CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ METAGENOMICS 1.1 Các khái niệm cơ bản trong sinh học Cơ thể sinh vật được cấu tạo bởi những đơn vị cơ bản là tế bào, như cơ thể người được cấu tạo bởi ngàn tỉ tế bào. Trẻ sơ sinh có khoảng 2.000 tỉ tế bào, người trưởng thành có khoảng 100.000 tỉ tế bào. Trong khi đó vi khuẩn và các vi sinh vật cơ thể chỉ là một tế bào. Bên trong mỗi tế bào (ngoại trừ hồng huyết cầu trưởng thành) có nhân (nucleus) chứa tất cả các chỉ thị di truyền (genetic instruction).
Những chỉ thị này là chức năng của tế bào. Mỗi tế bào được cấu tạo với một số lượng nhiễm sắc thể nhất định. Mỗi nhiễm sắc thể được cấu tạo bởi một trình tự DNA. DNA chứa các gen mã hóa ribonucleic acid (RNA) mà nó sẽ sinh ra các protein, để từ đó điều chỉnh tất cả quá trình phát triển của một sinh vật.
Một gen là một đoạn của DNA với trình tự base đặc trưng, cụ thể; gọi là mã di truyền hay chỉ thị di truyền để xác định chức năng của tế bào [10]. Trong tế bào có các đại phân tử với kích thước lớn để tạo môi trường cân đối giúp duy trì sự sống đó là: cacbohidrat, lipit, protein và axit nucleic.1 Cacbohidrat Cacbohidrat có công thức phân tử C12H22O11, là nhóm chất hữu cơ thường có khối lượng lớn và là nguyên liệu giải phóng năng lượng dễ dàng nhất (đóng vai trò là nguồn cung cấp năng lượng, phổ biến nhất là glucozo). Cacbohidrat cũng là thành phần xây dựng nên nhiều bộ phận của tế bào; ví dụ, xenlulozo là thành phần cấu trúc nên thành tế bào thực vật. Pentozo là loại đường tham gia cấu tạo DNA, RNA.
Hexozo là nguyên liệu chủ yếu cho hô hấp tế bào tạo năng lượng, cấu tạo nên disaccarit và polisaccarit. Saccarozo là loại đường vận chuyển trong cây. Tinh bột có vai trò là chất dự trữ trong cây, glycogen là chất dự trữ trong cơ thể động vật và nấm… Một số polysaccarit kết hợp với protein có vai trò vận chuyển các chất qua màng sinh chất và góp phần “nhận biết” các vật thể lạ lúc qua màng. Glycogen ở tế 4 bào động vật và tinh bột ở tế bào thực vật đóng vai trò là nguồn dự trữ năng lượng.
Cacbohidrat được chia thành ba loại thường gặp là: Cấu trúc các monosaccarit (đường đơn) Gồm các loại đường có từ 3 – 7 nguyên tử cacbon trong phân tử, trong đó phổ biến và quan trọng nhất là các hexozo (chứa 6C) và pentozo (chứa 5C). Điển hình của các hexozo là glucozo (đường nho), fructozo (đường quả). Các đường đơn này có tính khử mạnh. Cấu trúc các disaccarit (đường đôi) Hai phân tử đường đơn (glucozo, fructozo) có thể liên kết với nhau nhờ liên kết glicozit sau khi đã loại đi 1 phân tử nước tạo thành các đường disaccarit như saccarozo (đường mía), mantozo (đường mạch nha), lactozo (đường sữa).
Các disaccarit này có công thức cấu tạo phân tử khác nhau. Cấu trúc các polysaccarit (đường đa) Nhiều phân tử đường đơn bằng các phản ứng trùng ngưng và loại nước tạo thành các polysaccarit là các phân tử mạch thẳng (như xenlulozo) hay mạch phân nhánh (như tinh bột thực vật hay glycogen động vật). Tinh bột được hình thành do rất nhiều phân tử glucozo liên kết với nhau dưới dạng phân nhánh và không phân nhánh. Glycogen được hình thành do rất nhiều phân tử glucozo liên kết với nhau thành một phân tử có cấu trúc phân nhánh phức tạp.2 Lipit Lipit chiếm khoảng 40% thể trọng.
