Việc triển khai các nghiên cứu bổ sung để củng cố chức năng 1 nói trên của gen OsNramp2 trên các giống lúa chủ lực tại Việt Nam là cấp thiết và có nghĩa quan trọng đối với mục tiêu cải tạo di truyền cho cây lúa, tạo giống lúa có hàm lƣợng cao vi chất dinh dƣỡng.
Trên thế giới, việc nghiên cứu cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học đã đƣợc phát triển mạnh mẽ nhờ vào các kỹ thuật tiên tiến trên cơ sở phát huy và ứng dụng các nghiên cứu cơ bản. Từ các thực tế trên, chúng tôi sẽ tiến hành đề tài “Phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsRMAMP2 liên quan tới quá trình tích lũy kim loại ở lúa” để phục vụ cho nghiên cứu chức năng của gen OsRMAMP2, từ đó hƣớng tới mục tiêu cải tiến chất lƣợng cho các giống lúa trong sản xuất bằng công nghệ gen trong tƣơng lai. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU VÀ Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Mục đích Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm phân lập và thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện tăng cƣờng OsNRAMP2 của giống lúa TBR225 để phục vụ nghiên cứu chức năng của OsNRAMP2.2 Yêu cầu Đề tài gồm các yêu cầu chính nhƣ sau: - Phân lập gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam - Nhân dòng và giải trình tự gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam - Thiết kế cấu trúc T-DNA biểu hiện gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại ở giống lúa chủ lực TBR225 Việt Nam 2.3 Ý nghĩa của đề tài - Xác định đƣợc đặc điểm trình tự OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại của giống lúa chủ lực TBR225. 2 - Thiết kế đƣợc vector biểu hiện cấu trúc biểu hiện gen OsNRAMP2 liên quan đến quá trình tích lũy kim loại để phục vụ nghiên cứu chức năng gen và công tác chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. DINH DƢỠNG VI CHẤT Ở LÚA GẠO 1.1 Một số vi chất quan trọng ở lúa gạo và các gen liên quan Gạo chiếm một phần quan trọng trong chế độ ăn uống hàng ngày, đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển ở Châu Á, cung cấp 50–80% lƣợng calo hàng ngày, protein, khoáng chất và vitamin, v. Sản lƣợng gạo toàn cầu hàng năm là 700 triệu tấn đƣợc sản xuất trên diện tích 158 triệu ha vào năm 2017. Tuy nhiên, sản lƣợng lúa phải tăng thêm 8-10 triệu tấn mỗi năm và có động lực mạnh mẽ để nâng cao giá trị dinh dƣỡng với nhiều vitamin và khoáng chất cần thiết đáp ứng nhu cầu lƣơng thực và dinh dƣỡng của dân số.
Các vi chất dinh dƣỡng không chỉ cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng mà còn không thể thiếu đối với sức khỏe con ngƣời và động vật. Các chất vi lƣợng nhƣ Fe và Zn rất cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng của cả thực vật và động vật. Thiếu Fe dẫn đến thiếu máu và cũng đƣợc báo cáo là có hậu quả bệnh l. Thiếu Zn gây chậm lớn, thiểu năng sinh dục, rối loạn chức năng miễn dịch và suy giảm nhận thức.
Thiếu Fe và Zn là một trong những tình trạng thiếu vi chất dinh dƣỡng phổ biến nhất ở ngƣời, ảnh hƣởng đến hai tỷ ngƣời và gây ra hơn 0,8 triệu ca tử vong hàng năm (Bashir et al. Lƣợng Fe và Zn đƣợc khuyến nghị cho con ngƣời là 15 mg mỗi ngày. Tuy nhiên, điều này hiếm khi đƣợc đáp ứng bởi chế độ ăn dựa trên gạo đƣợc tiêu thụ ở ngƣời dân Châu Á. Gạo đánh bóng chứa trung bình chỉ có 2 mg Fe/kg gạo và 12 mg Zn/kg gạo, trong khi lƣợng Fe đƣợc khuyến nghị trong chế độ ăn uống cho ngƣời là 10–15 mg; trẻ sơ sinh, trẻ em và thanh thiếu niên cần nhiều Fe hơn vì chúng đang phát triển nhanh chóng; phụ nữ mang thai cần đủ Fe cho bản thân và thai nhi đang lớn, và đây là đặc biệt đúng vào cuối thai kỳ khi em bé đang phát triển nhanh chóng nhất; và những phụ nữ hành kinh cần nhiều Fe hơn do mất máu.
Zn đóng vai trò là đồng yếu tố của hơn 300 enzym tham gia vào quá trình chuyển 4 hóa carbohydrate, lipid, protein và axit nucleic, do đó tầm quan trọng của nó đối với sự tăng trƣởng và phát triển bình thƣờng của động thực vật.2 Ảnh hƣởng của hàm lƣợng vi chất đến chất lƣợng lúa gạo Fe, Zn và Mn là những vi chất rất cần thiết cho cây trồng. Fe tham gia vào các sự kiện tế bào khác nhau nhƣ hô hấp, sinh tổng hợp diệp lục và vận chuyển điện tử quang hợp. Hàm lƣợng diệp lục thấp (úa) của lá non là triệu chứng dễ thấy nhất của thiếu Fe (Marschner, 1995). Thiếu Fe dƣờng nhƣ cũng gây ra stress oxy hóa (Tewari et al., 2005; Bashir et al.
