Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng trong băng gạc cầm máu

• Tác giả: Lê Thị Vui
• Người hướng dẫn: TS. Lê Minh Trí
• Trường học: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Hà Nội

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. CƠ CHẾ CẦM MÁU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP CẦM MÁU
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: Quy trình công nghệ gắn thrombin lên băng gạc bằng các phương pháp khác nhau (phun, tẩm)
• PHỤ LỤC 2: Một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu trên thỏ bằng băng gạc tẩm thrombin

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Tách Chiết Thrombin Từ Phổi Bò

Mỗi năm, số người tử vong do không được cầm máu kịp thời do tổn thương mạch máu ngày càng gia tăng. Các nguyên nhân chủ yếu đến từ tác động bên ngoài như tai nạn, sinh hoạt hàng ngày, hoặc do các mô chết, tổn thương bên trong cơ thể khiến yếu tố đông máu không đủ để duy trì cầm máu. Việc sơ cứu cầm máu nhanh chóng, đơn giản và hiệu quả là vô cùng quan trọng. Thrombin đóng vai trò then chốt trong sinh lý đông máu, chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo mạng lưới fibrin giúp hình thành cục máu đông, ngăn chặn chảy máu. Vì những tiềm năng to lớn này, nghiên cứu tách chiết thrombin từ phổi bò để tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương có ý nghĩa cấp thiết.

1.1. Giới thiệu về Thrombin và Ứng dụng Cầm Máu

Thrombin là một enzyme serine protease đóng vai trò trung tâm trong quá trình đông máu. Nó chuyển đổi fibrinogen hòa tan thành fibrin không hòa tan, tạo thành mạng lưới giúp hình thành cục máu đông. Ứng dụng thrombin trong y học bao gồm sử dụng trực tiếp để cầm máu trong phẫu thuật, điều trị vết thương và sản xuất vật liệu cầm máu, đặc biệt là băng gạc cầm máu. Thrombin có thể được tách chiết từ nhiều nguồn khác nhau.

1.2. Tại sao Nghiên Cứu Tách Chiết Thrombin Từ Phổi Bò

Phổi bò là một nguồn cung cấp thrombin tiềm năng, đặc biệt là khi số lượng gia súc được giết mổ hàng ngày lớn. Việc sử dụng phổi bò làm nguồn thrombin có thể giúp giảm chi phí sản xuất so với việc sử dụng thrombin tái tổ hợp hoặc các nguồn khác. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò, đánh giá chất lượng thrombin thu được và phát triển băng gạc cầm máu hiệu quả, an toàn.

II. Thách Thức Trong Tách Chiết Thrombin Hiệu Quả Từ Phổi Bò

Việc tách chiết thrombin từ phổi bò đối mặt với nhiều thách thức. Hàm lượng thrombin trong phổi bò không cao, đòi hỏi quy trình chiết xuất phải hiệu quả để thu được lượng thrombin đủ lớn. Quy trình tách chiết cần đảm bảo loại bỏ các tạp chất, protein khác để thu được thrombin tinh khiết. Đồng thời, hoạt tính thrombin dễ bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, và sự hiện diện của các chất ức chế, đòi hỏi quy trình chiết xuất phải nhẹ nhàng, bảo vệ đặc tính của thrombin.

2.1. Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Hoạt Tính Thrombin

Hoạt tính thrombin rất nhạy cảm với các yếu tố môi trường. Nhiệt độ cao có thể làm biến tính protein và giảm hoạt tính. pH quá acid hoặc quá kiềm cũng có thể ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của enzyme. Các chất ức chế protease tự nhiên có trong phổi bò có thể cạnh tranh với fibrinogen và làm giảm khả năng cầm máu của thrombin. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố này là rất quan trọng trong quá trình tách chiết.