Lipit là một trong những thành phần cơ bản cấu tạo nên tế bào, đặc biệt là màng tế bào. Tại các mô thần kinh và tuyến nội tiết (nhất là tuyến sinh dục, thượng thận), lipit rất quan trọng và hoạt động sinh hoá rất mạnh. Mô mỡ là nơi tích trữ lipit, cung cấp năng lượng dự trữ để các quá trình chuyển hoá gluxit, lipit, protein, v. được diễn ra.
Lipit có thời gian bán thoái hoá khoảng 5 – 9 ngày. 5 Trong cơ thể có nhiều loại lipit khác nhau song chủ yếu là 3 nhóm: glyxerit, photpholipit, steroit.3 Protein Protein là những chất trùng hợp sinh học thuộc loại các đại phân tử có khối lượng phân tử rất lớn đạt tới hàng nghìn và hàng chục nghìn dalton. Chúng chiếm khối lượng 80% trọng lượng khô của tế bào. Chúng có cấu tạo rất phức tạp và có vai trò quyết định trong cơ thể sống.
Protein là vật liệu xây dựng nên tế bào và mô. Protein là cơ sở phân tử của tất cả hoạt động sống. Các chất xúc tác sinh học – các enzym – đều là protein. Protein đóng vai trò chất chuyên chở (như hemoglobin trong máu), chất bảo vệ và nâng đỡ (như keratin trong da và collagen trong mô liên kết).
Protein đóng vai trò bảo vệ, chống kẻ thù (như kháng thể, interferon). Nhiều hormon quan trọng đều là protein (như insulin v. Protein thể hiện tính đặc thù và tính đa dạng của cơ thể và của mô.4 Axit nucleic Một axit nucleic là một đại phân tử sinh học có phân tử lượng lớn được cấu tạo từ các chuỗi nucleotide nhằm truyền tải thông tin di truyền. Hai loại axit nucleic phổ biến nhất là DNA và RNA.
Axit nucleic có mặt ở hầu hết các tế bào sống và virus. Axit nucleic có thể có dạng mạch đơn hoặc mạch kép. Phân tử axit nucleic mạch kép gồm có hai mạch đơn liên kết với nhau bởi liên kết hidro. RNA thường là mạch đơn, nhưng một số có thể tự xoắn cuộn nhiều vòng tạo thành vùng xoắn kép.
DNA thường là mạch kép, mặc dù một vài virus có hệ gen là DNA mạch đơn. DNA Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép gồm hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn là một chuỗi nucleotide.1: Chuỗi xoắn kép của DNA Mỗi nucleotide gồm ba thành phần: nhóm phosphate, đường deoxyribose và một trong bốn base (A, C, G và T).2: Cấu trúc các nucleic điển hình Hai sợi đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydrogen hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai sợi: A bổ sung cho T và C bổ sung cho G. Mỗi sợi đơn có một trình tự định hướng với một đầu 5’ phosphate tự do, đầu kia là 3’ hydroxyl tự do (quy ước là 5’ 3’).
Hướng của hai sợi đơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau, nên được gọi là hai sợi đối song. RNA Phân tử RNA có cấu tạo tương tự DNA ngoại trừ ba điểm khác biệt sau: Phân tử RNA là chuỗi đơn. Đường pentose của phân tử RNA là ribose thay vì deoxyribose. Thymine (T), một trong bốn loại base hình thành nên phân tử DNA, được thay thế bằng uracil (U) trong phân tử RNA.
Cấu trúc và chức năng của RNA có sự biến đổi rõ rệt. Về cơ bản RNA chỉ là chất mang thông tin di truyền ở virus, sau đó người ta chứng minh rằng nó không những đóng vai trò cơ bản ở việc chuyển thông tin di truyền mà còn có vai trò cấu trúc khi tạo nên phức hệ RNA- protein. Theo một lý thuyết tiến hóa mà đại diện là Eigen, RNA là chất mang thông 8 tin di truyền, thành viên trung gian của sự biểu hiện gen, thành phần cấu tạo và là chất xúc tác. Nhóm OH ở vị trí thứ hai của ribose cần thiết cho đa chức năng làm nhiễu loạn sự tạo thành sợi đôi, qua đó làm tăng độ không bền vững của liên kết phosphodieste.