Fe cần thiết cho chức năng của lục lạp và ti thể. Fe đƣợc vận chuyển đến ti thể thông qua chất vận chuyển Fe trong ti thể (Bashir et al. Fe bổ sung có thể đƣợc chuyển hƣớng sang không bào (Kim et al., 2006; Zhang et al. Ở lúa, chất vận chuyển Fe trong không bào 1 (OsVIT1) và OsVIT2 đƣợc cho là đóng một vai trò quan trọng trong chất vận chuyển Fe dƣới tế bào (Zhang et al.
Zn đóng các vai trò đa dạng trong các quá trình tế bào khác nhau (Ishimaru et al. Sự chuyển hóa protein, axit nucleic, carbohydrate và lipid phụ thuộc rất nhiều vào Zn (Rhodes and Klug, 1993; Vallee and Falchuk, 1993). Sự hấp thụ Zn phải chặt chẽ đƣợc điều chỉnh để đảm bảo rằng lƣợng Zn chính xác luôn có mặt tại mọi thời điểm (Ishimaru et al. Ở thực vật, sự thiếu hụt Zn dẫn đến sự tích tụ tinh bột và các RNase không hoạt động, cho thấy rằng sự phân hủy RNA có thể đƣợc điều chỉnh bởi sự sẵn có của Zn trong tế bào (Suzuki et al.
Mn đóng vai trò là đồng yếu tố hoặc chất hoạt hóa của các enzym với các nhóm chức năng khác nhau và hoạt động đa dạng. Cây trồng thiếu Mn dễ bị stress nhiệt độ thấp và nhiễm mầm bệnh, dẫn đến năng suất cây trồng giảm đáng kể (Marschner, 1995; Hebbern và cộng sự, 2005). Sự vận chuyển Mn đƣợc cho là có chung một con đƣờng xâm nhập với Fe và cadimi (Cd). Sự vận chuyển Fe, Zn và Mn chồng chéo lên nhau trong hệ thống sinh học của thực vật, sự thiếu hụt Fe, Zn và Mn đặc biệt nghiêm trọng khi cây trồng trong đất kiềm.
Vì đất kiềm chiếm khoảng 30% 5 đất canh tác trên thế giới, sự phát triển của các loài thực vật có thể sinh trƣởng trong những loại đất này có thể mang lại lợi ích to lớn cho nông nghiệp. Hơn nữa, thực vật tích lũy nhiều vi chất dinh dƣỡng hơn (ví dụ, Fe, Zn và Mn) sẽ góp phần đáng kể vào việc chống lại sự thiếu hụt vi chất dinh dƣỡng ở ngƣời.3 Nghiên cứu cải thiện hàm lƣợng vi chất ở lúa gạo Chất lƣợng lúa gạo không phải lúc nào cũng dễ xác định vì nó phụ thuộc vào ngƣời tiêu dùng và mục đích sử dụng của lúa gạo. Gần đây, nhu cầu của ngƣời tiêu dùng về gạo chất lƣợng tốt hơn đã tăng lên, các nƣớc xuất khẩu đang cố gắng trở thành nhà xuất khẩu gạo lớn và do đó có nhiều áp lực đối với các nhà sản xuất và chế biến để sản xuất ra gạo chất lƣợng tốt hơn. Hàm lƣợng vi chất dinh dƣỡng trong gạo cũng đã đƣợc quan tâm nhiều hơn (Rice knowledge Bank, 2021).
Từ khoảng 20 năm trƣớc, để cải thiện giá trị dinh dƣỡng ở lúa gạo, các nhà nghiên cứu đã sử dụng tới các biện pháp canh tác, phƣơng pháp chọn giống lai truyền thống. Hiện nay phƣơng pháp chủ yếu là sử dụng kỹ thuật di truyền và hiện đại nhất là kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen. Một số định hƣớng nghiên cứu đang bắt đầu đƣợc triển khai tại Trung tâm nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) bao gồm: tạo dòng lúa chứa Fe, Zn, beta-carotene; lúa chuyển gen có hàm lƣợng cao, lúa không chuyển gen có hàm lƣợng Fe cao. Tăng cƣờng sinh học cho cây trồng thông qua chăn nuôi cũng là một chiến lƣợc bền vững và hiệu quả để giải quyết tình trạng suy dinh dƣỡng vi chất dinh dƣỡng cho ngƣời dân sống ở các nƣớc đang phát triển không đủ khả năng mua thực phẩm tăng cƣờng Fe và Zn, bằng cách bổ sung vi chất Fe và Zn vào khẩu phần ăn chủ yếu của họ (Kumari et al.