2.2. Vấn Đề Về Độ Tinh Khiết Và Ổn Định Của Thrombin

Để thrombin có thể ứng dụng hiệu quả trong sản xuất băng gạc cầm máu, độ tinh khiết và độ ổn định là rất quan trọng. Các tạp chất protein có thể gây ra phản ứng miễn dịch hoặc làm giảm hiệu quả cầm máu. Thrombin cũng dễ bị mất hoạt tính trong quá trình bảo quản, đặc biệt ở điều kiện nhiệt độ thường. Do đó, cần có các biện pháp để tinh chế thrombin và bổ sung các chất ổn định để bảo quản thrombin đông khô.

2.3. Tiềm năng về giá thành và thị trường của thrombin phổi bò

Thrombin phổi bò có tiềm năng về giá thành thấp hơn so với thrombin tái tổ hợp, điều này có thể làm cho nó trở thành một lựa chọn hấp dẫn cho các ứng dụng y tế. Tuy nhiên, cần phải xem xét các yếu tố như chi phí tách chiết, tinh chế và bảo quản để đánh giá tính khả thi về mặt kinh tế. Thị trường thrombin đang phát triển và có nhu cầu ngày càng tăng về các sản phẩm cầm máu hiệu quả và an toàn.

III. Phương Pháp Tối Ưu Tách Chiết Thrombin từ Phổi Bò Hiệu Quả Nhất

Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa phương pháp tách chiết thrombin từ phổi bò. Các yếu tố như nồng độ ethanol, aceton, nhiệt độ, pH và thời gian ngâm tách mẫu được khảo sát để tìm ra điều kiện chiết xuất tốt nhất. Việc sử dụng các chất an định như Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS và PEG 4000 cũng được nghiên cứu để tăng độ bền của thrombin trong điều kiện bảo quản thông thường. Mục tiêu là xây dựng quy trình tách chiết thrombin đơn giản, hiệu quả, và có thể áp dụng rộng rãi.

3.1. Tối Ưu Hóa Nồng Độ Ethanol và Aceton Trong Tách Chiết

Ethanol và aceton thường được sử dụng làm dung môi trong công nghệ tách chiết protein. Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol và aceton khác nhau đến hoạt tính và độ tinh khiết của thrombin thu được. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol và aceton tối ưu có thể giúp kết tủa chọn lọc thrombin, loại bỏ các tạp chất protein khác. Bảng 3.1 và 3.2 trong luận văn gốc trình bày chi tiết ảnh hưởng của nồng độ ethanol và aceton đến hoạt tính thrombin.

3.2. Ảnh Hưởng của Nhiệt Độ và pH Đến Quá Trình Tách Chiết

Nhiệt độ và pH có ảnh hưởng lớn đến đặc tính của thrombin. Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH khác nhau đến quá trình tách chiết thrombin. Kết quả cho thấy nhiệt độ quá cao có thể làm giảm hoạt tính thrombin, trong khi pH tối ưu có thể giúp duy trì cấu trúc và chức năng của enzyme. Bảng 3.3 và 3.4 trong luận văn gốc trình bày chi tiết ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính thrombin.

3.3. Tối Ưu Hóa Thời Gian Ngâm Tách Mẫu Để Thu Thrombin

Thời gian ngâm tách mẫu ảnh hưởng đến hiệu quả thu hồi thrombin. Nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm tách mẫu khác nhau đến lượng thrombin thu được. Kết quả cho thấy thời gian ngâm tách mẫu tối ưu có thể giúp giải phóng tối đa thrombin từ phổi bò, mà không làm giảm hoạt tính của enzyme. Bảng 3.5 trong luận văn gốc trình bày chi tiết ảnh hưởng của thời gian ngâm tách mẫu đến hoạt tính thrombin.

IV. Nghiên Cứu Chất An Định Thrombin và Đánh Giá Hiệu Quả

Để đảm bảo thrombin giữ được hoạt tính trong quá trình bảo quản và sử dụng, nghiên cứu tập trung vào việc bổ sung các chất an định. Các chất như Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS và PEG 4000 được thử nghiệm để đánh giá khả năng bảo vệ thrombin khỏi sự biến tính. Ảnh hưởng của các chất an định đến khả năng chuyển hóa fibrinogen của thrombin cũng được đánh giá để đảm bảo hiệu quả cầm máu của thrombin sau khi bảo quản.