Trong tế bào có ba loại RNA chính, có các chức năng khác nhau: Các RNA thông tin (mRNA) , RNA vận chuyển (tRNA), RNA ribosome (rRNA) [1].2 Giới thiệu metagenomics Việc giải trình tự theo kiểu truyền thống thường bắt đầu bằng việc nuôi cấy các tế bào giống hệt nhau để làm nguồn phân lập DNA. Các nghiên cứu metagenomic đã cho thấy vẫn còn rất nhiều nhóm vi sinh vật trong tự nhiên mà chúng ta không thể phân lập và nuôi cấy được vì vậy không thể giải trình tự sinh học của chúng được [14]. Nhờ khuếch đại DNA và sự phát triển của công nghệ tính toán mà ta có thể phân tích các đoạn trình tự DNA từ các mẫu môi trường và ứng dụng giải trình tự cho các mẫu metagenomic. Có thể kể đến một số kết quả giải trình tự của vi sinh vật và của hệ gen người, ghép nối các đoạn DNA ngẫu nhiên.
Giải trình tự và sàng lọc thư viện dòng cho biết các gen tồn tại trong mẫu thu thập từ môi trường. Nhờ vậy mà ta sẽ biết được loại sinh vật nào hay quá trình trao đổi chất nào đang diễn ra trong quần xã sinh vật, từ đó có thể hiểu rõ hơn về sinh thái học và so sánh các mẫu thu thập từ các môi trường với nhau. Để có được cái nhìn toàn diện hơn ta cần tìm cách giải trình tự bộ gen của các thành viên khác trong quần xã bằng cách phân tích một lượng mẫu lớn. Với việc giải trình tự sinh học ngẫu nhiên ta có thể phát hiện được các thành viên này ngay chỉ với các đoạn trình tự vô cùng nhỏ bé.
Thuật ngữ “metagenomics” lần đầu tiên được sử dụng bởi Jo Handelsman, Jon Clardy, Robert M. Goodman cùng các tác giả khác và được xuất bản vào năm 1998. Metagenomics là ngành khoa học nghiên cứu về đa hệ gen (metagenome) – nguyên liệu di truyền được thu hồi trực tiếp từ các mẫu môi trường. Metagenome còn được biết đến như là “hệ gen cộng đồng” (community genomics) hay “hệ gen môi trường” (enviromental genomics).
Metagenomics là kĩ thuật cho phép khai thác 9 được tối đa các gen của vi sinh vật không nuôi cấy được trong các quần thể sinh vật. Tùy vào từng loại mẫu môi trường số lượng vi sinh vật không nuôi cấy được dao động từ 99,0 đến 99,7%. Nếu tất cả các gen của vi sinh vật trong mẫu môi trường được tập hợp lại sẽ là nguồn nguyên liệu vô cùng phong phú cho việc khai thác gen, cũng như tìm hiểu cơ chế tác động giữa các vi sinh vật đảm bảo sự ổn định, phát triển chung của hệ sinh thái [2].3: Quá trình giải trình tự metagenomics Hiện nay, các vi sinh vật trên trái đất rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên chúng ta có rất ít thông tin về nó, nguyên nhân chính là do chúng ta không thể nuôi cấy các vi sinh vật này trong phòng thí nghiệm, có dưới 1% của tất cả các loài vi khuẩn được nuôi cấy. Xác định tính đa dạng phân loài sử dụng 16S rRNA và các mẫu gen đa dạng và cây phân loài của vi sinh vật có thể được sử dụng để theo dõi và dự đoán các điều kiện và biến đổi môi trường.
Vì vậy, Metagenomics xác định 10 gen hay operon cho các ứng viên enzyme cần thiết (như cellulases, chitinases, lipases, thuốc kháng sinh, các sản phẩm tự nhiên khác); những enzyme này có thể được ứng dụng trong công nghiệp hoặc dược phẩm.