4.1. Đánh Giá Ảnh Hưởng của Tween và Triton Đến Thrombin

Tween 20, Tween 80 và Triton X-100 là các chất hoạt động bề mặt không ion thường được sử dụng để ổn định protein. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của các chất này đến hoạt tính và độ ổn định của thrombin. Kết quả cho thấy Tween và Triton có thể giúp bảo vệ thrombin khỏi sự biến tính, đặc biệt là khi có mặt tannic acid. Hình 3.9, 3.10, 3.11 trong luận văn gốc trình bày chi tiết ảnh hưởng của Tween và Triton đến thrombin.

4.2. Ảnh Hưởng của SDS và PEG 4000 Đến Hoạt Tính Thrombin

SDS là một chất hoạt động bề mặt ion, trong khi PEG 4000 là một polymer không ion. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của SDS và PEG 4000 đến hoạt tính và độ ổn định của thrombin. Kết quả cho thấy SDS có thể làm giảm hoạt tính thrombin, trong khi PEG 4000 có thể có tác dụng bảo vệ. Hình 3.12 và 3.13 trong luận văn gốc trình bày chi tiết ảnh hưởng của SDS và PEG 4000 đến thrombin.

V. Ứng Dụng Thrombin Phổi Bò Sản Xuất Băng Gạc Cầm Máu Nhanh

Mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu là sản xuất băng gạc cầm máu sử dụng thrombin tách chiết từ phổi bò. Quy trình gắn thrombin lên vật liệu nền cho băng gạc (ví dụ như gạc cotton) được phát triển, sử dụng các phương pháp như phun hoặc tẩm. Đánh giá hiệu quả cầm máu của băng gạc được thực hiện trên mô hình động vật (ví dụ như thỏ) để xác định khả năng cầm máu nhanh và an toàn của sản phẩm.

5.1. Quy Trình Gắn Thrombin Lên Băng Gạc Cầm Máu

Để tạo ra băng gạc cầm máu, thrombin cần được gắn lên vật liệu nền. Các phương pháp như phun hoặc tẩm được sử dụng để phân phối thrombin đều lên bề mặt băng gạc. Nồng độ thrombin trên băng gạc cần được kiểm soát để đảm bảo hiệu quả cầm máu tối ưu. Phụ lục 1 trong luận văn gốc trình bày chi tiết quy trình công nghệ gắn thrombin lên băng gạc.

5.2. Đánh Giá Hiệu Quả Cầm Máu Trên Mô Hình Động Vật

Hiệu quả cầm máu của băng gạc được đánh giá trên mô hình động vật, thường là thỏ. Thời gian cầm máu, lượng máu mất và khả năng liền vết thương được theo dõi để đánh giá hiệu quả của băng gạc. Khả năng tương thích sinh học của băng gạc cầm máu cũng cần được đánh giá để đảm bảo an toàn khi sử dụng. Phụ lục 2 trong luận văn gốc trình bày một số hình ảnh thử nghiệm cầm máu trên thỏ bằng băng gạc tẩm thrombin.

VI. Kết Luận và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Thrombin Phổi Bò

Nghiên cứu đã thành công trong việc tối ưu hóa quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò và phát triển băng gạc cầm máu có tiềm năng. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để cải thiện độ tinh khiết, độ ổn định và khả năng tương thích sinh học của thrombin và băng gạc. Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn của băng gạc cầm máu trên người.

6.1. Nghiên Cứu Tiền Lâm Sàng và Lâm Sàng Thrombin

Để đưa băng gạc cầm máu từ thrombin vào sử dụng rộng rãi, cần có các nghiên cứu tiền lâm sàng và nghiên cứu lâm sàng để đánh giá hiệu quả và an toàn trên người. Nghiên cứu tiền lâm sàng tập trung vào việc đánh giá độ an toàn của thrombin và băng gạc trên các mô hình tế bào và động vật. Nghiên cứu lâm sàng tập trung vào việc đánh giá hiệu quả cầm máu và khả năng liền vết thương của băng gạc trên bệnh nhân.

6.2. Hướng Phát Triển Thrombin Tái Tổ Hợp

Mặc dù thrombin phổi bò có tiềm năng về giá thành, thrombin tái tổ hợp có thể có độ tinh khiết và độ ổn định cao hơn. Nghiên cứu trong tương lai có thể tập trung vào việc so sánh thrombin phổi bò và thrombin tái tổ hợp về hiệu quả và an toàn. Việc phát triển công nghệ sản xuất thrombin tái tổ hợp giá rẻ có thể giúp tăng khả năng tiếp cận với vật liệu cầm máu hiệu quả cho bệnh nhân.

Tổng quan nghiên cứu

Theo ước tính, mỗi năm trên thế giới có hàng triệu người tử vong do không được cầm máu kịp thời khi bị tổn thương mạch máu. Tại Việt Nam, khảo sát tại Bệnh viện Việt Đức Hà Nội trên hơn 324.000 bệnh án từ năm 1990 đến 2002 cho thấy tỷ lệ bệnh nhân được sơ cấp cứu rất thấp, chỉ khoảng 5-10%, trong đó chỉ 50% trường hợp sơ cứu thành công. Các phương pháp cầm máu hiện nay chủ yếu dựa vào kỹ thuật vật lý như băng ép, băng chèn, đặt garo, đòi hỏi dụng cụ phù hợp và kỹ năng chuyên môn cao, trong khi đa số người dân chưa được trang bị kỹ năng này. Do đó, nhu cầu cấp thiết là phát triển phương pháp cầm máu nhanh, đơn giản và hiệu quả.

Thrombin là một enzyme quan trọng trong quá trình đông máu, có khả năng chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo thành mạng lưới fibrin giúp ngăn chặn chảy máu. Luận văn tập trung nghiên cứu quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò, nhằm ứng dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu phổi bò thu thập từ vùng Đông Anh và Vĩnh Phúc, trong điều kiện bảo quản và xử lý nghiêm ngặt. Mục tiêu chính là tối ưu hóa quy trình tách chiết, tinh sạch thrombin và đánh giá ảnh hưởng của các chất an định lên hoạt tính thrombin, góp phần phát triển sản phẩm y sinh có hiệu quả cầm máu cao, an toàn và dễ sử dụng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học thực nghiệm về cơ chế đông máu và hoạt động của thrombin:

• Cơ chế đông máu: Quá trình đông máu gồm 4 giai đoạn chính: co mạch tại chỗ, tạo nút tiểu cầu, tạo cục máu đông và co cục máu đông. Đông máu được khởi động qua hai con đường nội sinh và ngoại sinh, dẫn đến sự hình thành phức hợp prothrombinase, chuyển prothrombin thành thrombin.
• Chức năng thrombin: Thrombin là enzyme serine proteinase, chuyển fibrinogen thành fibrin, kích hoạt các yếu tố đông máu khác và thúc đẩy kết tập tiểu cầu. Thrombin tồn tại ở dạng α, β, γ, trong đó α-thrombin có hoạt tính mạnh nhất.
• Ảnh hưởng của các yếu tố lên thrombin: Ion Ca2+, tiểu cầu và các yếu tố đông máu kích thích hoạt động thrombin; ngược lại, antithrombin III, heparin và các protein ức chế khác kìm hãm hoạt động thrombin.
• Ứng dụng thrombin: Trong y học, thrombin được sử dụng để cầm máu trong phẫu thuật và sản xuất băng gạc cầm máu nhanh; trong công nghiệp thực phẩm, thrombin dùng làm chất liên kết thịt.

Các khái niệm chính bao gồm: prothrombin, fibrinogen, fibrin, prothrombinase, các yếu tố đông máu (yếu tố II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII), và các chất an định protein.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu phổi bò được thu thập từ các lò mổ tại vùng Đông Anh và Vĩnh Phúc, xử lý bằng rửa nước cất, nước muối NaCl 0,05 M, bảo quản ở -20°C.
• Phương pháp tách chiết thrombin: Mẫu phổi được nghiền đồng thể, ngâm trong dung dịch NaCl 0,05 M, ly tâm thu dịch chiết. Thrombin được tủa bằng ethanol hoặc acetone ở các nồng độ khác nhau (20%-60%), sau đó hòa tan và bổ sung CaCl2 0,6 M để kích hoạt chuyển hóa prothrombin thành thrombin.
• Tinh sạch thrombin: Sử dụng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose và sắc ký ái lực Ni2+-NTA để tinh sạch thrombin. Đánh giá độ tinh sạch bằng điện di SDS-PAGE 12,5%.
• Đánh giá hoạt tính thrombin: Xác định thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin trong phản ứng với thrombin tách chiết, so sánh thời gian đông của các mẫu.
• Tối ưu hóa quy trình: Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như nồng độ ethanol, acetone, nhiệt độ (4°C, 37°C, 45°C, 60°C), pH (4,5-8,5), thời gian ngâm mẫu (12-72 giờ) đến hoạt tính thrombin.
• Nghiên cứu chất an định: Đánh giá ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt (Tween 20, Tween 80, Triton X-100, PEG 4000, SDS) với các nồng độ khác nhau lên hoạt tính thrombin tinh sạch, cả trong mẫu có bổ sung acid tannic 0,05%.
• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và xử lý ban đầu trong 1 tháng; tách chiết và tối ưu hóa quy trình trong 3 tháng; tinh sạch và đánh giá hoạt tính trong 2 tháng; nghiên cứu chất an định trong 1 tháng; tổng hợp và báo cáo kết quả trong 1 tháng.

Cỡ mẫu gồm 15 mẫu phổi bò từ các vùng khác nhau, chọn mẫu ngẫu nhiên nhằm đảm bảo tính đại diện. Phân tích dữ liệu sử dụng phương pháp định tính và định lượng, kết hợp điện di SDS-PAGE và đo thời gian đông fibrinogen.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Khảo sát hoạt tính thrombin trong mẫu phổi bò: Tất cả 15 mẫu phổi bò thu thập đều chứa prothrombin với khối lượng phân tử khoảng 72 kDa. Thrombin chuyển hóa fibrinogen thành fibrin với thời gian đông trung bình khoảng 25 phút, nhanh hơn so với thrombin tách từ máu bò (40 phút). Điều này cho thấy phổi bò là nguồn nguyên liệu an toàn và hiệu quả để tách thrombin.

2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong tách chiết: Thrombin tách chiết với ethanol nồng độ 20% có hoạt tính chuyển hóa fibrinogen tốt nhất, thời gian đông chỉ khoảng 15 phút. Khi tăng nồng độ ethanol lên 30%-60%, thời gian đông kéo dài từ 45 đến 60 phút, hoạt tính giảm rõ rệt. Điện di SDS-PAGE cho thấy protein tách ở 20% ethanol có băng rõ ràng và ít tạp chất hơn.

3. Ảnh hưởng của nồng độ acetone: Thrombin tách với acetone nồng độ 50% có hoạt tính tốt nhất, tương đương với ethanol 20%. Nồng độ acetone thấp hơn hoặc cao hơn làm giảm độ tinh sạch và hoạt tính thrombin. Điện di SDS-PAGE xác nhận sự tinh sạch protein prothrombin đạt khoảng 72 kDa với các băng phụ giảm đáng kể sau tinh sạch.

4. Tối ưu hóa các điều kiện vật lý: Nhiệt độ tách chiết 4°C và thời gian ngâm mẫu 24 giờ được xác định là điều kiện tối ưu, giữ được hoạt tính thrombin cao nhất. pH tối ưu trong khoảng 6,5-7,5, phù hợp với môi trường sinh lý, giúp duy trì cấu trúc và hoạt tính enzyme.

5. Ảnh hưởng của các chất an định: Các chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80, Triton X-100, PEG 4000 và SDS có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính thrombin. Tween 20 và PEG 4000 giữ được hoạt tính thrombin cao sau 24 giờ ủ ở 30°C, trong khi SDS làm giảm hoạt tính mạnh. Bổ sung acid tannic 0,05% giúp ổn định cấu trúc thrombin, giảm tác động tiêu cực của các chất hoạt động bề mặt.

Thảo luận kết quả

Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu trước đây về tách chiết thrombin từ các nguồn động vật khác như huyết tương người và nọc rắn. Việc sử dụng phổi bò làm nguyên liệu giúp giảm nguy cơ lây nhiễm so với máu bò, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có tại các lò mổ. Nồng độ ethanol 20% và acetone 50% được xác định là điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết, tương tự như các nghiên cứu sử dụng ethanol 10-20% để loại bỏ fibrinogen và tách prothrombin.

Điện di SDS-PAGE cho thấy độ tinh sạch thrombin đạt mức cao sau các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực, đảm bảo chất lượng enzyme cho ứng dụng y sinh. Thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin trung bình 15-25 phút cho thấy thrombin tách chiết có hoạt tính đủ mạnh để ứng dụng làm băng gạc cầm máu nhanh.

Nghiên cứu về các chất an định cho thấy acid tannic có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cấu trúc và hoạt tính thrombin trong môi trường thường, mở ra hướng phát triển sản phẩm băng gạc có độ bền cao. Các chất hoạt động bề mặt cần được lựa chọn kỹ để không làm mất hoạt tính enzyme.

Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ thời gian đông fibrinogen theo nồng độ ethanol và acetone, bảng so sánh hoạt tính thrombin dưới các điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian ngâm mẫu, cùng hình ảnh điện di SDS-PAGE minh họa độ tinh sạch protein.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình tách chiết thrombin chuẩn hóa: Áp dụng nồng độ ethanol 20% hoặc acetone 50%, nhiệt độ 4°C, thời gian ngâm 24 giờ để tối ưu hóa hoạt tính thrombin. Mục tiêu đạt hoạt tính chuyển hóa fibrinogen trong vòng 15 phút. Chủ thể thực hiện: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, trong 6 tháng.

2. Sử dụng acid tannic làm chất an định trong sản phẩm băng gạc: Bổ sung 0,05% acid tannic để tăng độ bền hoạt tính thrombin trong điều kiện bảo quản và sử dụng thực tế. Chủ thể thực hiện: Phòng Công nghệ Enzyme, trong 3 tháng.

3. Nghiên cứu mở rộng về các chất hoạt động bề mặt an toàn: Lựa chọn và thử nghiệm các chất hoạt động bề mặt như Tween 20, PEG 4000 để duy trì hoạt tính thrombin trong sản phẩm cuối cùng. Chủ thể thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học, trong 4 tháng.

4. Ứng dụng sản xuất băng gạc cầm máu nhanh từ thrombin tách chiết: Thiết kế quy trình gắn thrombin lên băng gạc bằng phương pháp phun hoặc tẩm, thử nghiệm hiệu quả cầm máu trên mô hình động vật. Chủ thể thực hiện: Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong 12 tháng.

5. Đào tạo và chuyển giao công nghệ: Tổ chức các khóa đào tạo kỹ thuật tách chiết và ứng dụng thrombin cho các đơn vị y tế và sản xuất dược phẩm. Chủ thể thực hiện: Đại học Thái Nguyên, trong 6 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu và sinh viên ngành Sinh học thực nghiệm: Nắm bắt quy trình tách chiết enzyme từ mô động vật, kỹ thuật tinh sạch protein và đánh giá hoạt tính enzyme trong nghiên cứu sinh học phân tử.

2. Chuyên gia công nghệ sinh học và dược phẩm: Áp dụng kết quả nghiên cứu để phát triển sản phẩm băng gạc cầm máu nhanh, cải tiến quy trình sản xuất enzyme y sinh.

3. Bác sĩ và nhân viên y tế trong lĩnh vực cấp cứu và phẫu thuật: Hiểu rõ cơ chế hoạt động của thrombin và ứng dụng trong cầm máu, nâng cao hiệu quả sơ cứu và điều trị vết thương.

4. Doanh nghiệp sản xuất vật tư y tế: Tham khảo quy trình công nghệ tách chiết và tinh sạch thrombin để sản xuất băng gạc cầm máu có chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường.

Câu hỏi thường gặp

1. Thrombin là gì và vai trò của nó trong đông máu?
   Thrombin là enzyme chuyển fibrinogen thành fibrin, tạo mạng lưới cục máu đông giúp cầm máu nhanh. Nó cũng kích hoạt các yếu tố đông máu khác và thúc đẩy kết tập tiểu cầu, đóng vai trò trung tâm trong quá trình đông máu.

2. Tại sao chọn phổi bò làm nguồn tách chiết thrombin?
   Phổi bò chứa lượng prothrombin đáng kể, dễ thu thập từ các lò mổ, ít nguy cơ lây nhiễm so với máu bò, và có hoạt tính thrombin cao, phù hợp cho ứng dụng y sinh.

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính thrombin trong quá trình tách chiết?
   Nồng độ dung môi (ethanol, acetone), nhiệt độ, pH, thời gian ngâm mẫu và các chất an định đều ảnh hưởng đến hoạt tính thrombin. Ví dụ, ethanol 20% và acetone 50% giữ hoạt tính tốt nhất, nhiệt độ 4°C và pH 6,5-7,5 là điều kiện tối ưu.

4. Làm thế nào để đánh giá hoạt tính thrombin?
   Hoạt tính thrombin được đánh giá bằng thời gian chuyển hóa fibrinogen thành fibrin trong phản ứng thử nghiệm. Thời gian đông càng ngắn chứng tỏ hoạt tính thrombin càng cao.

5. Ứng dụng thực tế của thrombin tách chiết từ phổi bò là gì?
   Thrombin được sử dụng làm nguyên liệu tạo băng gạc cầm máu nhanh, giúp ngăn chặn chảy máu hiệu quả trong sơ cứu và phẫu thuật, đồng thời có thể ứng dụng trong nghiên cứu và sản xuất dược phẩm.

Kết luận

• Đã thiết lập thành công quy trình tách chiết thrombin từ phổi bò với hoạt tính chuyển hóa fibrinogen cao, thời gian đông trung bình 15-25 phút.
• Nồng độ ethanol 20% và acetone 50% là điều kiện tối ưu cho quá trình tách chiết, giữ được độ tinh sạch và hoạt tính thrombin.
• Acid tannic 0,05% có tác dụng ổn định cấu trúc và hoạt tính thrombin trong môi trường thường.
• Các chất hoạt động bề mặt như Tween 20 và PEG 4000 được khuyến nghị sử dụng để bảo quản thrombin trong sản phẩm.
• Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng công nghệ gắn thrombin lên băng gạc và thử nghiệm hiệu quả cầm máu trên mô hình động vật trong 12 tháng tới.

Hành động tiếp theo: Triển khai sản xuất thử nghiệm băng gạc cầm máu từ thrombin tách chiết, đồng thời mở rộng nghiên cứu về các chất an định và điều kiện bảo quản enzyme. Đề nghị các đơn vị nghiên cứu và doanh nghiệp hợp tác phát triển sản phẩm ứng dụng thực tiễn.